1、-糜蛋白酶催化合成二吡咯甲烷衍生物 刘联胜，姜国芳，付磊涵，谢宗波 *，乐长高 * （东华理工大学 应用化学系 ， 江西 南昌 330013） 摘要： 以 -糜蛋白酶 为生物催化剂，以 体积分数 40%的 乙醇水溶液为反应介质， 50 下，通过 吡咯与醛的串联 反应，合成 了一系列 二吡咯甲烷衍生物。 该 反应 在 50 时反应 3 h 即可完成，具有较好的 底物适应性 ，且 产率最高可达 69 %， 也无需氮气保护， 进一步拓展了酶的非专一性及 -糜蛋白酶 在有机合成中的应用 。 关键字 ： -糜蛋白酶 ； 二吡咯甲烷 衍生物 ； 生物催化 ； 酶的非专一性 中图分类号： TQ314 文献标
2、识码： A Enzymatic Synthesis of Dipyrromethanes by -Chymotrypsin Liu Liansheng, Jiang Guofang, Fu Leihan, Xie Zongbo*, Le Zhanggao* (Department of Applied Chemistry, East China University of Technology, Nanchang 330013,Jiangxi,China) Abstract: A series of dipyrromethanes was synthesized via the -chymot
3、rypsin-catalyzed tandem reaction between pyrrole and aldehydes in 50 oC, using 40% (vol%) alcohol solution as reaction medium. This reaction could complete within 3 h in 50 oC, and has advantages of broad substrate scope, no protection of nitrogen and the yield can be up to 69%. The results further
4、expand the application of enzymes promiscuity and -chymotrypsin in the organic synthesis. Keywords: -chymotrypsin; dipyrromethanes; biocatalysis; promiscuity 二吡咯甲烷类化合物是合成 杯卟啉 、 杯吡咯 、卟啉及其衍生物，比如灵杆菌素、血红素类、叶绿素类物质的重要前体 1，这些物质可以运用到手性催化剂、手性传感器以及合成受体的设计 中 2。在过去几十年 间 ，大量合成二吡咯甲烷类化合物的方 法被开发出来，比如 :用三氟乙酸 3-5、 Ti
5、Cl46、 三氟甲磺酸盐 7、 I28、 对甲苯磺酸 9、 阳离子交换树脂 10等 为催化剂的方法已被报道。酶作为生物体内大量生化反应的催化剂，其绿色、安全、高效的 特点已得到化学家们的广泛关注，并将酶的非专一性运用到多种有机合成反应中且取得了较好的效果 11,12。 例如 ： C-N 键 13、 C-C 键 14、 C-S 键 15的形成反应。但 鲜见 酶催化合成二吡咯甲烷及其衍生物的报道。 结合本课题组之前的工作 16， 作者 尝试将 -糜蛋白酶用于二吡咯甲烷及其衍生物的催化合成中， 反应 路线如下所示 ： 1 实验部分 1.1 试剂与仪器 吡咯（ 质量分数 99%）， 萨恩化学技术（上海
6、 ） 有限公司 ；醛（ 质量分数 98%）， 梯希爱（上海 ） 化成工业发展有限公司 ；氘代氯仿（ 氘代率 99.8% + 体积分数 0.03% TMS）、-糜蛋白酶（ 800 usp u/mg），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他试剂均为 AR。所有试剂使用前未经任何处理。 WRS-2A 型微机熔点仪，上海仪电物理光学仪器有限公司（使用前温度未经校正，起始温度为 60 ，升温速率为 1 /min）； Bruker AV-400 型核磁共振 波谱 仪，瑞士 Bruker 公司。 1.2 模板反应 在 10 mL 具塞锥形瓶中，加入 0.2684 g（ 4 mmol）吡咯、 0.1511 g（
7、 1 mmol）对硝基苯甲醛、 20 mg -糜蛋白酶和 3 mL 体积分数 40%的乙醇水溶液，于 50恒温摇床（ 270 r/min）中反应 3 h，经柱色谱分离（ 体积比 4:1 的 正己烷 和 乙酸乙酯 ）得 到 目标产物。 2 结果与讨论 2.1 温度对酶促反应 的影响 温度不仅是影响化学反应速率的重要因素，也是影响酶活性的重要因素，因此 ， 优先考察了温度对模板反应的影响 ，结果见 表 1。 随着温度升高反应产率也逐渐升高，当温度为 50时产率取得最大值 61%，之后 ， 再升高温度产率反而降低。因为酶是生物 催化剂，过高的温度会使酶蛋白变性失活，从而影响其催化性能，导致反应产率降
8、低。因此， 选择 50作为最佳反应温度。 表 1 温度对 酶促 反应 的影响 Table 1 Effect of temperature on the enzymatic reaction 温度 / 20 30 40 50 60 产率 /% (b) 30 48 55 61 55 a 反应条件：对硝基苯甲醛 1 mmol，吡咯 4 mmol， 40%乙醇水溶液 3 mL， -糜蛋白酶 20 mg/ mmol 对硝基苯甲醛 ，反应时间 3 h； b 柱色谱 分离产率 。 2.2 催化剂用量对 酶促 反应 的影响 催化剂用量对酶促反应的影响见 表 2。 不加催化剂时，没有产物生成，当 -糜蛋白酶 催
9、化剂 用 量为 5 mg/mmol 时， 产率 为 23%； 随着酶用量的增加产率 不断提高，当 酶 用 量增 至20 mg/mmol 时，产率达到了最大值 61%。因此，最终选择 20 mg/mmol 为最佳酶用量。 表 2 催化剂用量对 酶促 反应 的影响 Table 2 Effect of enzyme loading on the enzymatic reaction 酶量 /mg/mmol 0 5 10 15 20 25 产率 /% None 23 38 53 61 61 反应条件：对硝基苯甲醛 1 mmol，吡咯 4 mmol， 40 %乙醇水溶液 3 mL， -糜蛋白酶 0-25
10、 mg/mmol 对硝基苯甲醛 ，反应温度 50 ，反应时间 3 h； 柱色谱 分离产率。 2.3 二吡咯甲烷衍生物的合成 确定 酶促 反应的最佳条件后，又考察了该 法 底物普适性，选取 一系列取代苯甲醛与吡咯反应，结果如表 3 所示。 由 表 3 可知， -糜蛋白酶能 够 催化多种芳香醛与吡咯反应，生成二吡咯甲烷类化合物 ； 同时苯甲醛的取代基对反应效果影响较大，连有吸电子取代基的苯甲醛反应产率较高（表 3，序号 1-4， 7-9），而苯甲醛连有供电子基团时产率明显较低（表 3，序号 5-6、 10-11），主要是因为吸电子基团降低了醛羰基的电子云密度，有利于反应的进行；而空间效应对反应的影
11、响不太明显。 表 3 二吡咯甲烷衍生物的合成 Table 3 Synthesis of dipyrromethanes 序号 R 产物 产率 （ %） 1 4-NO2, a 61 2 2-NO2 b 55 3 4-Br 58 4 4-F d 48 5 4-OCH3 e 38 6 4-CH3 f 30 7 3-NO2 g 69 8 3-Br h 51 9 2-Br i 54 10 2-CH3 28 11 2-OCH3 k 35 反应条件：醛 1 mmol，吡咯 4 mmol， 40 %乙醇水溶液 3 mL， -糜蛋 白酶 20 mg， 50 反应 3 h； 柱色谱分离产率。 a2： 黄色固体 ，
12、 熔 点 160163 ； 1HNMR(400 MHz, CDCl3)， ： 5.59 (s, 1H, C H), 5.755.93 (m, 2H, H3), 6.066.23 (m, 2H, H4), 6.636.82 (m, 2H, H5), 7.36 (d, J=8.5 Hz, 2H, Ar H), 7.98(s, 2H, N H), 8.16 (d, J=8.5 Hz, 2H, Ar H)。 b10： 黄色液体 , 1H-NMR(400 MHz, CDCl3)， ： 5.85 (s, 1H, C-H), 6.136.19 (m, 4H), 6.706.72 (m, 2H, H5), 7
13、.277.28 (m, 1H, Ar-H), 7.367.39 (m, 1H, Ar-H), 7.497.52 (m, 1H, Ar-H), 7.837.87 (m, 1H, Ar-H), 8.18 (s, 2H, N-H)。 c2： 黄色固体， 熔点 123124 ； 1H-NMR(400 MHz, CDCl3)， ： 5.42 (s, 1H, C-H), 5.89 (s, 2H, H3), 6.17 (dd, J=2.8, 5.9 Hz, 2H, H4), 6.71 (dd, J=2.6, 4.2 Hz, 2H, H5), 7.09 (d, J=8.4 Hz, 2H, Ar-H), 7.4
14、4 (d, J=8.4 Hz, 2H, Ar-H), 7.848.05 (s, 2H, N-H)。 d2： 棕色固体， 熔点 7981 ； 1H-NMR(400 MHz, CDCl3)， ： 5.47 (s, 1H, C-H), 5.89 (s, 2H, H3), 6.15 (d, J=2.8 Hz, 2H, H4), 6.71 (s, 2H, H5), 6.917.07(m, 2H, Ar-H), 7.097.22(m, 2H, Ar-H), 7.86 (s, 2H, N-H)。 e2：黄色固体， 熔点 99101 ； 1H-NMR(400 MHz, CDCl3)， ： 3.79 (s, 3
15、H, O-CH3), 5.43 (s, 1H, C-H), 5.806.03 (m, 2H, H3), 6.17 (dd, J=2.8, 6.0 Hz, 2H, H4), 6.636.74 (m, 2H, 2H5),6.85 (d, J=8.6Hz, 2H, Ar-H), 7.13 (d, J=8.6 Hz, 2H, Ar-H), 7.94 (s, 2H, N-H)。 f2： 黄色固体， 熔点 108110 ； 1H-NMR (400 MHz, CDCl3)， ： 2.33 (s, 3H, CH3), 5.45 (s, 1H, C-H), 5.92 (s, 2H, H3), 6.16 (dd,
16、 J=2.8, 5.9 Hz, 2H, H4), 6.69 (dd, J=2.6, 4.2 Hz, 2H, H5), 7.107.14 (m, 4H, Ar-H), 7.94 (s, 2H, N-H)。 g17： 黄色固体， 熔点 133135 ； 1H-NMR(400 MHz, CDCl3)， ： 5.58 (s, 1H, C-H), 5.815.93 (m, 2H, H3), 6.106.24 (m, 2H, H4), 6.676.83 (m, 2H, H5), 7.47 (t, J=7.9 Hz, 1H, Ar-H), 7.55 (d, J=7.7 Hz, 1H, Ar-H), 8.02
17、 (s, 2H, N-H), 8.11 (t, J=8.1 Hz, 2H, Ar-H)。 h： 黄色固体， 熔点 137139 ； 1H-NMR(400 MHz, CDCl3)， ： 5.44 (s, 1H, C-H), 5.90 (s, 2H, H3), 6.156.17 (m, 2H, H4), 6.706.72 (m, 2H, H5), 7.137.20 (m, 2H, Ar-H), 7.377.40 (m, 2H, Ar-H), 7.95 (s, 2H, N-H)。 i17：棕色固体， 熔点 164165 ； 1H-NMR(400 MHz, CDCl3)， ： 5.89 (t, J=2
18、.6 Hz, 3H), 6.16 (q, J=2.9 Hz, 2H), 6.71 (d, J=1.4 Hz, 2H), 7.09 (q, J=1.4 Hz, 2H, Ar-H), 7.24 (t, J=7.0 Hz, 1H, Ar-H), 7.57 (d, J=7.9 Hz, 1H, Ar-H), 8.00 (s,2H, N-H)。 j18：棕色固体， 熔点 99101 ； 1H-NMR(400 MHz, CDCl3)， ： 2.30 (s, 3H, CH3), 5.37 (s, 1H, C-H), 5.85 (d, 2H, H3), 6.21 (d, J= 2.7 Hz, 2H, H4) 6
19、.69 (d, J=2.6 Hz, 2H, H5), 7.117.19 (m, 4H, Ar-H), 7.81 (s, 2H, N-H)。 k7： 黄色固体， 熔点 113116 ； 1H-NMR(400 MHz, CDCl3)， ： 3.83 (s, 3H, OCH3), 5.78 (s, 1H, C-H), 5.91 (s, 2H, H3), 6.15 (d, J=2.5 Hz, 2H, H4), 6.63 (d, J=1.4 Hz, 2H, H5), 6.946.97 (m, 2H, Ar-H), 7.12 (d, J=6.8 Hz, 1H, Ar-H), 7.28 (t, J=7.8
20、Hz, 1H, Ar-H), 7.97 (s, 2H, N-H)。 2.4 反应机理的推测 -糜蛋白酶 属于肽酶 S1 族的丝氨酸蛋白酶， 含有 245 个氨基酸残基，催化三联体由His-57、 Asp-102 和 Ser-195 组成 19-21。由此 推测 ， -糜蛋白酶催化合成二吡咯甲烷类化合物的可能 机理 ，如图 2 所示。 His-57 先夺取吡咯 C-2 上的质子，使吡咯作为亲核试剂进攻被Ser-195 通过氢键活化了的醛羰基，生成的吡咯醇与另一分子吡 咯以类似的方式结合在一起，生成二吡咯甲烷类化合物。 图 1 可能的酶催化机理 Scheme 1 Proposed mechanis
21、m for -chymotrypsin-catalyzed tandem reaction 3 结论 本文发展了一种生物催化合成二吡咯甲烷衍生物的 方法，并对可能的催化机理进行了推测。该 法用生物催化剂替代了传统的化学催化剂，反应条件较为温和。该研究进一步拓展了生物催化及酶非专一性的应用范围，对推 动酶促反应方法学的发展及其在有机合成中的应用具有积极意义。 参考文献 ： 1 Wu Z, Hu J, Wang K. One-step synthesis of dipyrromethanes in waterJ. Chinese J Org Chem, 2012,32:616-620. 2 Kab
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