1、魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展,报告内容,魏氏梭菌概述魏氏梭菌毒素研究,综述,分型及其依据,魏氏梭菌产生的毒素,四种主要毒素研究进展,纯化及鉴定,细菌毒力,综述,革兰氏阳性有荚膜不运动的厌氧大杆菌，芽孢椭圆形,位于菌体中央或次极端，芽胞直径不大于菌体，在一般培养时不易形成芽胞，在无糖培养基中有利于形成芽胞（菌体形态）广泛分布于自然界，同时也是肠道中的常见菌之一，在一定条件下，可引起各种严重疾病发病急、死亡快，因此对于本病的防制主要用疫苗进行免疫预防危害：猝死症，家禽坏死性肠炎，人食物中毒及气性坏疽 ；家畜肠毒血症、坏死性肠炎，痢疾,培养特性,本菌虽属厌氧性细菌，但对厌氧程度的要求并不太严，2%
2、10%的CO2条件下，生长更好在普通培养基上能生长，若加葡萄糖，血液，则生长更好生长适宜温度为37-47，多认为43-47为最宜温度，在适宜条件下增代时间仅8min,培养特性,血平板：双层溶血环 内环完全溶血-毒素 外环不完全溶血- 毒素蛋黄琼脂平板：Nagler反应庖肉培养基：数小时即可见到生长，产生大量气体，肉渣或肉块变为略带粉色，但不被消化 牛乳培养基：“汹涌发酵”（stormy fermentation）,分型及其依据,根据此菌产生外毒素的种类，可将其分为A、B、C、D和E 5个型 A型菌：B型菌： C型菌：D型菌：E型：,魏氏梭菌与相应疾病,其中，A型菌主要引起人的气性坏疽和食物中毒
3、，也可引起动物的气性坏疽，牛、绵羊、家兔肠毒血症B型菌主要引起羔羊痢疾；C型菌主要是牛、猪肠毒血症、羊猝狙D型菌引起羔羊、绵羊、山羊、牛以及灰鼠的肠毒血症；E型菌可致犊牛、羔羊肠毒血症，但很少发生。,分离诊断,纯化,液体培养基,65-70C半小时,43温箱培养,3-4小时,连续传代,镜检,TSC.石蕊牛奶,血平板,侵袭力：病原菌有突破宿主皮肤、黏膜 生理屏障等 免疫防御机制，进 入体内定居、繁殖和扩散的能 力，包括荚膜、粘附素和侵袭 性物质。 毒素：含有损害宿主组织、器官并引起生理功能紊乱的大分子成分。,毒力,细菌的毒力,荚膜、微荚膜。,黏附素：细菌表面的蛋白质。 菌毛分泌物 细菌的表面组分：
4、如磷壁酸。,2、侵袭性物质：协助病菌抗吞噬或向四周扩散。如致病性葡萄球菌凝固酶、A群链球菌透明质酸酶、链激酶等从而有利于细菌在组织中扩散。,侵袭力,1、菌体的表面结构,细菌在生长繁殖中产生和释放的毒性成分，可直接或间接损伤宿主细胞、组织和器官，干扰其生理功能。外毒素内毒素,（二）毒素,内毒素毒性作用,(A)热源性,(C)内毒素血症和休克,(D)弥漫性血管内凝血（DIC）,(B)白细胞数目改变,疫苗现状,梭菌类的疫苗有单价苗和多联苗，单价疫苗在实际应用中难以取得很好的效果，原因是致病的梭菌种类较多，而且有的是混合感染，单价苗往往是顾此失彼，不能有效地预防疾病。国外相继出现了包括产气荚膜梭菌的四联
5、、五联、七联和八联苗梭菌苗，不仅把梭菌苗联合起来，而且还把所梭菌苗与需氧菌苗(如巴氏杆菌苗、沙门氏杆菌苗)联合起来，甚至与病毒苗(如羊痘疫苗)联合起来进行防疫。,疫苗现状,国内首先出现的是羔羊痢疾，肠毒血症等单价苗，继之出现了羊猝狙、快疫二联苗，羊黑疫、快疫二联苗，快疫、羔羊痢疾、肠毒血症三联苗。文希喆等(1978)研制成功了快疫、羔羊痢疾、碎狙、肠毒血症、黑疫五联苗。纪金春等(1978)研制成功了快疫、羔羊痢疾、猝狙、肠毒血症、黑疫和肉毒中毒六联苗。,疫苗现状,上世纪70年代到80年代，中监所的文希喆、王泰健、屠伟英等科研人员，在国际上率先开创了梭菌多联干粉苗的研究，取得满意效果，保存期长，
6、使用方便，可以随意搭配，疫苗的保护期也得到的延长，基本克服了液体苗的缺陷。效力检验：多联苗所含的成份越多，需要的动物也越多，以致于达到不便检验的程度，严重阻碍了多联苗的发展，采用免疫动物测定血清中和效价的方法，来评价梭菌苗的效力。其方法是用梭菌苗免疫动物两次后，用国际单位(I.U.)衡量血清的中和效价，检验每批疫苗所需试验动物为8-12只。,免疫效果与制苗菌液中毒素毒力正相关抗原含量过大会产生严重局部反应，会导致安全性检验不合格,主要毒素,毒素,各型产气荚膜梭菌均产生毒素,它是产气荚膜梭菌最重要的毒素之一,同时又是A型产气荚膜梭菌的主要毒素是A型产气荚膜梭菌的主要毒素。它具有磷脂酶C(Phos
7、pholipase C,PLC)和鞘磷脂酶(Sphin-gomyelinase)两种酶活性,能水解细胞膜的主要成分膜磷脂,从而破坏细胞膜结构的完整性,理化性质和生物学特性,毒素是由370个氨基酸组成的单链多肽,分子量为43 ku。它是一种依赖于锌离子的多功能性金属酶,具有细胞毒性、溶血活性、致死性、皮肤坏死性、血小板聚集和增加血管渗透性等特性当把毒素加热至6070时,就可以使其失去活性,当进一步加热到100时,又可以恢复部分活性,毒素基因的克隆与表达,毒素基因在禽类和哺乳动物中都是保守的毒素的启动子是最强的启动子之一,可被大肠杆菌的RNA聚合酶所识别,因而毒素在自身启动子下不仅可在产气荚膜梭菌
8、本身中高效表达,也可在大肠杆菌中得到高效表达免疫毒素的C端功能区,来预防产气荚膜梭菌所致气性坏疽的发生 刘家森等克隆了毒素基因序列中从第294个碱基到中止密码子约900 bp的核苷酸序列,并表达出大小约3. 8 ku的重组蛋白。重组蛋白完全涵盖了毒素的羧基末端的蛋白序列并缺失掉了位于氨基末端内对毒素起重要作用的Trp1、His11、Asp56、His68等氨基酸残基;表达的重组蛋白含量占到菌体蛋白总量的30%以上,且表现出良好的反应原性,无毒性现象产生。,毒素,产气荚膜梭菌毒素是由产气荚膜梭菌B型和C型菌株产生的坏死、致死性毒素,可引起人和动物的坏死性肠炎, 。 毒素对胰酶敏感，37作用30m
9、in后即完全失活毒素分为1、2毒素,其中2毒素是近年确认的由C型产气荚膜梭菌产生的一种新的毒素。2毒素与1毒素没有明显的氨基酸序列的同源性,但具有相似的生物学活性。而且,抗2毒素的抗体能识别纯化的2毒素,并能与1毒素发生弱反应,然而,抗1毒素的抗体只能与1毒素反应,却不能与2毒素发生反应,表明二者的免疫学相关性差,但其机制尚不清楚。,1毒素,1毒素是一种强毒素,具有细胞毒性、致死性。纯化的1毒素分子量为34 ku左右,等电点(PI)约为5. 6。,2毒素,1997年Gibert等首先从来自仔猪坏死性肠炎病例的培养上清中分离纯化到这种C型产气荚膜梭菌(CWC245)毒素2毒素与家畜的梭菌性胃肠道
10、疾病有关2毒素在猪的胃肠道疾病中发挥了一定作用2毒素基因存在于质粒上研究刚起步,毒素,毒素是由B型和D型产气荚膜梭菌所产生，能引起家畜的致死性肠毒血症,又称肉性肾病毒素的编码基因etx位于质粒上,etx基因编码的蛋白毒素前体在分泌初期是无毒性的,通过蛋白酶去除毒素前体N端的13个氨基酸和C端22个氨基酸后成为有活性的成熟肽,成熟肽分子质量为32 ku，参与活化的蛋白酶包括产气荚膜梭菌产生的蛋白酶和消化性蛋白酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶。毒素是致死性毒素,给小鼠静脉注射纳克级的毒素,在30 min内即可引起小鼠死亡,并且其毒力仅次于肉毒素和破伤风毒素,毒素,这种通过切除N、C末端两段序列且还有菌体
11、自身蛋白参与的活化过程较为少见。Miyata S等证明,去除C末端氨基酸残基是活化作用的关键,而且不同的酶切产生的毒素的N、C末端及其活性也不相同。其中以胰蛋白酶加胰凝乳蛋白酶活化的毒素毒力最强,而N末端氨基酸残基去除与否对毒素活性基本没有影响。惟有C末端的切除位点对毒素活性,包括在神经突触膜上形成七聚体的能力有影响。去除C末端氨基酸残基后的成熟毒素其毒性是毒素前体的1 000倍。,毒素,毒素与宿主细胞表面的作用机制还不是很清楚,但是现已证明它可以识别小鼠脑细胞和突触小体膜上的唾液糖蛋白受体。目前只有两种细胞系对毒素敏感,分别为MDCK和人成平滑肌瘤G402细胞据推测这与这两种细胞表面存在有效
12、结合毒素的受体有关。,毒素,E型魏氏梭菌分泌 组成 ：酶部分(Ia)和结合部分(Ib) 功能：（1）Ia是一种ADP核糖转移酶;而Ib是一种细胞结合蛋白 。（2） Ib与细胞膜的受体结合后，立即进入细胞膜间隙，形成低聚体，继而与Ia结合，诱导细胞产生内吞作用。（3）Ib激活后能形成离子通道，而Ia则在pH值低于5.6时封闭这一通道。,产气荚膜梭菌肠毒素(CPE),产生 ：A型魏氏梭菌在芽孢期产生的，部分C、D型菌也可产生。 影响因素：pH、温度和碳源 功能（1）小肠上皮细胞的顶部形成一个小孔，从而造成宿主的体液和电解质流失。（2）提供紧密连接蛋白通过的入口。,谢谢大家,菌体形态,双溶血环,Nagler反应,在蛋黄琼脂平板上 ,菌落周围出现 乳白色浑浊圈,是由卵磷脂酶(毒素 )分解蛋黄中卵磷脂所致,此现象称Nagler反应,为本菌的特点。,汹涌发酵,产酸，产气，凝固，胨化几乎同时发生。胨化：分解乳糖产酸，使干酪素凝固，产生的蛋白酶可使凝固的干酪素分解成水溶性蛋白胨。,
