1、1递增负荷运动对大鼠早期 B 细胞发育数量及凋亡情况的影响摘 要：目的：探讨运动性免疫失衡对早期 B 细胞发育及调节体系的影响。方法：SPF 级雄性 SD 大鼠 128 只，随机分成绝对安静组（AC）组，运动前安静组（A） 、运动后即刻组（J） 、运动后 3H 组（3H） ，进行6 周递增负荷跑台运动，分别在第 0、2、4、6 周用四色流式细胞术检测大鼠早期 immature B、mature B 细胞群数量及凋亡情况。结果：0 周：各组间 immature B、mature B 细胞群数量及凋亡情况均无显著性差异（P0.05） ；2 周，与 A 组相比，J 组 immature B、matu
2、re B 数均呈显著性下降（P0.05） ，表明 6 周生长对这些指标没有显著影响。 1.2 运动模型设计、取材时间及建模测试指标 参照 Bedfor d（1979）根据大鼠体重/ 摄氧量回归方程所建立的递增负荷（ 跑台坡度） ，课题组前期通过反复实验性探索获得的运动性免疫失衡发生、发展的动物模型6-11：模拟运动训练安排，长时间、大强度且负荷递增。 因此，采用低强度适应性运动（10 m/min）训练 1 周后，负荷递增至 20 m/min。随后，每周递增负荷增量 5 m/min。至第 6 周，达到 40 m/min，基本达到大鼠最大负荷强度。分别在第 0、2、4、6 周最后一次运动后 48
3、h 采样。采样日进行与上周相同负荷的跑台运动，分别在运4动前安静组（A） 、运动后即刻组（J） 、运动后 3H 组（3H）无菌取大鼠（股骨）骨髓，用于流式细胞仪检测。 多年来的研究表明，分别从血液指标、生化指标、脾淋巴细胞分泌IL-2、sIL-2R、T 细胞活性、巨噬细胞吞噬能力、白细胞介素、自由基代谢、抗氧化体系、心肌离子泵、神经递质等指标，同时监测大鼠体重、皮毛亮度、进食饮用水量及饲料量，通过比较对照组与训练组的这些指标的显著性变化，来验证大鼠 6 周递增负荷跑台运动模型的建立是成功的6-11。 1.3 主要试剂与仪器 主要试剂：Alexa Fluor 647 anti-rat CD45R
4、A，产品编号 202312，购自 BioLegend；Phycoerythrin （PE） anti-rat IgM，产品编号 12-0990，购自 eBioscience；Phycoerythrin （PE） Mouse IgG1， Isotype Ctrl，产品编号 12-4714，购自 eBioscience；FITC anti-rat IgD （H6/31） ，产品编号 sc-53081，购自 Santa Cruz；normal mouse IgM-FITC，产品编号 sc-2859，购自 Santa Cruz；7-AAD，产品编号 00-6993，购自 eBioscience；BD
5、Calibrite 3 Beads（FITC，PE，PerCP） 产品编号 340486，购自 BD PharmingenTM；BD Calibrite APC Bead 产品编号 340487，购自 BD PharmingenTM。主要仪器：美国 BD 公司 FASC Calibur 流式细胞仪；日本 OLYMPUS 倒置生物显微镜；美国 Thermo FORMA 725 超低温冰箱。 1.4 多色染色法流式细胞术的测定 活体麻醉大鼠取股骨，置冰上快速用 16 号针头抽取骨髓；制备新鲜5骨髓单细胞悬液，对细胞计数，将细胞浓度调至 5106/ml。骨髓中两个亚群的表型分别为：Immature
6、B cell：CD45RA+ （IgM+ IgD-） ；mature B cell：CD45RA+ （IgM+ IgD+） ；采用直接染色法，在流式细胞仪 FACS Calibur（BD 公司）上收集并进行表型分析。 1.5 数据处理 所有数值均以（SD）表示，SPSS17.0 统计分析软件完成，两组间比较采用独立样本 t 检验，多组之间比较采用单因素方差分析。显著性差异水平为 P0.05，非常显著性差异水平为 P0.01。 2 研究结果 3 讨论与分析 3.1 6 周递增负荷运动对 immature B 细胞数量的影响 Pre B 细胞轻链基因成功重排后，B 细胞膜上就开始出现单体膜型IgM
7、，这标志着 B 细胞抗原非依赖阶段 immature B 细胞发育的完成。此时通过克隆删除，形成自身免疫耐受，发育为表达 mIgM+mIgD+的成熟 B细胞（mature B cell） ，离开骨髓进入外周免疫器官。 6 周递增负荷运动过程中，在 WK0，运动并未对骨髓早期 B 细胞数量百分比造成明显影响，但从 WK2 开始，各运动组 B 淋巴细胞出现较明显波动，表明一次性的短时间运动训练对骨髓几乎没有影响，然而大强度、长时间训练对骨髓早期 B 细胞发育有较显著的影响。 经过长期的运动训练，骨髓 immature B 细胞数量百分比出现不同时相的显著性变化（见图 2-A） ，提示随训练时间的延
8、长，运动负荷的增强，运动量的积累对 immature B 细胞的影响渐趋增强，提示 6 周递增负荷运6动中，immature B 细胞渐趋对运动应激的敏感性提高。结合我们前期对Pro B、Pre B 细胞的研究结果1，推测是机体根据运动的需要，通过调节 B 细胞所占骨髓总细胞的数量百分比，尽力维持免疫稳态。 可能的原因，一方面是运动训练的骨骼肌适应性改变的发生可能伴随如中性粒细胞和吞噬细胞在肌肉损伤处聚集、骨骼肌白细胞浸润等炎症反应。有研究显示机体发生炎症时，在多种炎性介质诱导下早期造血细胞更倾向于向髓系方向分化，而抑制向淋巴系的分化12。 推测另一方面可能是由于运动能够影响各群 B 淋巴细胞
9、的分化成熟的同时，各种应激激素的产生，也诱导早期 B 细胞的大量凋亡，导致骨髓内各群早期 B 淋巴细胞计数减少。因此，我们继续研究了 6 周递增负荷运动对骨髓早期 B 细胞发育各阶段细胞凋亡的影响。此外，还可能与运动大量耗能，骨髓发育中 B 细胞对葡萄糖和氨基酸的摄取减少有关。 3.2 6 周递增负荷运动对 immature B 细胞凋亡的影响 在免疫系统的发育和功能行使过程中，细胞凋亡始终扮演重要角色，淋巴细胞的分化、成熟乃至死亡过程都伴随着凋亡。 本实验用流式 7-AAD 染料，不含固定剂的红细胞溶血素处理细胞，染上 7-AAD 的细胞是中晚期凋亡细胞及坏死细胞。因严格控制实验条件的一致性
10、，可认为各组坏死细胞数相近，故各组的染色细胞的比较，可以认为是凋亡细胞的比较，也被业内人士认可。 Lu L 等运用不同的实验方法证明发育中 B 细胞的丢失是由凋亡造成13-15。 当未成熟细胞开始表达 IgM 时，将会遇到并识别骨髓微环境中的自身抗原，部分表达抗自身抗原受体的 B 细胞与抗原结合后被诱导7凋亡而清除。 本研究中 immature B 细胞凋亡率的变化特征揭示，随着运动负荷的增加和训练时间的延长，应该是机体根据运动需要，通过改变凋亡率，进而改变 B 细胞所占骨髓总细胞的数量百分比，以求缓解运动性免疫失衡（如细胞免疫的抑制；体液免疫的亢进，外周 B 细胞数量增多但分泌免疫球蛋白功能
11、降低等） ，尽可能的维持免疫稳态。各早期 B 细胞亚群凋亡率的增加，推测可能是运动减少了早期发育中各 B 细胞亚群细胞膜表面抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表达而促成的。 流式实验检测到的凋亡细胞的百分数，其实仅是代表了在一个短暂时刻里可获取的、并且是在体非体外培养状态中的大量凋亡细胞的一小部分，而且是扑捉了在凋亡发生伊始与巨噬细胞吞噬这一时间段内的细胞。流式细胞术测得的骨髓中早期 B 细胞的凋亡，只是一个相对的凋亡活动，本身并不能给予一个在体的真实凋亡率。因此，今后观测早期 B细胞在体发育的凋亡率，有待于探索一种更直接的检测方法。 3.3 6 周递增负荷运动对 mature B 细胞数量及其凋亡的
12、影响 B 前体细胞在骨髓中的发育由 Immature B 细胞向 mature B 细胞转化的过程，经历了阴性选择，从而保证有效产生的 mature B 细胞对自身抗原的免疫耐受，防止自身免疫性疾病的发生，所以在 immature B 细胞向mature B 细胞转化的这一过程对机体来说是至关重要的。 6 周递增负荷运动过程中，mature B 细胞数量百分比及凋亡率的适应性变化特征是：与 WK0 A 相比，mature B 在 WK2 A 呈显著性上升（P0.05） ，WK6 A 显著性高于 WK0 A（P0.05） （见图 3-B） 。与前期工作中8Pro B、Pre B1、immatur
13、e B 细胞数量百分比的变化相比，实验采点相同时相下，本研究中 mature B 则呈现较多的反相变化趋势（见图 2-B，图 3-B） ，推测由以下因素造成。 Laakko 等16模拟了应激下的 CS（皮质酮）浓度（6095g/ dl血液） ，观察 1236h 内 CS 对 BM（骨髓）中的各发育阶段 B 细胞的影响。发现：不成熟 B 细胞，由占 BM 所有细胞数的约 7%下降到不足 1%。成熟B 细胞并未受 CS 的负面影响，由占 BM4%上升为 12%，增加了近 3 倍。研究者们对增多的成熟 B 细胞的来源也不清楚，推测是外周 B 细胞归巢入骨髓所导致；另一方面，可能与骨髓早期 B 细胞各
14、亚群抗凋亡原癌基因bcl-2 的表达量多少有关。在细胞进行基因重排时观测到抗凋亡蛋白Bcl-2 的下调，只有在 prepro B 细胞（前祖 B 细胞）和 mature B 细胞表达大量的 Bcl-2。 其他研究报道揭示在 Pre B 阶段，可诱导产生炎性细胞因子的 TLR 信号能够促进 Pre B 细胞表达 IgM，成为新生 B 淋巴细胞17。另有其他研究者们进一步推测成熟 B 细胞的增多是由于自身反应性 B 淋巴细胞因逃避阴性选择过程而存活下来18，这是由可诱导产生炎性细胞因子的 TLR4 信号促成的。还有研究揭示，一些自身反应性的B 细胞在阴性选择过程中并不一定走向凋亡，而是有可能返回到
15、上一个阶段重新进行 V-D-J 重排，重新产生成为对自身抗原无反应的 B 淋巴细胞19。 Osmond、Stephan、Cancro 等先后提出了代偿机制学说17，20。他们认为，当机体处于应激或其他需要更多能量输出状态下，存在代偿机制，出现骨髓 mature B 淋巴细胞增多现象。研究显示 Pro B 细胞随年龄9增长数量变化不大，但对 IL-7 刺激的增殖能力下降，Pre B 细胞数量减少，但机体通过代偿机制使存活的 Pre B 细胞更多的分化成为 mature B淋巴细胞，以适应机体整合需要20。 本研究中 mature B 细胞的变化特征，产生原因可能是在 6 周递增负荷运动中，长时间
16、的运动消耗，引起 HPA 轴活动加强，皮质酮明显上升，机体分解代谢加速；同时，雄激素分泌减少，合成代谢减弱，以此满足持续运动对机体大量耗能的需求。推测这些变化驱动了骨髓发育中 B 细胞的代偿机制，即促使存活的 Pre B 细胞更多的分化为 mature B 细胞，以适应机体大量耗能的需要。 运动对早期 B 淋巴细胞发育的影响，涉及多方面、错综复杂的调节因素网络，今后还有大量的实验研究工作待进行。如图 4 所示，本课题研究希望进一步通过组织学观察，细胞水平，转录因子、细胞因子及其受体、趋化因子及其受体、Notch 信号转导通路等各层面进一步探讨长期运动对骨髓早期 B 细胞发育的调节机制，为运动性
17、免疫失衡的调控机制及进一步的干预措施提供理论依据。 4 研究结论 4.1 提示 6 周递增运动过程中，机体根据运动需要，通过改变凋亡率，进而促成早期发育中 B 细胞的数量百分比的改变，以求缓解运动性免疫失衡（如细胞免疫的抑制、体液免疫的亢进等） ，尽可能维持免疫稳态； 4.2 联系前期对 Pro B、Pre B 细胞数量及凋亡率的影响，本研究提示随训练时间的延长，运动负荷的增强，运动应激对 mature B 凋亡率的10影响却是渐趋减弱的； 4.3 结合前期对 Pro B、Pre B 细胞的研究工作，实验采点相同时相下，本研究中 mature B 则呈现较多的反相变化趋势。提示 6 周递增负荷
18、运动可能通过代偿机制促使存活的 Pre B 细胞更多地分化为 mature B 淋巴细胞，以适应机体大量耗能的需要。 （感谢华南师范大学体育科学学院郝选明教授在实验研究中给予的指导与资助。 ） 参考文献： 1耿青青，郝选明.长期递增负荷跑台对大鼠骨髓 Pro B 细胞、Pre B 细胞发育的影响J.广州体育学院学报，2011，31（5）：101-105. 2耿青青，郝选明.递增负荷运动中调控淋巴细胞发育分化的转录因子的动态变化C.第九届全国体育科学大会，上海：2011. 3耿青青，郝选明.骨髓中 IL-7、IL-7R 及 EBF 表达与运动性免疫失衡J.体育学刊，2011，18（1）： 139
19、-144. 4耿青青，郝选明.免疫细胞、细胞因子与延迟性肌肉酸痛症J.体育学刊，2009，16（12）：107-112. 5耿青青. Effects of Long-term Incremental Exercise on the Transcription Factor in Development of Early Precursor B Lymphocytes in Rats Bone C.The international convention on Science， Education and Medicine in Sport，2012. 6耿青青，郝选明.The effect of long-term incremental exercise on Glutamate Decarboxylase in the hippocampus of
