1、动物实验基本技术和方法,广东药学院实验动物中心,主要内容,一、 实验前准备二、实验动物抓取与固定三、年龄的大致判断四、性别、发情、与妊娠鉴定五、编号和标记六、分组七、去毛八、给药途径与方法九、采血方法十、其他体液采集十一、麻醉方法十二、处死方法十三、动物病理检查,一、 实验前准备,理论准备:了解动物实验基础知识 制定研究计划和方案 查阅关于实验方法的参考文献条件准备:仪器、器械、药品 运输 动物实验和饲养场所,二、实验动物抓取和固定,(一)小鼠,小鼠固定器固定,(二)大鼠,大鼠固定盒固定,(三)豚鼠,(四)家兔,兔子固定器固定,狗钳,狗的抓取固定,(五)犬,犬嘴固定方法,猫的抓取,犬固定,(六
2、)猴抓取与保定,猴徒手固定,三、年龄的大致判断,(一)大、小鼠1、根据形态鉴定日龄(大、小鼠情况基本一样),2. 根据体重鉴定日龄 小鼠日龄与体重的对应, 大鼠日龄与体重的对应,(二)豚鼠一般老年豚鼠牙齿和趾爪长,被毛稀疏无光泽,眼神呆滞,行动迟缓。而年轻豚鼠牙齿短白,爪短软,眼睛圆亮,行动敏捷,被毛有光泽,且紧贴身体。同样,也可根据体重来推断大致年龄。同日龄豚鼠,雌性体重略高于雄性。与大鼠一样,其体重受多种因素的制约。实验对年龄要求比较严格时,必须由卡片记录提供准确年龄。,(三)家兔 家兔的门齿和爪随年龄增长而增长,是年龄鉴别的重要标志。青年兔门齿洁白,短小,排列整齐;老年兔门齿暗黄,厚而长
3、,排列不整齐,有时破损。白色家兔趾小基本呈红色,尖端呈白色。1岁家兔红色与白色长度相等;1岁以下,红多于白;1岁以上,白多于红。还可根据趾爪的长度与弯曲度来区别。青年兔趾爪较短,直平,隐在脚毛中,随年龄的增长,趾爪露出于脚毛之外,而且爪尖钩曲。另外,家兔皮薄而紧,眼神明亮,行动活泼的为青年兔;皮厚而松,眼神颓废,行动迟缓的为老年兔。,(四)犬犬的年龄主要以牙齿的生长情况、磨损程度、外形颜色等情况综合判定。仔犬在出生后十几天即开始生出乳齿,2个月以后开始由门齿犬齿臼齿顺序逐渐更换为恒齿,8l0个月齿换齐。但犬齿需要1岁半以后才能长坚实。饲养场饲养的品种犬,可以根据记录,明确了解年龄,而收购的杂种
4、犬就无法知道确切年龄。实际中,可根据犬齿更换和磨损情况,估计犬的年龄。,四、性别、发情、与妊娠鉴定,(一)大、小鼠的性别鉴定,初生兔仔如阴部孔洞扁圆而略大于肛门,且与肛门相向、距离较近的是母兔;孔洞呈圆形而略小于肛门,孔洞向前而距肛门较远的是公兔。 三月龄以上的兔子,只要看有无阴囊即可区别公母。,(二)兔的性别鉴定,Female,Male,(三)大、小鼠发情鉴定,小鼠性周期阴道分泌物涂片变化,(四)妊娠鉴定,1、阴道栓法(大、小鼠、豚鼠)2、外部检查法3、摸胎法4、阴道检查法5、直肠检查法6、超声波检查法7、孕酮含量测定法,阴道栓,五、编号和标记,1、染色法:浅色动物 3.5-5苦味酸溶液(黄
5、色) 0.5%中性红或碱性品红溶液(红色) 煤焦油酒精溶液(黑色) 龙胆紫溶液(紫色),2、打耳孔法:小型动物,3、剪趾法:小型动物,4、剪尾法:大、小鼠,仅限与两组间区分5、烙印法:刺号钳,中、大型动物6、针刺法:中、大型动物7、号牌法:耳标签、项圈、腿圈,中、大型动物8、剪毛法:大动物9、笼子标号,六、分组,随机化分组:避免人为影响例:将14只小鼠随机分成两组。先将小鼠编为I14号,在随机数字表上任点一数,按任意方向连续抄14个随机数字。 编排如下:,动物编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14随机数字 16 22 77 94 39 49 54 43 54 8
6、2 17 37 93 23归 组 B B A B A A B A B B A A A A奇数代表A织,偶数代表B组A组: 3 5 6 8 11 12 13 14 B组: 1 2 4 7 9 10调整分组:接刚才随机数字23继续抄表得随机数字78,用78除以8(因为需要把A组的8个数字调整掉一个),得余数6,所以把A组的第6个动物,即12号动物调整到B组, 最终分组A组: 3 5 6 8 11 13 14B组: 1 2 4 7 9 10 12,例:12只大鼠随机分为3组大鼠编号112在随机数字表上任点一数,按任意方向连续抄12个随机数字。每个数分别用3除,记录余数, 根据余数分组大鼠编号:1,
7、2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12随机数字:08,27,01,50,15,29,39,39,43,79, 69,10余数: 2, 0, 1, 2, 0, 2, 0, 0, 1, 1, 0, 1组别: B, C, A, B, C, B, C, C, A, A,C, A, A:3,9,10,12 B;1,4,6 C:2,5,7,8,11调整分组:接刚才随机数字10继续抄表得随机数字61,用61除以5(因为需要把C组的5个数字调整掉一个),得余数1,所以把C组的第1个动物,即2号动物调整到B组。最终分组 A:3,9,10,12 B;1, 2 ,4,6 C:5,7,8
8、,11,七、去毛,1、剪毛:弯头剪毛剪。2、拔毛:大小鼠尾静脉、家兔耳缘静脉注射。3、剃毛:将剃毛部位先用剪刀粗剪一遍,蘸温肥皂水润湿,用剃刀顺着被毛方向剃毛,用电动剃毛推剪,则逆被毛向剃毛。,4、化学脱毛:常用脱毛剂8%硫化钠水溶液硫化钠3份,洗衣粉1份、淀粉7份,加水调成糊状硫化钡50克,氧化锌25克,淀粉25克,加水100毫升调成糊状硫化钠10克,生石灰15克,加水到100毫升,适合犬和其他大动物。,八、给药途径与方法,(一)自动口服:加入饲料或饮水(二)投喂药片:掰开口,放到舌根部,(三)灌胃(i.g),1、小鼠、大鼠、豚鼠 灌胃时将灌胃针按在注射器上,吸入药液。左手抓住鼠背部及颈部皮
9、肤将动物固定,右手持注射器,将灌胃针插入动物口中,沿咽后壁徐徐插入食道。动物应固定成垂直体位,针插入时应无阻力。若感到阻力或动物挣扎时,应立即停止进针或将针拔出,以兔损伤或穿破食道以及误入气管。一般当灌胃针插入小鼠34cm,大鼠或豚鼠46cm后可将药物注入。常用的灌胃量小鼠为0.2 1ml,大鼠14ml,豚鼠为15ml。,2、狗、兔、猫、猴 灌胃时,先将动物固定,再将特制的扩口器放入动物口中,扩口器之宽度可视动物口腔大小而定,如狗的扩口器可用木料制成长方形,长约1015cm,粗细应适合狗嘴,约23cm,中间粘一小孔,孔的直途为510cm。灌胃时将扩口器放于上述动物上下门牙之后,并用绳将它固定于
10、嘴部,将带有弹性的橡皮导管(如导尿管),经扩口器上的小圆孔插入,沿咽后壁而进入食道,此时应检查导管是否正确插入食道,可将导管外口置于一盛水的烧杯中,如不发生气泡,即认为此导管是在食道中,未误入气管,即可将药液灌入。灌胃管插入长度狗为20cm,兔子为12-15cm。,动物最大灌胃量,(四)直肠给药 (五)呼吸道给药 (六)滴鼻 (七)点眼 (八)经皮肤给药:常用于检测药物、毒物、化妆品等的透皮吸收、局部作用、至敏作用等。家兔和豚鼠选择脊柱两侧皮肤,大小鼠常采取浸尾方式。 (九)皮内注射(i.d):一般用于接种或过敏实验。将药液注射在真皮和表皮之间。皮内注射时需将注射的局部脱去被毛,消毒后,用左手
11、拇指和食指按住皮肤并使之绷紧,在两指之间,用注射器连4(1/2)号细针头,紧贴皮肤表层刺入皮内,然后再向上挑起并再稍刺入,即可注射药液,此时可见皮肤表面鼓起一白色小皮丘。,(十)皮下注射(s.c):注射时以左手拇指和食指提起皮肤,将连有5(1/2)号针头的注射器刺入皮下。皮下注射部位一般狗、猫多在大腿外侧,豚鼠在后大腿的内侧或小腹部;大白鼠可在侧下腹部。兔在背部或耳根部注射。蛙可在脊背部淋巴腔注射。(十一)肌肉注射(i.m):股部肌肉,(十二)腹腔注射(i.p):用大、小白鼠做实验时,以左手抓住动物,使腹部向上,右手将注射针头于左(或右)下腹部刺入皮下,使针头向前推0.51.0cm,再以45度
12、角穿过腹肌,固定针头,缓缓注入药液,为避免伤及内脏,可使动物处于头低位,使内脏移向上腹。若实验动物为家兔,进针部位为下腹部的腹白线离开1cm处。,(十三)静脉注射(i.v):,1、小鼠:尾静脉2、大鼠:尾静脉、 阴茎静脉、 舌下静脉、 浅背侧跖静脉,大小鼠有上、左、右3根尾静脉,成品字型,小鼠尾静脉注射,大鼠阴茎静脉注射,大鼠舌下静脉注射,大鼠浅背侧跖静脉注射,3、豚鼠:浅背侧跖静脉、耳静脉注射4、家兔:耳静脉注射5、猪:耳缘静脉6、猴:前肢桡静脉、后肢隐静脉注射,猪耳缘静脉注射,7、猫、狗:前肢内侧头静脉、后肢外侧小隐静脉注射,狗前肢内侧头静脉,狗后肢外侧小隐静脉,猴的后肢皮下静脉注射,(十
13、四)脑腔注射:1、小鼠 小指夹鼠尾,拇指和是指置小鼠头两侧固定,中指和无名指压住鼠身,在注射处消毒后,右手持注射器,以食指固定针芯,垂直刺入针头深度约57mm。2、兔 将兔用固定器固定好,剃去头顶的被毛,左手将头皮绷紧,消毒后,右手持锥子,自头顶正中稍偏一侧部位,锥穿头骨,即换以左手固定锥子,右手持注射器,使针头沿锥尖刺入,慢慢拔出锥子,即刻将针头刺入约1020mm,即可推液。,(十五)关节腔注射:(十六)椎管内注射:注射入蛛网膜下腔(十七)淋巴囊内注射:蛙和蟾蜍,(十八)小脑延髓池注射:,几种动物不同给药途径的常用注射量(毫升),九、采血方法,(一)大、小鼠:1、眶静脉丛(窦): 少量多次采
14、大小鼠血。 小鼠0.20.3ml, 大鼠0.40.6ml2、摘眼球:用于一次大量采小鼠血,可得到45体重的血量3、尾静脉:用于少量多次采大小鼠血,尾静脉采血,4、剪头:用于一次性大量采小鼠血,可得到0.51.0ml的血量5、大血管:包括颈动脉(静脉),股动脉(静脉),腋下动脉(静脉),腹主动脉,此方法不常用于小鼠采血,而多用于大鼠一次性大量采血。可得5ml左右血量。6、心脏采血:小鼠少用,可用于大鼠一次性(开胸)或多次采血(不开胸)。,心脏采血,(二)家兔 :1、耳缘静脉:中等血量的采集,可反复采血,每次510ml。2、耳中央动脉:可反复采血,每次1015ml。,3、心脏采血:可用于 一次性(
15、开胸)或 多次采血(不开胸)。 一次性开胸采血可 得到80100ml血量4、颈动静脉采血:用于一次性采血,需要手术,可得血量8010ml。,(三)豚鼠:1、心脏采血:可用于一次性(开胸)或多次采血(不开胸)。一次性开胸采血可得到510ml血量。2、背跖静脉采血:用于少量反复采血。3、耳缘剪口采血,(四)犬猫:和静脉注射部位相同,前肢内侧头静脉、后肢外侧小隐静脉。也可颈静脉(动脉)或心脏采血。,(五)猪:前腔静脉或耳大静脉采血(六)羊:颈静脉采血(七)猴:前肢头静脉、后肢皮下静脉或耳缘静脉等。(八)禽类:翼下静脉,仔猪前腔静脉采血,采血注意事项,(一)采血场所有充足的光线;室温夏季最好保持在25
16、28,冬季,1520为宜;(二)采血用具有采用部位一般需要进行消毒;(三)采血用的注射器和试管必须保持清洁干燥;(四)若需抗凝全血,在注射器或试管内需预先加入抗凝剂。(五)注意不同动物的采血量采血。,、取少量血,、取中量血,、取大量血,4、最大安全采血量与最小致死采血量,常用抗凝剂:1、肝素:抑制凝血酶活力,阻止血小板凝集。纯品肝素1mg125U,10U20U抗1ml血凝集,但通常应用23倍剂量。 用法:可配成1%肝素溶液,用时取0.1ml于试管内,100烘干,每管可抗凝510ml血。或用1%肝素溶液湿润采血注射器。 肝素可改变蛋白质等电点,当用盐析法分离蛋白作分类测定时,不可用肝素抗凝。,2
17、、枸橼酸钠:使凝血必需的钙离子失活。常用35%水溶液,碱性较强。3、草酸盐合剂:草酸铵1.2g,草酸钾0.8g,福尔马林1.0ml,加蒸馏水至100ml。使凝血必需的钙离子失活。每毫升血加草酸盐合剂0.1ml。4、氟化钠:每毫升血加6mg。,十、其他体液采集,1、胸水、腹水采集:穿刺2、消化液采集:唾液,胃液,胰液,胆汁3、精液采集:中、大动物用假阴道,小动物穿刺附睾来采集精液。4、脑脊液采集:手术或小脑延髓池抽取5、骨髓采集:大动物活体穿刺,小动物处死后取股骨或胸骨骨髓。,6、尿液采集:代谢笼收集导尿管采集膀胱穿刺压迫排尿,十一、麻醉方法,(一)麻醉方法:1、全麻 吸入麻醉,静脉注射、腹腔注
18、射。2、局麻 浸润麻醉。根据手术,按皮下、筋膜、肌肉、腹膜、骨膜等顺序逐步深入注射到术野周围。,(二)麻醉前准备:1、禁食812h,防止呕吐,可饮水。2、根据实验部位和种类,给动物脱毛。3、犬、猪、猴等大动物可在麻醉前给予一些药物以减少动物紧张,减少支气管分泌。,(1)阿托品:减少支气管和唾液腺分泌,防止气管阻塞。副作用:加快心率。用量:肌肉或皮下注射0.04mg/kg(2)安定:产生镇静作用,加强麻醉效果,使骨骼肌松弛。用量:2.55mg/kg(3)吗啡:产生镇静作用。副作用:抑制呼吸中枢。用量:皮下注射12mg/kg,肌肉注射1020mg/kg。,(三)麻醉药物:1、全麻药物(1)乙醚:强
19、挥发性、易燃。乙醚是最常用的吸入麻醉剂,各种动物适用。 机制:抑制中枢神经系统。 特点:安全范围大,肌肉完全松弛,对肝肾毒性小,麻醉诱导期和苏醒期较长。副作用:局部刺激大,引起上呼吸道黏膜分泌增加,导致呼吸道阻塞,可用阿托品对抗解救。,(2)巴比妥类:种类很多,有巴比妥钠,戊巴比妥钠,硫喷妥那,苯巴比妥钠等。适用于各种动物。如实验中大小鼠常用3戊巴比妥钠溶液腹腔注射进行麻醉。 特点:安全范围广,毒性小,麻醉潜伏期短,麻醉维持时间长。可腹腔或静脉给药。机理:阻断神经冲动传递到大脑。 副作用:过量使用可导致呼吸肌麻痹而死亡,同时抑制末梢循环,导致血压降低,并影响基础代谢,导致体温降低。,(3)氯胺
20、酮:常用其盐酸盐。 特点:麻醉潜伏期短,麻醉维持期仅1020min,麻醉浅,安全性高,可重复给药。 机制:阻断大脑联络途径。 副作用:兴奋心血管系统,使血压升高,心率加快,偶尔引起呕吐。(4)水合氯醛:作用特点和巴比妥类相似。但安全范围小,麻醉剂量和中毒剂量接近,对皮肤和黏膜有较强刺激。,2、局麻药物(1)普鲁卡因:是无刺激性的局麻药物。 特点:麻醉速度快,注射后13分钟就可产生麻醉。可以维持3045分钟。对皮肤和黏膜穿透力很弱,需要注射给药才能产生局麻效果。它可以使血管舒张,易被吸收入血液而失去效果。在其溶液中加入肾上腺素(每100ml加入0.1%肾上腺素0.20.5ml)可以使麻醉时间延长
21、12小时。,(2)利多卡因:效力和穿透力比普鲁卡因强。(3)的卡因:化学结构和普鲁卡因类似,效力和穿透力比普鲁卡因强。,(四)实验动物的急救,动物实验过程中,可因麻醉药过量、出血过多、分泌物或血块堵塞气管造成窒息以及某种药物原因引起动物血压、呼吸不规则等现象,此时应立即进行急救处理措施。 急救处理措施首先要迅速排查原因,并中断诱因(如止血、停药、排除分泌物等),然后对症实施急救措施。,1、呼吸、心跳(血压)的改变 动物实验过程中,需密切观察实验动物的呼吸、心跳及血压的变化,一者它们是实验反应的数据指标,二者是实验动物状态的主要指征。尤其对呼吸的观察,因为动物的死亡首先是呼吸的停止。(1)诱发原
22、因 麻醉给药速度过快或过量:实施静脉给药麻醉,可因给药速度过快或过量导致呼吸停止。因此,为防止麻醉剂过量,注射速度一定不要过快,严密观察动物状况,若需追加麻醉剂,一次不宜超过总量的1/5。,气道不畅或堵塞:常见于麻醉后,因为气管分泌物增多或气管切口的出血凝块堵塞气管,动物呼吸不规则、呼吸困难甚至引起的窒息。 大失血:如因大动脉插管的松脱所造成的大失血。 实验药物的作用:如静脉注射乙酰胆碱过量或动物对其反应过强,引起心搏减弱减慢,继而出现呼吸、心跳的停止。,2、急救措施 (1)迅速排查、中断、排除诱因。如应用棉签清除干净气管、气管插管内的分泌物及血凝块。必要时拔出气管插管冲洗后再行气管插管术。
23、(2)根据下列不同情况采取相应的急救措施:呼吸极慢、不规则,但心跳正常时:给予人工呼吸-压胸法,适当给予苏醒剂。呼吸停止仍有心跳时:实施人工呼吸,必要时可使用人工呼吸机或吸氧(吸入气中O2占95%,CO2占5);注射50葡萄糖液510ml;给肾上腺素及苏醒剂。呼吸、心跳均停止时:用l:10000肾上腺素溶液心内注射,其余同。,3、大失血 (1)诱发原因 多因动脉插管结扎不牢、动物挣扎,导致大动脉插管的松脱,或在进行动脉插管术时,因未放置动脉夹或动脉夹夹闭不全而剪切动脉引起。 (2)急救措施 立即止血:应迅速手指压迫或捏住出血处(尽量不要用止血钳,以防损伤动脉和神经),然后仔细检查分离出血点,于
24、近心端放置动脉夹,再行动脉插管术。 补充血容量:若失血太多,适当加快输液(生理盐水)速度,增加血容量。 注射强心剂:静脉注射110000肾上腺素0.5ml。,十二、处死方法,1、颈椎脱臼法:小鼠、大鼠2、空气栓塞法:兔、猫、犬等大动物3、放血法:心脏放血或大血管放血4、断头法:小鼠、大鼠5、吸入二氧化碳6、麻醉法:如注射巴比妥类药物,十三、动物病理检查,(一)一般病理检查,1、实验动物不明原因死亡或实验需要时必须进行尸检以查明死亡原因。2、对动物进行尸检应该在动物死亡后立即进行,不能立即进行的需在冷冻的条件下保存动物尸体,以尽量保持病变与死亡前状态一致。3、外观检查:检查动物的发育状况、营养状况、精神状态、感觉器官、呼吸系统、消化系统、皮肤及被毛等指标。4、病理剖检:主要观察组织器官的大小、色泽、质地、切面和粘膜等指标。,(二)组织病理学检查,1、取材:按要求切取相应的组织器官,并用固定液进行固定。2、制片:按程序将切取的组织器官制作成组织切片。3、读片:在显微镜下观察动物的心、肝、脾、肺、肾、脑等重点器官。尸体需要做无害化处理:高压、焚烧、深埋等。,谢谢!,