1、 1 高效液相色谱法测定竹茹提取物 及其不同部位 中 的腺苷 含量 龚金炎 1,2,3,4， 葛青 1,2，张蕾 1,2，陈丽春 1,2， 毛建卫 1,2，黄俊 1,2 刘士旺 1,2， 王永江 1,2， 张英 3 （ 1.浙江科技学院生物与化学工程学院，浙江杭州， 310023; 2.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，浙江 杭州 310023; 3.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310029; 4. 绍兴市质量技术监督检测院，浙江 绍兴， 312000） 摘 要： 建立一种反相高效液相色谱（ RP-HPLC）法测定竹茹提取物及其 不同部位的腺苷含量的方法。采用 RP
2、-HPLC 法； Luna C18 ODS 柱 （ 4.6250mm， 5 m）， 乙腈 -0.01 mol/L磷酸缓冲溶液 （ pH=6.5） ； 体积流量： 1.0 mL/min；进样量： 10 L；柱温： 40 ；检测波长： 257 nm。 结果 采用 RP-HPLC 法 竹茹提取物及其不同部位的腺苷含量 ，在0.121124 g/mL 范围内线性关系良好（ R2= 0.9999）， 平均 回收率 为 98.3%， RSD 为 3.11%。本方法简便、灵敏、准确，可普遍应用于 竹茹提取物 的质量研究和品质控制。 关键词 ： 竹茹提取物 ； 腺苷 ； 高效液相色谱 Determinatio
3、n of Adenosine in Extract of Bamboo Shavings by HPLC GONG Jin-yan 1,2,3,4, ZHANG Lei 1,2, CHEN Li-chun 1,2, GE Qing 1,2, MAO Jian-wei 1,2, HUANG Jun 1,2, LIU Shi-wang 1,2, WANG Yong-jiang 1,2, ZHANG Ying 3 (1.School of Biological and Chemical Engineering, Zhejiang University of Science and Technolog
4、y, Hangzhou 310029, China;2.Zhejiang provincial Key Lab for Chem Zhejiang University of Science and Technology, Hangzhou 310029, Zhejiang, China; 3. College of Biosystem Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310029, Zhejiang, China; 4 Shaoxing Testing Institute of Quality Techn
5、ical Supervision, Shaoxing 312000, Zhejiang, China) Abstract: To develop a method for determination of adenosine in extract of bamboo shavings by RP-HPLC. RP-HPLC method was used with Luna C18 ODS (4.6250mm, 5 m) column. The mobile phase was acetonitrile -0.01 mol/L phosphate buffer solution（ pH=6.5
6、） with 1.0 mL/min flow rate; The column temperature was 40 ; The detection wavelength was set at 257 nm. RP-HPLC method was used for the determination adenosine; The calibration curve of adenosine was linear under the content 0.12124 g/mL; The linearity the average recovery was from 98.3%, RSD was 3
7、.11%. Conclusion The method is simple, sensitive and accurate. The method can be 基金项目 ： 国家自然科学基金资助项目（ 31240054），国家十 二 五科技支撑计划资助项目（ 2011BAD23B02），浙江省自然科学基金资助项目（ Q13C200020） ，浙江省科技计划 资助 项目（ 2012C22026）， 浙江省 重点科技创新团 队 资助 项目 （ 2011R09028） 作者简介 ： 龚金炎（ 1982-）， 男，博士， 副教授 ，研究方向为：天然产物与功能性食品的研究与开发。 Email： 2 a
8、dapted to control the quality of extract of bamboo shavings. Key words: Bamboo shavings; Adenosine; HPLC 竹茹（ Bamboo shavings， Caulis Bamfusae in Taeniam） 在中药辞海中记载为禾本科刚竹属、箣竹属和牡 竹属中一些竹种的茎秆所刮下的外皮层或其次一层， 为药食两用的物品， 具有清热化痰、除烦止呕等功效，是临床不可缺少的常用药 1，收载于中国药典 (2010版 ) 2。 腺苷广泛分布于体内各种组织中，也 是一些滋补 品或 药品的重要成分 ，如灵芝 3，
9、蛹虫草 4、 人参 5、 冬虫夏草 6、 蜂王浆 7， 具有镇静、安神、抗惊厥等调节中枢神经、抗凝血、保护心肌等生理活性 9-13。 本研究 建立一种反相高效液相色谱法测定竹茹提取物及其不同部位的腺苷含量的方法。本方法简便、灵敏、准确，可普遍应用于竹茹提取物的质量研究 和品质控制。 1 材料与方法 1.1 仪器 高效液相色谱仪：美国 waters 2695，配制 waters PDA 2996 检测器。 1.2 试剂与试样 腺苷中国药品生物制品检定所，含量大于 98%；乙腈和甲醇色谱级，磷酸氢二钠和磷酸二氢钠为分析纯。 竹茹提取物由 浙江大学食品科学与营养系提供， 具体指标为总酚 42.1 %
10、、总黄酮15.9 %、 29.0 %。竹茹提取物不同部位制备方法如下 ： 取竹茹提取物 40 g，加入 800 mL 蒸馏水，充分溶解后，置于 2 升的分液漏斗中，依次加入等体积的乙醚、乙酸乙酯、正丁醇进行 萃取，每种溶剂按 1 1 的体积比重复萃取三次；将各个不同极性的萃取液合并，浓缩，冻干，得到不同分级产物，按极性小到大分别为乙醚相 3.68g、乙酸乙酯相 2.2g、正丁醇相21.52g 和水分级相 5.20g。 2 方法与结果 2.1 色谱条件 色谱柱： Luna C18 ODS（ 4.6250 mm， 5 m）。 流动相： 乙腈（ A）； 0.01 mol/L 磷酸缓冲溶液 （ B，
11、pH=6.5） （ V V） 。洗脱条件： A 3%， B 97%， 流速： 1.0 mL/min。进样量： 10 L。柱温： 40 。检测波长： 257 nm。 2.3 标准溶液配置 精密称取干燥至恒重的 腺苷 12.4 mg， 纯水 溶解并定容至 100 mL， 将上述溶液制成0.121、 0.484、 1.938、 7.75、 31.0、 124.0 g/mL 的 6 个不同浓度 的标准品溶液。 3 2.3 试样的制备 精密 称取竹茹提取物及 各个 分级相 100 mg (精确至 0. 1mg)， 用纯水溶解， 在室温下超声提取 15 min并定容至 100 mL，过 0.45 m 过滤
12、器，备用。 2.4 腺苷的标准曲线 将 6 个不同浓度梯度的标准溶液注入高效液相色谱仪，记录峰面积。以 腺苷的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程 为 Y = 30221X-1490.7（ R2= 0.9999） ，线性范围为 0.121124 g/mL。 2.5 精密度 取同一浓度的标准溶液，连续进样 5 次， 计算 腺苷的 RSD 为 1.12 %。 2.6稳定性 取同一 竹茹提取物 试样溶液，分成 5 份，分别在 0、 2、 4、 8、 24 h 测定，其 RSD 为 0.41 %，表明供试样品在 24h 内基本稳定。 2.7回收率 取同 一竹茹提取物 试样 5 份，精密加入 1
13、 mL 含腺苷（ 500 g/mL），溶解于纯水中， 在室温下超声处理 15 min，并定容至 100 mL，过 0.45 m 过滤器 制备供试样品溶液，测定并计算加样回收率和 RSD，腺苷的加样回收率和 RSD 分别为 98.3 和 3.11%。 2.8 样品测定 竹茹提取物及个分级相 样品进样，根据腺苷标准曲线得到 竹茹提取物 和正丁醇相分别含有腺苷 0.38 和 1.88 mg/g，乙醚相、乙酸乙酯相和水相均未检测， HPLC图如 1所示： AU0 . 0 0 00 . 0 1 00 . 0 2 00 . 0 3 0M i n u t e s2 . 0 0 4 . 0 0 6 . 0 0
14、 8 . 0 0 1 0 . 0 0 1 2 . 0 0 1 4 . 0 0 1 6 . 0 0 1 8 . 0 0 2 0 . 0 0 2 2 . 0 0 2 4 . 0 0腺苷 4 AU0 . 0 0 00 . 0 0 20 . 0 0 40 . 0 0 60 . 0 0 80 . 0 1 0M i n u t e s2 . 0 0 4 . 0 0 6 . 0 0 8 . 0 0 1 0 . 0 0 1 2 . 0 0 1 4 . 0 0 1 6 . 0 0 1 8 . 0 0 2 0 . 0 0 2 2 . 0 0 2 4 . 0 0AU0 . 0 0 00 . 0 0 20 . 0 0
15、 40 . 0 0 60 . 0 0 80 . 0 1 0M i n u t e s2 . 0 0 4 . 0 0 6 . 0 0 8 . 0 0 1 0 . 0 0 1 2 . 0 0 1 4 . 0 0 1 6 . 0 0 1 8 . 0 0 2 0 . 0 0 2 2 . 0 0 2 4 . 0 0图 2 竹茹提取物 和正丁醇相中腺苷的 HPLC 图谱 Figure 2 The HPLC of extracts of bamboo shavings and n-Butanol fraction of extracts of bamboo shavings 3 讨论 本章 建立了竹 茹 提
16、取物 及 不同分级部位中腺苷 的反相高效液相色谱法， 简便、灵敏、准确， 重现性强 ，可用于竹 茹 提取物的质量研究和制剂质量控制。 腺苷的发现对 竹茹提取物的质量研究和制剂标准化有着非常重要的作用。 本文 首次确认了 竹茹提取物及 不同分级部位含有腺苷成分， 竹茹提取物 和正丁醇相中含量分别为 0.38 和 1.88 mg/g，这是在禾本科植物中首次报道有腺苷的存在。 检测结果发现正丁醇中腺苷是 竹茹提取物 4.95 倍，实现了有效的富集。这就为蛹虫草、虫草菌粉及其产品中腺苷的富集提供了一个思路。 参考文献： 正丁醇相 竹茹提取物 腺苷 腺苷 5 1 龚金炎，毛建卫，黄伟素，等 . 竹茹中苜
17、蓿素对照品的高效液相半制备色谱制备研究 J. 中草药 , 2012, 43(5): 919-921. 2 中国药典 S. 一部 . 2010. 3 徐 颖 ,王 斌 . 高效液相色谱法测定灵芝饮片中腺苷 J. 中草药 , 2010, 41(12): 2003-2005 4 刘小芳 , 薛长湖 , 常耀光 . 反相高效液相色谱法测定蛹虫草中腺苷和虫草素的含量 J.食品科学 ， 2010, 31（ 16）： 172-175 5 袁蜜 , 乐昕 , 徐鲁荣 , 等 . 高效液相色谱法同时测定蛹虫草子实体中腺苷和虫草素的含量 J. 食品科学 , 刊印中 6 蔡 丹 , 刘景圣 , 修 琳 , 等 .
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