1、食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验,李斯特氏菌属,李斯特氏菌属（Listeria ）普遍存在于环境中，最新的分类学研究表明，其分为六个种：单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii）英诺克李斯特氏菌（Listeria innocua）斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri）威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri）格氏李斯特氏菌（Listeria grayi） 在李斯特氏菌属的六个种中，只有两种致病菌：单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他动物发病。但是，其中通常只有单核增生李斯特
2、氏菌和人类的李斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯特氏菌中最有检测意义的是单核增生李斯特氏菌。,单增李斯特氏菌能引起人、畜的李斯特氏菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和流产等。它广泛存在于自然界中。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都可被污染。该菌在4的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。其易感人群主要为孕妇、老人、新生儿和免疫缺陷人群。大多数发达国家人类李斯特菌病发生率约为每一百万人2-15例，死亡率为13-34%加拿大由单增李斯特氏菌污染肉制品引发李斯特菌病暴发，导致十几人死亡。很多国家都已经采取措施来控制食品中的单增李斯特氏菌，并制定了相应
3、的标准。,按2009年国家食源性疾病检测网的工作手册1.定性检测2.定量检测,检样25 g(ml)样品+LB1增菌液225 mL，均质,0.1 mL+10 mL LB2增菌液,科玛嘉李斯特菌显色培养基,PALCAM琼脂,接种木糖、鼠李糖，36 1 ，24 h；同时于TSA-YE平板划线纯化，30 1 ，24 h48 h,木糖-，鼠李糖+,鉴定,结果报告,30 1 ，24 h,30 1 ，18 h24 h,36 1 ，24 h48 h,增菌培养:LB1增菌液225 mL，于30培养24h, 吸取0.1 mL，加入10mL LB2增菌液中二次增菌。分离培养:LB2 二次增菌液转种于选择培养基PAL
4、CAM和科玛嘉琼脂平板上，于37培养24 h，观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表1。,表1 单核细胞增生李斯特菌在选择性平板上的菌落特征选择性琼脂平板单核细胞增生李斯特菌科玛嘉显色培养基菌落为:蓝色，周围有白色晕圈.PALCAM琼脂菌落:为灰绿色，小的圆形菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷,L.M在 Chromagar培养基生长特征,L.M在OXA培养基生长特征,L.M在PALCAM培养基生长特征,MMA抑制性强，菌落小、形态不典型，很难与杂菌区分进口PALCAM 、进口OXA菌落较典型，易与杂菌区分CHROMagar菌落较典型，易与杂菌区分，对高污染食品中的杂菌抑制
5、性较差,染色镜检将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查; 利斯特菌为革兰氏阳性短杆菌, 大小为0.40.5m0.52.0m；用生理盐水制成菌悬液, 在油镜或相差显微镜下观察, 该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。,该菌为革兰氏阳性无芽孢杆菌，在纯培养物中呈短小杆菌，在初龄培养物中呈球杆菌状，在老龄培养物中呈长丝的长杆菌状，有些细菌因此而变成革兰氏阴性；为需氧或兼性厌氧菌，在2025培养时能形成4根鞭毛，运动活泼；在37培养时无鞭毛，运动消失。,1.初筛 在我们前期工作中发现，高污染样品在选择性琼脂平板上可疑菌落较多，为避免漏检和减少工作量，增加初筛步骤：挑取典型或可疑菌落接种在木糖、鼠李糖发酵
6、管中，无须烧环同时TSA-YE平板上划线分离纯菌。,初筛及纯培养自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管，于37培养24h；同时在胰酪胨大豆琼脂培养基（TSA-YE）平板上划线纯化，于30培养24h-48h。木糖阴性为蓝色，鼠李糖阳性为黄色，在TSA-YE平板上可疑菌落为淡蓝色。,单增李斯特氏菌生化性状与其种间的区别,动力试验将TSA-YE平板上的疑似菌落穿刺接种到SIM培养基中，于30培养24h-48h，李斯特菌有动力，呈伞状生长。溶血实验：将7%羊血琼脂平板底面划分为20-25个小格，从TSA-YE上挑取菌落刺种到血平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性
7、对照菌(单增李斯特菌和绵羊李斯特菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特菌)，,于35培养24h-48h，穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂。 于明亮处观察洁净的血琼脂平板，单增李斯特菌和斯氏李斯特菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，无害李斯特菌无溶血环，伊氏利斯特菌产生大的透明溶血环。注意：不要据此来区别李斯特氏各种菌，仅仅是一种溶血现象。用CAMP试验来确证李斯特氏各种菌。,协同溶血试验 (cAMP):在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌 (R.equi), 在它们中两者之间垂直接种可疑李斯特菌, 但不要触及它们, 于30培养24h48 h, 检查平板中垂直接种点对溶血环的影
8、响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的单核细胞增生李斯特菌的溶血增强, 斯氏李斯特菌（L.seeligeri）的溶血也增强, 而伊氏李斯特菌（L.ivanovii）在马红球菌附近的溶血增强。,金葡,单核,马红,伊氏李,对小鼠的毒力试验 （可选择） 将符合上述特性的纯培养物接种于TSB-YE中, 于30培养24 h, 离心, 弃上清液，用0.85无菌生理盐水制备成浓度为1010cfu/mL的菌悬液, 取此菌悬液进行小鼠腹腔注射 35只, 每只0.5 mL，观察小鼠死亡情况。致病株于25d 内死亡。试验时可用已知菌作对照。单核细胞增生利斯特菌、伊氏利斯特菌（L.ivanovii）对小鼠有致病性。,血清学分
9、型: Lm是根据O抗原和H抗原的差异进行血清学分型。虽然Lm有16种血清型，1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b和7，但只有3种血清型 (1/2a、1/2b、4b)可引起疾病。从食品和患者中分离的菌株95以上是1/2a，1/2b，1/2c和4b等血清型，而3a、3b、3c、4a、4c、4e、4d和7等血清型在食品中非常少见，也没有引起李斯特菌病的报道。,一方面血清是进口的，无国产的；另一方面只存在“O”抗原因子血清，并且各型之间含有多种共同的抗原因子，因此其血清学上鉴别意义不大。,2.商业生化鉴定系统的应用 原国标中未涉及，FDA
10、、AOAC标准使用API 10300、Vitek GNI（AOAC 989.13），这些方法都比较成熟，稳定性较好，已被许多国家和组织的标准采用。我国许多单位也积累了较多的经验，使用最广泛的是API 10300, Vitek GNI，考虑到各种系统在国内的实际应用现状，拟定在生化鉴定方面“采纳API10300或Vitek GNI为传统生化鉴定方法的选择性替代方法”。,API10300,L.M的API10300鉴定结果,单增李斯特菌编码:2410、2510、2550、6010、6110、6150、6410、6450、6510,VITEK,采用聚合酶链式反应技术（PCR）特异性扩增单核细胞增生李斯
11、特氏菌溶血素基因(hlyA)，并评价该方法的特异性与敏感性。 结果 在706bp处出现nuc基因的目的片断，只有单增李氏菌的目的片段获得扩增其它菌种扩增均呈阴性；该方法可以检测到3.3pg/l的DNA。,引物 针对单核细胞增生李斯特氏菌溶血素基因（hlyA）设计引物，委托上海生物工程技术服务有限公司合成。单核细胞增生李斯特氏菌特异性引物序列如下：上游（F）：5-GCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATC3下游（R）： 5-CTTGCAACTGCTCTTTAGTAACAGC-3,PCR检测方法：（1）取1ml被检样李斯特氏菌增菌肉汤用于提取DNA的，模板DNA的制备， 根据试剂盒说明书进行；（2）PCR反应体系：20l 。H2O(二馏灭菌水) 12.8l，10buffer2.0l，Mg2+(25mol/l) 2.0l，4dNTP(10mmol/ml) 1.6l，Primer(30pmol/l) 各0.25l，Taq E（2.5U/l）0.1l DNA(20-30ng/l )1.0l；,（3）扩增条件：预变性94 5min，变性9560s退火 63 60s ，延伸72 60s 30个循环，再延伸728min，20 pause。（4）结果观察：PCR产物用1.5琼脂糖凝胶，100v电压电泳，溴化乙锭(EB)染色，凝胶成像分析仪中观察扩增结果，扩增片段长度为706bp。,谢谢！,
