1、1拟南芥 AtWNK9 基因的定位及表达分析基金项目：国家自然科学基金资助项目（31171176） ；湖南省自然科学基金资助项目（11JJA002） ；青年教师成长计划项目（531107040602） 作者简介：赵小英（1973-） ，女，湖南慈利人，湖南大学副教授 摘要：AtWNK9 为拟南芥 WNK（With no lysine kinase）激酶家族成员，其功能尚不清楚采用生物信息学和生物学实验相结合的方法，对AtWNK9 蛋白结构、亚细胞定位、启动子元件、基因表达模式进行了分析研究发现，AtWNK9 定位在细胞核中；该基因在拟南芥根中高效表达，其表达受 ABA，NaCl、葡萄糖、热和冷
2、等非生物胁迫处理强烈诱导结果表明，AtWNK9 为非生物胁迫反应相关基因，并可能参与根的生长发育 关键词：基因表达；拟南芥；AtWNK9 中图分类号：Q94 文献标识码：A WNK 激酶（With no lysine kinase）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于蛋白激酶家族成员之一，因其家族成员在激酶功能域缺乏保守的赖氨酸而得名该激酶家族成员在通常保守的位于激酶区域第二个亚结构域缺乏一个赖氨酸残基，动物 WNK 激酶中赖氨酸被半胱氨酸所替代，在植物中常被天冬酰氨（ N）或丝氨酸（ S ）替代，但激酶的生物活性没有发生变化，因此表明 WNK 激酶是一种特殊的蛋白激酶 Nakamichi 等在
3、双子叶植物拟南芥中克隆到植物中第一个 WNK 基因2AtWNK1，随后又成功分离到了 AtWNK2-98 个 WNK 基因，并发现AtWNK2，AtWNK4，AtWNK6 涉及拟南芥昼夜节律的调控过程AtWNK2，AtWNK5，AtWNK8 的 TDNA 插入突变导致拟南芥早开花，AtWNK1的 TDNA 插入突变表现出了晚花的表型最新研究发现，破坏 AtWNK8 能提高拟南芥对盐和渗透压力的抗性 目前，在单子叶植物水稻中发现 7 个WNK 基因，其中 OsWNK1 被发现参与各种非生物胁迫如冷、热、盐、干旱胁迫等 Wang 等在大豆中鉴定了一个根特异性的 WNK 同源基因，GmWNK1，它通
4、过与 ABA 分解代谢相关的蛋白 GmCYP707A1 相互作用微调 ABA 的水平，从而调控大豆晚期侧根的发育随后又发现 GmWNK1 能增强植物对 NaCl 和渗透压的抗性目前，有关拟南芥 AtWNK9 基因的功能尚处于未知状态，因此系统研究 AtWNK9 基因的功能对全面了解拟南芥 WNK 激酶的功能具有十分重要的意义 生物信息学作为研究过程中的一项技术和开发工具在核酸及蛋白质序列分析及功能预测中发挥重要的作用基因蛋白结构与表达的生物信息学分析结果对后续基因功能研究有重要的指导意义本研究采用生物信息学和生物学实验相结合的手段，对 AtWNK9 蛋白结构、亚细胞以及基因表达情况进行了分析，
5、这将为进一步研究该基因的功能奠定基础 1 材料与方法 11 植物材料和载体 拟南芥野生型 Col4 为哥伦比亚生态型，大肠杆菌 DH5 菌株和pA7YFP 载体均为本实验室保存 12 生物信息学分析 3运用简单模块构架搜索工具 SMART（Simple Modular Architecture Research Tool） （http：/smartemblheidelbergde/smart/）和 NCBI 网站提供的保守结构域检索工具 CDART（Conserved Domain Architecture Retrieval Tool） （http：/wwwncbinlmnihgov/Str
6、ucture/）对 AtWNK9蛋白进行保守结构域分析；利用丹麦科技大学（DTU）的 CBS 服务器上的NetPhos20 Server 程序（http：/wwwcbsdtudk/services/NetPhos/）分析磷酸化位点；利用 WoLF PSORT 工具（http：/wolfsortseqcbrcjp）和 TAIR 网站中提供的蛋白亚细胞定位数据库 SUBA （The SubCellular Proteomic Database） （ http：/suba2plantenergyuwaeduau/）预测蛋白质亚细胞定位13-14；通过 TAIR 网站中提供的 Arabidopsis
7、eFP Browser 链接（http：/bbcbotanyutorontoca/efp/）分析 AtWNK9 基因的表达谱15利用植物 Plant CARE 在线分析工具（http：/bioinformaticspsbugentbe/webtools/plantcare/）对AtWNK9 基因上游 1 000 bp 的启动子顺式作用元件进行分析16 13 35S：AtWNK9YFP 融合表达载体构建 以拟南芥野生型 Col4 为材料，采用 RTPCR 方法，首先提取总 RNA 并逆转录为 cDNA，然后以此 cDNA 为模板，利用引物AtWNK9YFPF（ACGCGTCGACATGATGAA
8、CAATCTC AGCCATCTT） ，AtWNK9YFPR（GGACTAGTGT CTTCTTCGTCAGAG TCGTTT） （下划线碱基部分分别为 Sal和 Spe酶切序列） ，通过 PCR 扩增得到 AtWNK9 目的基因的全长 cDNA 序列采用酶切连接的克隆方法，将该片段连接到 pA7YFP 载体中，构建绿色荧光蛋白与 AtWNK9 基因融合表达的载体 35S：AtWNK9YFP 414PEG 介导的原生质体转化 为确定 AtWNK9 基因在细胞中表达的具体部位，将上述构建的35S：AtWNK9YFP 进行原生质体转化参照文献17的方法，将未抽台前的叶片约 90 片，切成 1 mm
9、 宽的长条（长度不定） ，置于 500 mmol 甘露醇溶液中将细条捞出，置于含有纤维素酶和果胶酶的酶解液中，黑暗 23 ，4050 r/min 解析 3 h 以制备原生质体取约 1020 g 35S：AtWNK9YFP 质粒于 15 mL 离心管中，随后依次加入 100 L 的原生质体和 110 L PEG/Ca 溶液，轻柔混匀放置 2030 min 后，去除PEG，用 W5 溶液（154 mM NaCl，125 mM CaCl2， 5 mM KCl，2 mM MES）终止反应，然后置于云孔板内 23 黑暗下培养 618 h 后，在荧光倒置显微镜下观察和分析 AtWNK9 的亚细胞定位 15
10、 胁迫处理 拟南芥野生型 Col4 种子经深层（1% 次氯酸钠 10 min，无菌水洗 5次）消毒后，4 春化 34 d，然后播种在 MS 培养基上放置在 2223 培养箱连续白光培养 12 d 后，用 ABA（100 M）18NaCl（300 mM）19、葡萄糖（2%）20、热（37 ）21、冷（4 ）22进行处理，清水处理作为对照，在不同的时间点收取材料，液氮速冻后，于-80 保存，用于后续的实时定量 PCR 分析 16 实时定量 PCR 分析 采用 TRIGene（GenStar）提取总 RNA，按照 Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit （Fer
11、mentas）试剂盒提供的方法，反转录合成cDNA 在定量 PCR 仪（Mx3 000 P）上，按照 SYBR Premix Ex TaqTM （Perfect Real Time） （TakaRa）定量试剂盒的说明进行定量 PCRPCR 反5应条件为： 94 预变性 10 min，94 变性 30 s，57 退火 30 s， 72 延伸 30 s， 40 个循环每个实验至少重复 3 次，持家基因 ACTIN2 作为分子内标本研究采用的定量 PCR 引物见表 1 2 结果 21AtWNK9 蛋白结构分析 运用简单模块构架搜索工具 SMART 和 NCBI 中的 CDART 软件对 AtWNK9
12、蛋白进行保守结构域分析，发现 AtWNK9 在第 25 到第 282 个氨基酸区域，包含了一个保守的丝氨酸苏氨酸激酶催化结构域（STYKc）和一个蛋白激酶催化结构域（PKc） （图 1（a） ） ，因此，AtWNK9 被归类为丝氨酸苏氨酸蛋白激酶家族利用丹麦科技大学（DTU）的 CBS 服务器上的 NetPhos20 Server 程序对 AtWNK9 蛋白进行磷酸化位点分析从图中可看出，AtWNK9蛋白氨基酸序列中的 17 个丝氨酸（S） ，2 个苏氨酸（Thr）和 7 个酪氨酸（Tyr）蛋白激酶磷酸化位点（图 1（b） ）这说明 AtWNK9 具有自身磷酸化的特点 22AtWNK9 基因亚
13、细胞定位分析 采用 WoLF PSORT 工具对 AtWNK9 的亚细胞定位进行预测，得知AtWNK9 定位在胞质中；采用 TAIR 网站中提供的蛋白亚细胞定位数据库SUBA 进行预测，得知该基因定位在细胞核中为进一步确定 AtWNK9 的亚细胞定位，我们采用 PEG 介导的原生质体转化方法17进行了分析研究 首先，采用 PCR 扩增，得到 AtWNK9 的全长 cDNA 序列，大小为 1 400 bp 左右（图 2（a） ）用限制性内切酶 SaI和 Spe将该片段和 pA7YFP载体进行双酶切，分别得到大小为 4 900 左右和 1 400 bp 左右的酶切片6段（图 2（b） ）回收酶切片
14、段，用 T4DNA 连接酶进行连接反应将反应液转化大肠杆菌 DH5 ，然后对阳性克隆进行 PCR 和双酶切（Hind和BamH）鉴定，PCR 产物及酶切片段大小与预期片段大小相一致（图2（c） ， （d） ） ，表明成功构建了 35S： AtWNK9YFP 重组质粒随后，以载体 35S：YFP 质粒作为对照，将重组质粒 35S：AtWNK9YFP 转化拟南芥原生质体，在荧光倒置显微镜下观察融合基因的表达情况（图 3）绿色荧光蛋白基因 YFP 在细胞的所有部位都高效表达（图 3（b） ） ，融合基因AtWNK9YFP 则仅在细胞核中表达较强（图 3（d） ） ，与蛋白亚细胞定位数据库 SUBA
15、预测结果相一致，表明 AtWNK9 编码核蛋白 23AtWNK9 组织器官表达模式分析 基因的时空表达模式可为预测和研究其生物学 功能提供参考依据根据 TAIR 网站中 eFP Browser 连接提供的数据，对 AtWNK9 基因在拟南芥不同组织器官中的表达谱进行了分析整理（图4（a） ）AtWNK9 基因在拟南芥植株的根、下胚轴、叶、花等各个组织器官中均有不同水平的表达，在根中的表达量最高此外，AtWNK9 在不同部位的叶片、茎、花和花粉中的表达也存在一定的差异但表达水平都比较低（图 4（a） ）为了进一步确定 AtWNK9 基因在不同组织器官的表达模式，采用实时荧光定量 PCR 检测了该
16、基因在拟南芥根、莲座叶、茎生叶、茎、花和果荚中的表达情况从图 4（b）中可看出，AtWNK9 在所有被检测的组织器官中均有表达，其中在根中的表达量最高，约为其它器官中的 35倍，其次为茎这与 eFP Browser 连接提供的数据基本一致，推测 AtWNK9可能参与根的生长发育 724 AtWNK9 基因表达对非生物胁迫的响应 利用植物启动子顺式作用元件分析网站 Plant CARE 在线分析了AtWNK9 基因上游 1 000 bp 的调控区域结果发现，AtWNK9 基因的调控区域存在大量激素响应与胁迫响应相关的元件，包括赤霉素反应元件（GibberellinResponsive Eleme
17、nt， GARE） 、热胁迫响应元件（HSE） 、逆境和胁迫响应元件（TCrichrepeats）等顺式作用元件 为了研究 AtWNK9 基因的表达是否响应激素、逆境胁迫，实验中对 12龄拟南芥幼苗分别进行 ABA、盐、葡萄糖、热、冷胁迫处理，采用实时定量 PCR 分析了 AtWNK9 基因的表达情况结果如图 5 所示，AtWNK9 基因的表达受胁迫处理强烈诱导，其中 ABA 的诱导效应最明显，AtWNK9 的转录水平在 ABA 处理 4 h 即达到峰值，为对照处理的 89 倍，在随后的 8 h 内其表达量仍然维持较高的水平；AtWNK9 基因对 NaCl 处理的响应更快，在处理 2 h 达到
18、最大值，为对照处理的 89 倍左右，随处理时间延长AtWNK9 基因的表达量迅速下降，但仍为对照处理的 23 倍；AtWNK9 对葡萄糖、热、冷胁迫的响应相对较弱，分别在葡萄糖处理 4 h，热、冷处理 6 h 达到最大值，为对照处理的 5 倍、3 倍和 6 倍；AtWNK9 对水处理（对照实验）几乎没有响应，说明 AtWNK9 基因为植物胁迫反应相关基因 3 讨论 对基因的生物信息学分析，可为预测其生物学功能提供参考本研究首先利用生物信息学的手段对 AtWNK9 的核苷酸及蛋白质序列进行了保守结构域和磷酸化位点分析，发现 AtWNK9 基因包含与蛋白激酶催化结构域（PKc_）和丝氨酸苏氨酸催化
19、结构域（STYKc）具有高度相似性的结构域，8且存在多个磷酸化位点，与 WNK 激酶家族中其他成员的结构特征一致23，因此，AtWNK9 具有自身磷酸化特点，这还需作进一步研究 基因的表达部位及表达模式通常与基因的功能有紧密的联系结合生物信息学分析、原生质体转化及荧光定位分析，得知 AtWNK9 在细胞核中表达，说明 AtWNK9 基因编码核蛋白此外，根据 eFP Browser 提供的数据及实时定量 PCR 分析，证明了 AtWNK9 基因在拟南芥根中高效表达，这与Wang 等的 RTPCR 实验结果相吻合，说明 AtWNK9 可能参与根的生长发育 利用 Plant CARE 对 AtWNK
20、9 启动子顺式作用元件进行分析，结果显示：启动子区域存在大量激素响应与胁迫响应相关元件通过激素和胁迫处理发现，AtWNK9 基因的表达受 ABA，NaCl 等非生物胁迫强烈诱导，说明 AtWNK9 为非生物胁迫反应相关基因这为进一步研究 AtWNK9 基因的生物学功能奠定了良好基础 参考文献 1张翀，陈楠 WNK 激酶的研究进展J 细胞生物学杂志， 2008（6）： 711-715 ZHANG Chong， CHEN Nan Progress in WNK kinasesJ Chinese Journal of Cell Biology， 2008（6）： 711-715.（In Chines
21、e） 吕晶玉 WNK 基因表达的研究D 沈阳：中国医科大学临床流行病学系， 2003 NAKAMICHI N， MURAKAMIKOJIMA M， SATO E， et al Compilation and characterization of a novel WNK family of protein kinases in Arabiodpsis thaliana with reference to circadian rhythmsJ 9Biosci Biotechnol Biochem，2002， 66（11）： 2429-2436 4WANG Y， LIU K， LIAO H， et
22、 al The plant WNK gene family and regulation of flowering time in ArabidopsisJ Plant Biol （Stuttg） ，2008， 10（5）： 548-562 ZHANG B， LIU K， ZHENG Y， et al Disruption of AtWNK8 enhances tolerance of Arabidopsis to salt and osmotic stresses via modulating proline content and activities of catalase and pe
23、roxidaseJ Int J Mol Sci，2013， 14（4）： 7032-7047 KUMAR K， RAO K P， BISWAS D K， et al Rice WNK1 is regulated by abiotic stress and involved in internal circadian rhythmJ Plant Signal Behav，2011， 6（3）： 316-320 WANG Y， SUO H， ZHENG Y， et al The soybean rootspecific protein kinase GmWNK1 regulates stressr
24、esponsive ABA signaling on the root system architectureJ Plant J，2010， 64（2）： 230-242 WANG Y， SUO H， ZHUANG C， et al Overexpression of the soybean GmWNK1 altered the sensitivity to salt and osmoticstress in ArabidopsisJ J Plant Physiol，2011， 168（18）： 2260-2267 XIANG L， GUO X， NIU Y Y， et al Fullleng
25、th cDNA cloning and bioinformatics analysis of PnUGT1 gene in Panax notoginsengJ Yao Xue Xue Bao，2012， 47（8）： 1085-1091 1010MARCHERBAUER A， ZHENG C， CHITSAZ F， et al CDD： conserved domains and protein threedimensional structureJ Nucleic Acids Res，2013， 41（1）： 348-352 11GEER L Y， DOMRACHEV M， LIPMAN
26、D J， et al CDART： protein homology by domain architectureJ Genome Res，2002， 12（10）： 1619-1623 BLOM N， GAMMELTOFT S， BRUNAK S Sequence and structurebased prediction of eukaryotic protein phosphorylation sitesJ J Mol Biol，1999， 294（5）： 1351-1362 13HORTON P， PARK K J， OBAYASHI T， et al WoLF PSORT： prot
27、ein localization predictorJ Nucleic Acids Res，2007， 35（Web Server issue）： W585-W587 14HEAZLEWOOD J L， VERBOOM R E， TONTIFILIPPINI J， et al SUBA： the Arabidopsis subcellular databaseJ Nucleic Acids Res，2007， 35（Database issue）： D213-D218 15SCHMID M， DAVISON T S， HENZ S R， et al A gene expression map of Arabidopsis thaliana developmentJ Nat Genet，2005， 37（5）： 501-506 16LESCOT M， DEHAIS P， THIJS G， et al PlantCARE， a database of plant cisacting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequencesJ Nucleic Acids Res，2002， 30（1）： 325-327
