1、 1 LSA-21 大孔 吸附 树脂 富集 何首乌 中 二苯乙烯 的工艺 研究 曹骋， 贾薇 *， 王术玲 ， 陈丰连， 曾元儿 （广州中医药大学中药学院， 广州 510006） 摘要 目的： 研究 LSA-21型大孔树脂 对何首乌二苯乙烯苷的吸附 性能及分离纯化工艺参数 。方法：采用高效液相色谱法测定2,3,5,4-四羟基二苯乙烯 -2-O-D-葡萄糖苷 含量 ， 计算 LSA-21大孔树脂对二苯乙烯 苷 的吸附 率 和解吸率。结果： 最佳吸附纯化工艺为： 最大上样量为 1.2g/g(生药量 /干树脂 ),药液浓度为 0.2g/mL(相当于生药量 )，吸附流速为 1.0mL/min,60%乙
2、醇洗脱 ,洗脱剂用量为 60mL，洗脱流速为 1.0mL/min。 结论： LSA-21大孔树脂对何首乌二苯乙烯苷的吸附纯化效果较好， 本研究结果可为实际生产提供理论依据。 关键词： 何首乌；二苯乙烯苷； LSA大孔吸附树脂 中图分类号 R283.6 文献标识码 A 文章编号 1005-9903（ 2011） 10- Study on the Technology of Enrichment of Stilbene Glycoside in Polygonum multiflorum with LSA-21 Marcoporous Resin CAO Cheng , JIA Wei , WAN
3、GShu-ling, CHENFeng-lian, ZENGYuan-er （ Traditional Chinese Pharmaceutical College of Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510006,China) Abstract Objective: To study the conditions and parameters of purifying stilbene glycoside from Polygonum multiflorum Thunb. Method: HPLC was applied to determin
4、e the content of 2,3,5,4-tetrahydroxy-stilbene-2-O-D-glycoside, and calculate the adsorption rate and desorption rate. Result: The optimumprocess condition was as follows: 60% ethanol was used as eluting solvent; the adsorption velocity was 1.0 mLmin-1, and the solution concentration was 0.2 gmL-1;
5、elution velocity was 1.0mL/min. Conclusion:The desorption purification effect of LSA-21 marcoporous resin is good. So this method of purification is advisable. The results of this study can provide theoretical basis for practical production. Key words Polygonum multiflorum Thunb.; stilbene glycoside
6、; LSA-21 marcoporous resin 何首乌为蓼科植物何首乌 Polygonum Multiflorlum Thunb.的干燥块根，具有补肝、益肾、养血、祛风之功效， 能解毒，消痈，截虐，润肠通便。用于疮痈，瘰疬，风疹瘙痒，久虐体虚，肠燥便秘 1。何首乌主要含有二苯乙烯苷类、蒽醌类、磷脂类、糖类等成分。二苯乙烯苷具有抗衰老、降低胆固醇、提高免疫功能、防治动脉硬化及保肝等作用 。大孔吸附树脂吸附分离技术是一种纯化新工艺，可以达到分离、富集 收稿日期 20110112（ 001） 第一作者 曹骋 ， 讲师，硕士，从事中药分析 及配方颗粒关键技术 相关研究， 电话 ： 020-393
7、58081， E-mail： 通讯作者 *贾薇 ， 讲师，博士，从事中药分析及质量标准研究 ， 电话 ： 020-39358081， E-mail： 2 中药有效部 位或有效成分的目的。为了更好地 分离纯化何首乌中二苯乙烯苷， 发挥何首乌的药效， 本研究主要 考察 LSA-21树脂对何首乌二苯乙烯苷的吸附性能 及工艺参数 ， 旨在寻找出最适 宜 的动态吸附工艺 ，为实际生产提供理论依据。 1 仪器 与 试药 岛津 LC-10AT高效液相色谱仪 ， SPD-10Av检测器 ， Kromasil C18色谱 柱 ( 4.6mm250mm， 5m)， 766-3型 KETONG 远红外辐射干燥箱
8、 。何首乌（ 购自 广州致信中药饮片有限公司，经 广州中医药大学中药鉴定教研室黄海波副教授 鉴定 为 蓼科植物何首乌 Polygonum Multiflorlum Thunb.的干燥块根 ） ， 2,3,5,4 - 四羟基二苯乙烯 -2-O-D-葡萄糖苷（中国药品生药制品检定所，批号 110844-200606）； LSA-21型大孔吸附树脂 （ 西安蓝晓科技有限 公司） ， 乙腈 为色谱纯（ Merck)，水为蒸馏水，其余试剂为分析纯 。 2 方法 2.1 何首乌 上样液 的制备 称 取何首乌药材粉末 （过一号筛） 适量，置圆底烧瓶中， 加 10 倍体积 50%乙醇，置 恒温水浴锅中加热回流
9、提取 2 次，每次 1h，合并提取液，滤过，滤液 经 减压浓缩至无醇味，高速离心（ 3000rmin-1） ， 取上清液，调节浓度至 0.2g/mL（相当于生药量） ，即得 。 2.2 二苯乙烯苷的含量测定 2.2.1 色谱条件 流动相：乙腈 -水（ 25 : 75）；检 测波长 320nm；柱温：室温；流速： 1.0mL/min，进样量 10l。 2.2.2对照品溶液的制备 取 2， 3， 5， 4-四羟基二苯乙烯 -2-O-D-葡萄糖苷 对照品 适量，加 50%乙醇 制成每1mL 含 0.2mg 的溶液 2.2.3 供试品溶液的制备 精密 移 取 何首乌 上样 液 （或流出液） 1mL，置
10、 25mL量 瓶中， 加 50%乙醇稀释至刻度 ，过 0.45m微孔滤膜，即得。 2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取 2， 3， 5， 4-四羟基二苯乙烯 -2-O-D-葡萄糖苷 对照品溶液 0.50， 1.00，2.00， 3.00， 4.00mL置 5mL 量瓶 中， 加 50%乙醇 稀释 至刻 度，摇匀 。分别进样 测定 峰面积 ，以峰面积为纵坐标， 质量 浓度 为横坐标，得线性 方程为 Y=115759394X+628349 （ r=0.9994） 。结果表明 2， 3， 5， 4-四羟基二苯乙烯 -2-O-D-葡萄糖苷 进 样 浓度 在 0.020.16 gL-1 线性关系良 好
11、。 2.2.5精密度试验 取同一份供试品溶液，连续进样 6 次，按 2.2.1 项下色谱条件测定二苯乙烯苷峰面积，结果峰面积 RSD 0.3%，表明测定方法精密度良好。 2.2.6 测定 按 2.2.1 及 2.2.3 项下方 法，分别进样测定二苯乙烯苷峰面积，按标准曲线法计算含量。 3. 动态吸附性能考察 3 3.1 大孔树脂预处理 2 取 LSA-21 树脂适量， 加入 95%乙醇回流至洗脱液蒸干后无残留，洗净的树脂挥去溶剂后保存备用。以乙醇湿法装柱 ,乙醇洗脱 ,至流出的乙醇液用水稀释不浑浊为止 (取 1 mL 乙醇加 5 mL 水 )，用纯化水洗至无醇味，备用。 3.2 静态吸附解吸性
12、能考察 笔者 在优选大孔树脂型号 前期研究 中，曾 通过静态吸附 -解吸 实验测出 LSA-21树脂对二苯乙烯苷的 静态 吸附率，洗脱率 最大可达 86%及 89%，分离效率为 77%3。 3.3 吸附流速的确定 分别取已预处理的 LSA-21 大孔树脂 5 份，每份 5g， 装柱 。取 上样 液 20 mL 分别以 0.5，1.0， 1.5， 2.0 mL/min 的流速上样，收集各流速下的流出液， 按 2.2.6 项下 方法测 定二苯乙烯苷含量，计算吸附率。结果 二苯乙烯苷 吸附率随吸附流速的增大而逐渐下降，流速大于 1.0mL/min， 二苯乙烯苷吸附率显著下降，吸附流速为 0.5mL/
13、min 时吸附率最大，但上样时间长，故选定最佳吸附流速为 1.0mL/min。 见 图 1。 0 .5 1 .0 1 .5 2 .0828486889092949698吸附率/%流速(ml/min)图 1 吸附流速对二苯乙烯苷吸附率的影响 3.4 上样液 浓度影响 称取 已 预处理 LSA-21 型树脂 5g， 共 4 份， 装柱，另取 浓度为 0.1， 0.2， 0.3， 0.4g /mL （相当于生药量）的上样液 10mL， 以 1.0 mL/min 的 吸附流速 上样， 待吸附完全后， 按 2.2.6 项下 方法测 定二苯乙烯苷含量 ，计算吸附率。结果 上样液浓度大于 0.2 g/mL（
14、相当于生药量）后， LSA-21 树脂对二苯乙烯苷的吸附率逐渐下降。上样液浓度为 0.1 g/mL（相当于生药量）时，二苯乙烯苷吸附率最高，但 此浓度 药液较稀，纯化所需时间长，故上样液浓 度 选择 0.2 g/mL（相当于生药量）较为适宜。 见 图 2。 0 .1 0 .2 0 .3 0 .460657075808590吸附率/%浓度(g/ml)图 2 上样液浓度对 LSA-21 型大孔树脂吸附率的影响 3.5 最大上样量 的确定 称取 已 预处理 的 LSA-21 树脂 10g， 装柱 ，另取 0.2 g/mL（相当于生药量）的 上样液，上样， 吸附 流速 为 1.0 mL/min， 用具
15、塞试管收集流出液，每 10mL 收集一份， 按 2.2.6 项下方法测定二苯乙烯4 苷含量 ，计算 未 吸附率。 以药液体积为横坐标，未吸附率为纵坐标绘制泄漏曲线。 结果 随着上样液 体积 增加，未吸附率逐渐增加， 60mL 以后未吸附率显著上升，此时二苯乙烯苷大量泄漏，树脂对二苯乙烯苷的吸附能力显著下降，故确定 60mL 为最大上样量 ，此时未吸附率未超过 10%。 见 图 3。 0 20 40 60 80 10001020304050未吸附率/%体积/ml图 3 最大上样量 3.6 乙醇 浓度 考察 取 LSA-21 树脂 10g，装柱， 用上样液 吸附饱和 ， 用水洗至流出液 无色澄清
16、后，依次以 5倍柱体积 20%乙醇 ， 40%乙醇 ， 60%乙醇 ， 80%乙醇 ， 95%乙醇洗脱树脂柱，收集各段洗脱液。 按 2.2.6 项下方法测定 各段洗脱液中二苯乙烯苷含量，结果 随着乙醇体积分数的增加，洗脱 液中二苯乙烯苷的含量逐渐增加；当乙醇体积分数 大于 60%后 ，洗脱液中二苯乙烯苷的量明显降低，可认为树脂上的二苯乙烯苷已基本洗脱完全，故选定洗脱液乙醇浓度为 60%。 见 图 4。 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100020406080100120140160180二苯乙烯苷量/mg乙醇浓度/%图 4 洗脱液浓度的影响 3.7 洗脱流速的影响 取 已
17、经吸附饱和的树脂用水洗至流出液澄清并无色后，以 4倍柱体积 60%乙醇洗脱， 分别 调节流速为 0.5， 1.0， 1.5， 2.0 mL/min， 收集洗脱液。 按 2.2.6项下方法测定 洗脱液中二苯乙烯苷含量，结果 随着流速的增大，洗脱逐渐上升，当流速 为 1.0mL/min时，洗脱率达到最大，故确定洗脱流速为 1.0mL/min。见 图 5。 5 0 .5 1 .0 1 .5 2 .06065707580859095洗脱率/%洗脱流速/ ml/min图 5 洗脱流速的影响 3.8 洗脱曲线 取 已 用上样液 吸附 饱和 的 树脂 10g，用蒸馏水洗脱除去水溶性杂质， 以 60%乙醇 1
18、00mL洗脱，洗脱 流速 1.0 mL/min，每 10 mL 收集一次洗脱液。 按 2.2.6项下方法测定 各段洗脱液中二苯乙烯苷含量 。 结果流脱液中 二苯乙烯苷的量随着洗脱体积的增大逐渐减少，到第 60mL时，二苯乙烯苷含量已经很少，可认为二苯乙烯苷已基本洗脱完全，故选择 60%乙醇洗脱剂体积为 60mL。 见 图 6 。 0 20 40 60 80 100020406080二苯乙烯苷洗脱量/mg体积/ml图 6 洗脱剂用量考察 3.9 验证 实验 取 LSA-21树脂 10g，上柱，分别加入 0.2 g/L（相当于生药量） 何首乌 上样 液 60mL进行动态交换吸附，吸附流速为 1.0
19、mL/min， 收集流出液， 待吸附完全后加水洗至 流出 液接近无色后 ， 加 60%乙醇 60mL洗脱， 调节流速 1.0mL/min， 收集洗脱液， 按 2.2.6项下方法测定 二苯乙烯苷含量 。 计算洗脱率。 结果 见 表 1。 表 1 验证实验结果表 编号 吸附量 /mg 吸附率 /% 洗脱量 /mg 洗脱率 /% 1 153.3 88.10 131.9 86.04 2 149.1 85.69 132.8 89.07 3 146.7 84.31 129.3 88.14 四、 结果与讨论 大孔 吸附 树脂的吸附性能主要取决于吸附剂的表面性质，即树脂的极性 (功能基 )和空间结构（孔径、比
20、表面积、孔容），一般非极性物质易被非极性树脂吸附，极性物质易被极性树脂吸附。强极性的大孔吸附树脂虽然对极性强的化合物吸附能力强，但较难被洗脱，弱极性树脂吸附能力弱 4。 大孔吸附树脂解吸 时 受到洗脱剂的种类、浓度、体积、程序、流速的影响。 6 LSA-21树脂是 一种中等极性树脂，适合分离 纯化 弱极性和 中等 极性有机化合物。 二苯乙烯苷类化合物多含有酚羟基 ,可作为良好的氢键供体 ,有利于被极性树脂吸附。 本研究考察了 LSA-21型大孔树脂对何首乌二苯乙烯苷的动态吸附纯化工艺 ,主要从上样液的浓度、最大上样量、吸附流速、洗脱剂的含醇量、洗脱流速、洗脱液的用量等方面进行考察 ,从而得到最
21、佳的纯化工艺参数。 实验表明 LSA-21型树脂对 二苯乙烯苷类化合物 具有较强的富集能力。本实验研究初步确定 LSA-21树脂对 何首乌二苯乙烯苷 纯化条件为 ： 最大上样量为1.2g/g(生药量 /干树脂 ),药液浓度 为 0.2g/mL(相当于生药量 )，吸附 流速为 1.0mL/min， 60%乙醇 洗脱 ， 洗脱 剂 用量为 60mL。 验证实验证明 , LSA-21树脂对 何首乌二苯乙烯苷 的动态吸附率 、解吸率均 在 80%以上 ， 纯化效果良好。 纯化后 二苯乙烯苷在干膏中的 含量 由 7.3%提高至 43.5%， LSA-21树脂纯化 何首乌二苯乙烯苷的 工艺稳定 ,方法可取 ,具有良好的应用 。 参考文献 1中国药典 .一部 S. 2010:164. 2胡军 ,周跃华 . 大孔吸附树脂在中药成分精制纯化中的应用 J.中成药 , 2002, 24(2):127. 3曹骋，王术玲，陈丰连，曾元儿 .等 .不同型号大孔吸附树脂对何首乌二苯乙烯的吸附性 J. 医药导报，已接收 ， 2011年 第 2期发表 . 4何伟，李伟 . 大孔树脂在中药成分分离中的应用 J. 南京中医药大学学报， 2005， 21(2):134 责任编辑 仝燕
