化学诱变剂EMS筛选越橘茎尖抗旱突变体的初步研究.DOC

2、诱变；抗旱突变体中图分类号： S603.4 The initial study on screening drought resistance mutants of blueberry shoots with EMS mutagenesis CHEN Ling， Zhang Wen-ling， Zhang Min， LI Zheng, LI Ling (School of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400716,China) Abstract: The meristem

3、 of blueberry culture was treated by EMS, both the shoot induction rate and the rooting rate decreased more than that of control. Drought tolerant variants were selected from the M1 generation plants, then the activity of SOD, CAT, POD enhanced and the content of MDA decreased which means that the r

4、egenerated plants ability of drought resistant was improved. The strongest drought resistant mutant plants were obtained at the treatment of 0.3%EMS. Key words: EMS; blueberry; induced mutation; drought-tolerance identification 越橘 (Vaccinium)属于杜鹃花科 (Ericaceae)越橘属 1，为多年生落叶或常绿灌木或小灌木。越橘果实含有多种维生素、微量元素、黄

5、色斛皮苦素、叶酸、熊果酸、花色苷等对人类健康有益的物质，具有延缓脑神经衰老、解除眼睛疲劳、增强心脏功能和防癌的独特功效。越橘对酸性土壤适应性强，但是我们在十年栽培过程中发现越橘根系浅，抗旱能力弱。为此本实验结合前人的研究成果 2、 3、 4 、 5、 6、 7、 8、 9，开展了越橘诱变的研究工作。并对干旱处理后 M1代植株部分生理指标进行了测定。以期为越橘的抗旱育种提供基础研究数据。 1 材料和方法 1.1 实验材料本实验材料是以 “V3”和 “3#”越橘试管苗，取自本实验室。化学诱变剂甲基磺酸乙酯（ Ethyl methane sulfonate 简称 EMS）为美国

6、 SIGMA公司生产。 1.2 实验方法配制 pH4.8， 0.01mo1/L的磷酸缓冲液（ pH4.8），高压灭菌后冷却至室温。在无菌条件下 EMS经抽滤灭菌（经 0.22um的微过滤器注射）后添加到磷酸缓冲液中，配制成浓度为 0.1%、0.2%、 0.3%、 0.4%、 0.5%、 0.6%（分别以 A、 B、 C、 D、 E、 F表示）的处理液。剪取大小约 0.5cm的试管苗茎尖放入到上述浓度的 EMS溶液中，震荡处理 1h (pH4.8、 0.01mo1/L的缓冲溶液处理作为对照，以 CK表示 )，无菌水冲洗五遍后接种于预选出的培养基中，每个处理接种 10瓶

7、，每瓶接种 10个茎尖，观察试管苗的生长状况。生根后以透气性较好的松针土为基质移栽于 8*8规格的小塑料钵中于 09年夏季高温天气下在温室中培养至 12-16片叶。在干旱处理作者简介：陈凌（ 1985-），男，重庆潼南人，硕士研究生，主要从事园林植物遗传育种与生理研究通讯作者：李凌，教授，硕士生导师。前先一次性浇足水，四天后，当土壤含水量约为 30%后测定。以每处理 30盆为一个群体，每天早晨 8点每处理随机取 15株成熟叶片 2-3片保存于 4保温盒中测定丙二醛的含量、超氧化物歧化酶、过氧化物酶及过氧化氢酶活性 10，连续测定 3天。 2 结果与分析 2.1 EMS处理

8、对越橘茎尖生长情况的影响在诱变剂处理材料的过程中，随 EMS浓度的增加，越橘茎尖越来越软。材料转入培养基以后，茎尖进入萌发阶段。由于浓度差异，各处理萌发状态不一，低浓度的萌发较快也较为整齐；浓度高萌发时间推迟且萌发水平参差不齐。 20天后在存活的植株群体中观察发现不同的变异类型，其中包括红色茎杆、叶形、茎粗、茎长等。随着培养时间的延长，部分差异越来越大，但是部分红色茎杆缺逐渐消失，只有部分保存于茎中上部。 2.2 EMS处理对越橘茎尖增殖率和生根率的影响在相同处理时间下， EMS对越橘茎尖的影响很大。表 1可见，经诱变处理的再生越橘苗，茎尖的增值率和生根率较低且明显低于

9、对照。尤其当 EMS浓度高于 0.4%时，两种材料的增值率均低于 10%。表 1 EMS处理对 V3、 3#增殖率和生根率的影响 Table1 Effects of different density of EMS of the test tube plants V3 and 3# 材料 V3 材料 3# 浓度处理芽个数增值率 (%) 生根率 (%) 增值率 (%) 生根率 (%) A 100 25 84 35 100 B 100 22 91 28 100 C 100 24 80 21 99 D 100 23 92 13 95 E 100 4 70 7 82 F 100 5 63

10、 2 83 Ck 100 112 100 183 100 2.3干旱处理对诱变植株部分生理指标的影响 2.3.1 干旱处理对诱变植株丙二醛含量的影响从图 1、 2可以看出，干旱胁迫下各处理 MDA含量随时间的延长呈现上升的趋势，但是其上升幅度均小于对照。说明一定浓度 EMS处理减缓了再生苗体内 MDA含量的增加，在一定时间内减少了细胞的毒害，增加了其抗旱性。 V301234567891 2 3胁迫时间(d )MDA含量（umol/gFW)A B C D E F ck3#00.511.522.533.51 2 3胁迫时间(d )MDA含量（umol/gFW)A B C D E

11、F ck图 1 干旱胁迫对 V3植株叶片 MDA的影响图 2 干旱胁迫对 3#植株叶片 MDA的影响 Fig.1 Effects on the MDA content of V3 under drought stress Fig.2 Effects on the MDA content of 3# under drought stress 2.3.2 干旱处理对诱变植株 CAT活性的影响由图 3、 4可以中看出：材料 V3经 0.3%和 0.6%EMS处理后其 CAT活性分别比对照增加了28.46%和 70.15%（图 3）；材料 3#经 0.1%和 0.6%EMS处理后其 CAT活性分

12、别比对照增加了48.72%和 62.15%（图 4）。干旱胁迫下，叶片中 CAT活性随时间的延长先增加后降低，均在第二天达到最大值。干旱胁迫三天后，材料 3#经 0.1%和 0.6%EMS处理后其 CAT活性分别比对照增加了 48.72%和 62.15%。经 0.1%和 0.6%EMS处理后其 CAT活性依然高于对照。可见，适宜浓度的 EMS处理增加了 CAT的活性，改变了再生苗的酶系统。保护膜系统以适应干旱逆境。 V300.511.522.533.51 2 3胁迫时间(d )CAT活性(umolH2O2g-1FWmin-1)A B C D E F ck3#00.511.522.533.54

13、1 2 3胁迫时间 ( d)CAT活性(umolH2O2g-1FWmin-1)A B C D E F ck图 3 干旱胁迫对 V3植株叶片 CAT活性的影响图 4 干旱胁迫对 3#植株叶片 CAT活性的影响 vFig.3 Effects on the CAT activity of V3 under drought stress Fig.4 Effects on the CAT activity of 3# under drought stress 2.3.3 干旱处理对诱变植株氧化物酶 (POD)活性的影响 POD酶作为植物膜保护酶之一，其活性大小能反映植物抗氧化能力的强弱，能再一定时间

14、内催化有毒物质的分解。从图 5可以看出，越橘材料 V3经 EMS处理后，除 0.4%EMS处理后其 POD活性低于对照，其余各处理均高于对照。随着胁迫时间的延长， POD活性逐渐升高后降低，但是其变化幅度都不大。图 6表明，材料 3#经 0.2%和 0.3%EMS处理后其 POD活性明显高于对照。随胁迫时间的延长， POD活性逐渐下降，部分处理依然高于对照。可见，经 EMS处理后的 M1代植株在干旱胁迫下，部分浓度处理后其 POD活性高于对照，使其 POD酶活性增强，有效的抑制自由基的伤害，增加了其抗旱性。 V3050010001500200025001 2 3胁迫时间(d )POD活性（u

15、/g*min）A B C D E F ck3#05001000150020001 2 3胁迫时间( d )POD活性（u/g*min）A B C D E F ck图 5 干旱胁迫对 V3植株叶片 POD活性的影响图 6 干旱胁迫对 3#植株叶片 POD活性的影响 Fig.5 Effects on the POD activity of V3 under drought stress Fig.6 Effects on the POD activity of 3# under drought stress 2.2.4 干旱处理对诱变植株超氧化物歧化酶（ SOD）活性的影响 SOD酶是植物抗氧化

16、酶系统中主要的保护酶。正常情况下活性较稳定，但在逆境下活性应有所提高，阻止 O2-和 H2O2的积累，缓解膜脂过氧化，减轻自由基对酶系统的伤害。据图 7表明，材料 V3经 0.2%和 0.3%EMS处理后其 SOD活性高于对照，随浓度的增加 SOD活性逐渐减弱。随着胁迫时间的延长， SOD活性先升高后降低，变化幅度小。从图 8可以看出，材料3#经 0.3%EMS处理后其活性高于对照 50.69%。差异显著。干旱胁迫三天后，只有经 0.3%EMS处理后的 M1代植株 SOD活性依然明显高于对照。在干旱胁迫的过程中，一定浓度的 EMS诱变处理后其酶活性始终高于对照，保持较高水平，说明对

17、干旱逆境有较强的忍耐能力。 V301002003004005006001 2 3胁迫时间(d )SOD活性(u/gFW)A B C D E F ck3#0200400600800100012001 2 3胁迫时间(d )SOD活性(u/gFW)A B C D E F ck图 7 干旱胁迫对 V3植株叶片 SOD活性的影响图 8 干旱胁迫对 3#植株叶片 SOD活性的影响 Fig.7 Effects on the SOD activity of V3 under drought stress Fig.8 Effects on the SOD activity of 3# under droug

18、ht stress 3. 讨论化学诱变剂是接触性化学试剂，主要靠其活性基团引起 DNA发生变化，更多在分子水平上形成点突变，形成点突变，对生物分子的影响是局部的或则个别的，因而引发的突变时偶然而不可控制的。本实验结果表明，经过诱变处理的材料，其发生突变的频率，产生抗旱植株的突变并不具有规律性。两种越橘材料对诱变剂的敏感程度也存在一定的差异性，茎尖增值率、生根率随着处理浓度的增大而先升高后降低，表现出一定的特性。本研究中，随着处理浓度不同，其 MDA的含量、 SOD、 POD、 CAT活性变化均有较大差异。在干旱胁迫下其 MDA的含量、 SOD、 POD及 CAT活性变化不同，

19、说明其对逆境的反应也有所不同。部分诱变再生植株叶片中的 SOD、 POD、 CAT活性升高， MDA含量下降，与大多数研究者结论相一致 11、 12。一定浓度的 EMS在相当大程度上能有效抑制 MDA的合成、促进 SOD、 POD及 CAT活性变化，消除其体内活性氧的积累，从而保护其细胞膜结构和功能的完整性，加强了 M1代植株对干旱的适应性和提高了其抗旱能力。 4. 结论当 EMS浓度为 0.2%、 0.3%、 0.5%处理材料 V3和以 EMS浓度为 0.2%、 0.3%、 0.4%、 0.6%处理材料 3#时，干旱胁迫 3天后，干旱胁迫下越橘 M1代植株叶片在相同培养条件下

20、 MDA含量变化幅度均低于对照，当 EMS浓度为 0.3%时，干旱胁迫下再生越橘植株叶片在相同培养条件下 SOD、 POD、 CAT活性均高于对照，因此， EMS浓度为 0.3%时，能加强 M1代越橘植株对干旱的适应性和提高抗旱能力。由此推断这两组材料经浓度为 0.3%EMS诱变处理后可能存在抗旱性较强的突变植株。但是植物的生理变化又是一个相当复杂的过程，仅从生理学指标上讨论可能会造成变异株的遗失，应该采用多项检测。本实验通过诱变作用改变植株的遗传特性 , 再经干旱筛选 , 最后用部分生理指标检测成功获得了可能存在抗旱突变株的处理。下一步的工作是对处理内的单株进行检测

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