1、 Micro RNA 在肝再生中的研究进展 【摘要】 ： 肝脏是人体重要的实质器官，具有合成与储存养料、分泌胆汁、解毒和防御等维持生命活动所必需的多种生理功能。肝脏具有极强的再生能力。随着研究的推进， Micro RNA 在肝病中的作用已成为最近研究热点。 Micro RNA 是类新近发现的内源性调节小 RNA，通过 与靶 基因 的互 补结 合进 而调 控基 因转 录后 的表 达水 平， Micro RNA 参与生物体的生长、发育、疾病和衰老等众多生命过程的各个环节，包括器官发育、物质代谢、细胞分化、凋亡和癌变等等，研究发现生物 体内最少有 30%的基因受到 Micro RNA 的调节， Mi
2、cro RNA 是目前生命科学的研究热点和前沿领域。 【关键词】 ： Micro RNA；肝再生；基因表达调控；靶基因 1、 Micro RNA(mi RNA)概述： Micro RNA(mi RNA)是一类由内源基因编码的长度约为 22 个核苷酸的非编码单链 RNA 分子，广泛分布在病毒、植物到高等哺乳动物中。参与转录后基因表达调控。大量的实验表明它们对多种生物过程起着重要的调控作用 ,包括胚胎发育、癌症发生等。 1.1 Micro RNA(mi RNA)与肿瘤的关系 Mi RNA 分子于 1993 年首先被发现，第一个 mi RNA 分子 lin-4与线虫 lin-14 基因几乎完全反向互
3、补可调节秀丽隐杆线虫的发育周期。 【 1】 目前， mi RNA 已知的功能是在转录后水平调控基因的表达，主要作为基因表达的负调控因子。近年的研究表明， mi RNA 表达失调与多种肿瘤相关，并且这些 mi RNA 可能起肿瘤抑制基因或癌基因的作用 。过去 ,人们一直认为在所有的活体中基因表达的调控是调控蛋白的任务。然而 ,随着越来越多的通过非编码 RNA 实现的转录后调控的发 现 ,转 录后 调控 被认 为在各 种细 胞 过 程中 起着 突出的 调控 作用。有计算表明人类基因组大约三分之二的基因都受到 micro RNA 的调控。 1.2 Micro RNA(mi RNA)在肝病中的研究 M
4、urakami 等 在 2006 年首次对包括慢性乙肝、丙肝、肝硬化及肝细胞癌等肝脏性疾病患者肝组织 mi RNA 表达谱进行了系统比较性分析。研究发现 pre-Micro RNA -18、 Micro RNA -18 和 Micro RNA -224在 HCC 中的表达明显上调，而 Micro RNA -199a、 Micro RNA-195、Micro RNA-200a 和 Micro RNA mi R-125a(P0 001)在 HCC 中的表达明显下调； mi RNA-92、 mi RNA-20、 mi RNA-18 和 pre-mi RNA-18 的表达水平在分化差的 HCC 中最高
5、，在分化良好的 HCC 中最低；而 mi R-199a 的表达水平与分化程度呈正相关。 【 2】 Wang Y 等比较了 157 个mi RNA 在 l9 例肝癌患者肝癌组织与正常肝组织的表达水平，发现 19个上调 mi RNA 与 3 个下调 mi RNA 与肝细胞癌发生相关，其中有 4 种mi RNA mi RNA-199a、 mi RNA-200a、 mi RNA-125a 和 miR-224 的表达水平与 Murakami 的研究结果一致。 【 3】 说明近年来， mi RNA 在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥的作用倍受关注。 Mi RNA 在肝病中的作用越来越重要。 2、肝再生调节机制：
6、 虽然不同肝病的发病机制不完全相同 ,但进展为肝纤维化拥有最终的共同途径 ,即被激活转化为肌成纤维细胞 ,继发纤维组织的大量增生和沉积。目前已知、人和动物肝脏都具有极强的调节自身生长发育和体积大小的能力。 2.1 肝再生过程及激活途径： 大鼠经历肝大部切除后 ,可在术后 14h 内启动肝细 胞 DNA 复制及细胞增殖 ,最终可以在术后 7 10d 的时间内完全修复缺失肝组织 ,而人类在肝脏部分切除术后最初的 7d,残肝也表现出迅速增殖再生反应 ,并能在术后 3 6 个月的期间完全恢复损伤 【 4】 。肝组织损伤后 ,机体能精确地调控肝细胞增殖、生长 ,迅速恢复其原有体积和重量。但肝再生是一个特
7、殊、复杂的细胞增殖过程。肝再生过程大致可以分为三个阶段：早期阶段（启动期），中期阶段（增殖期）和晚期阶段（终止期）。总的来说 ,一般有两条平行的肝再生激活途径 :细胞因子和生长因子依赖的途径。细胞因子与相应受体结合产生细胞内信号从而激活转 录因子。 2.2 肝再生的两个关键环节 从 目 前 的 认 识 看 肝 细 胞 由 G0 期 G1 期 的 转 变 即 感 受 态(competence)形成和 G1 S 期的转变即进展态 (Progression)的调控是肝再生调控的两个关键环节 ,特定的生长因子参与了这两个环节的调控 ,任一步骤缺少一种或几种特定生长因子 ,肝细胞将不能进行增殖而返回 G
8、0 期或进入细胞程序性死亡。 【 7 】 mi RNA 则是通过靶定促进或阻滞细胞周期的关键调节因子，如细胞周期蛋白 (cyclin)一周期素依赖胜蛋白激酶 (CDK)复合体、周期素依赖性蛋白激酶抑制剂 (CDKI)、磷脂酰 肌醇 -3(PI3K)-AKT-m TOR 信号级联或其他细胞生长调节基因，调控细胞周期的进程。如： Mi R-195 通过 cyclin D1、 CDK6 抑制 Rb E2F 信号通路中 Rb E2F 的磷酸化，使 E2F 等转录因子释放减少，从而阻断 G1 期向 s 期转化，抑制肿瘤形成 。 mi R-26a 通过 cyclin D2和 cyelin E2 阻滞细胞周
9、期。 3. 重要 Micro RNA(mi RNA)在肝再生中的重要作用： 近几年科学家发现了许多在肝病中起重要作用的 micro RNA 并阐述了其作用机制，比如 mi RNA-122, mi RNA-376b、 mi RNA-494、mi RNA34a、 mi RNA-127 等以及许多与肝再生相关 micro RNA，丰富了对肝病认识。 3.1： mi RNA-122 在肝病中的作用： mi RNA-122 是最早被发现的、组织特异性表达的 mi RNA 之一，有发现表明它随着小鼠胚胎的发育在肝脏中逐渐被激活。 mi RNA-122是 miRNA 家族的一员，参与肝脏的发育分化、基因表达
10、调控和功能代谢。 mi RNA-122 只在肝脏中特异性表达，并且其表达量占肝细胞总 mi RNA 量的 70 ，是成人肝脏中表达最丰富的 mi RNA。 3.1.1 mi RNA-122 的结构： 有研究结果表明：人 mi RNA-122 基因位于一个肝脏特异性表达的转录单元内，是由一个较长的前体非编码基因转录本通过剪切后产生的。这个前体转录本在进化上序列保守性不高，但其启动子区具有相当高的保守性。 mi RNA-122 前体转录本包含两个外显子和一个内含子，具有一个相当长的 3 UTR，而 mi RNA-122 茎环结构就位于其中。 【 9】 mi RNA-122 前体基因启动子区位于 m
11、i RNA-122 保守茎环序列上游约 5 kb 处，包含多个核受体因子结合序列如 DR 顺式元件和RNA 聚合酶所识别的启动子顺式元件如 TATA box 和 CCAAT box等，利用报告基因系统结合生物信息学分析以及序列删除和突变技术，鉴定这些元件对于 mi RNA-122 基因表达具有重要的调节作用。 3.1.2 mi RNA-122 在肝病中的作用 mi RNA-122)是肝脏特异高表达的 mi RNA。在 CAT-1 m RNA 的弘端非翻译区存在多个 mi RNA-122 的结合位点，它们之间协同调控，可强烈抑制 CAT-1 蛋白的翻译。 【 10】 已观 察到在小鼠肝脏的发育过
12、程中，随着 mi RNA-122 表达量的增加， CAT-1 的表达被抑制，其 mi RNA及蛋白质的含量减少。因此通过检测 CA T-1 可了解 mi RNA-122 在肝脏中特异表达的调控水平。试验表明在小鼠胚胎植入 12 5 d 后的胎肝中即可被检测，出生之前达到表达平台期，在成人的肝细胞中每个细胞表达量达 50 000 拷贝以上 .。 近来的研究发现， mi RNA-122 在肝癌组织中表达下调，同时在肝癌来源的细胞株中也低表达，如 HepG2和 Hep3B 等在药物诱导的小鼠肝癌模型中， mi RNA-122 表达 同样下 调， 在 大 鼠 移 植肝 癌 中 的 变 化也 一 样 这
13、 些研 究 结 果 提 示， mi RNA-122 表达下调是在肝癌发生过程中伴随发生的事件，它是肝癌的一个重要的生物指标。 【 10-11】 3.1.3 mi RNA-122 在肝再生研究中的新进展 Yi Zhang 等 从 动 物 实 验 和 临 床 试 验 两 个 水 平 评 价 了 mi RNA-122 在肝脏损伤性疾病中的诊断意义。研究者构建 D-GalN LPS诱导的肝损伤模型，监测 0 5、 l、 2、 4、 8 小时血浆中 mi RNA-122和 ALT 水平，结果提示 0 5 h 时 mi RNA-122 的表达显著升高 ，而ALT 在 1 h 后才出现异常，提示 mi RN
14、A-122 是一种敏感而且特异性的优秀肝脏损伤标志物。朱华丽等旧在大鼠慢性肝损伤早期和晚期病变模型中发现， mi RNA-122 表达分别下降至正常组的 27.0和5.6 ，指出 mi RNA 在慢性肝损伤早、晚期呈进行性下降，与肝损伤存在密切关系。 【 13-13】 。 Qiu 等发现肝组织特异表达的 mi RNA-1 22可以直接下调 H Bs Ag 和 H Be Ag 两种蛋白表达，同时上调 mi RNA-122和血红素氧合酶 1 有可能成为限制 HBV 复制的一种有效策略。另一方面， Lanford 等 以黑猩猩作为研究对象，让黑猩猩感染 HCV，再利用锁定核酸修饰的反义寡核苷酸 SP
15、C3649，下调体内 mi RNA-122，结果显示 HCV RNA 复制水平明显下降，这些黑猩猩未发现明显不良反应，说明下调 mi RNA 122 可为抗 HCV 治疗策略开辟新领域； 【 14】 同时，通过反义核苷酸技术沉默体内 miR 一 122，也可以改善体内脂肪代谢，对脂肪肝的药物研发也带来希望。所以要是较好控制 mi RNA-122 在肝损伤中的表达，则可降低肝损伤程度并对肝细胞再生创造良好条件。 3.2：其他 micro RNA 在肝再生 中的作用研究 除了 mi R-122 在肝病中的研究较多，现在人们逐渐发起了对其他 micro RNA 的研究，如 mi R-376b、 mi
16、 R-376a、 mi R-494、 mi R-34a、 mi R-127 是最近肝再生 micro RNA 研究热点。其功能在肝再生中的作用研究如下： 3.2.1 mi R-376a 、 mi R-376b 和 mi R-494 的功能研究： Mi R-376b 、和 mi R-494 都 位 于 小 鼠 12 号 染 色 体 的DLK1-GTL2 印记区域内，提示肝再生早期 DLK1-GTL2 印记域内的 mi RNA 簇有共同的调控机制和变化趋势。通过体外增殖实验，证实 mi R-376b 和 mi R-494 均能显著抑制肝细胞增殖。通过 mi RNA 模拟物和 q RT-PCR 的方
17、法，推测 mi R-376b 和 mi R-494 可能分别通过相应靶基因影响肝细胞增殖或凋亡。同时有实验表明在肝癌组织中的表达及其生物学功能的研究在肝癌标本中检测了 mi R-376b 和 mi R-376a的表达水平，发现 mi R-376a 的表达变化趋势更明显，在大多数癌组织中的表达低于其癌旁组织，说明 mi R-376a 表达水平的降低是 肝癌发生发展过程中的一个高频事件。通过对 mi R-376a 在肝癌组织及癌旁组织中的的表达变化与临床指征进行关联，卡方检验结果提示 , mi R-376a 的表达变化与血清甲胎蛋白的水平有关，即血清中甲胎蛋白高的患者其癌组织中的 mi R-376
18、a 的表达水平也较高，由于甲胎蛋白是肝癌诊断的标志物，提示 mi R-376a 可能辅助甲胎蛋白作为肝癌诊断潜在的标志物。 【 15-17】 另有实验发现 mi R-376a mimics 处理 Huh7细胞后 p53 表达升高了，并且 Huh7 细胞中 PIK3R1 被干扰后， p53 表达也升高了。因此 ，我们推测 , mi R-376a 可通过抑制 PIK3R1 的表达而激活 p53 的表达。 3.2.2 mi R-34a 在肝再生中的作用： Mi R-34a 抑制肝癌的侵袭转移。 Mi R-34a 功能研究：通过体外实验，证实 mi R-34a 能显著抑制肝细胞增殖，并且影响肝细胞周期
19、。在细胞学水平通过 q RT-PCR， western blot 和荧光素酶报告基因实验验证 Met 和 inhibin B (INHBB)，证实它们受 mi R-34a 调控。 【 18】INHBB-si-RNA 干扰实验提示 INHBB 可能是一个细胞 增殖促进因子。因此，推测在肝再生晚期，它可能受 mi R-34a 调控而下调，从而有助于肝细胞增殖终止。同时有实验表明肝再生晚期 INHBB 和 Met 显著下调，提示它们在体内也受 mi R-34a 调控。通过染色质免疫共沉淀（ Ch IP） -PCR 实验，我们发现肝再生晚期 mi R-34a 的上调与 P53也密切相关。 3.2. 3
20、： mi R-127 在肝再生中的作用： Mi R-127 具有抑制人肝癌细胞 Huh7 细胞增殖的作用；与癌旁组织相比人肝癌组织中 mi R-127 的表达明显降低，其靶基因 Bcl6 的表达则明显升 高；在人肝癌细胞系 Huh7 细胞中 mi R-127 也具有抑制其靶基因 Bcl6、 Sept7 和 Setd8 的表达的作用；在裸鼠荷瘤模型中证实mi R-127 可以抑制人类肝癌细胞 Huh7 细胞形成的肿瘤的增殖。 【 19-20】说明 mi R-127 在肝再生早期的下调表达通过直接作用于其靶基因Bcl6、 Sept7 和 Setd8 促进了肝再生的启动，在人肝癌中 mi R-127
21、可能通过 Bcl6 促进肝癌细胞增殖。相关研究揭示了肝再生早期过程中的个由 mi RNA 介导的负性调控机制；提示了 mi R-127 在肝癌的诊治中可能具有潜在的应用价 值。 结论和展望： 随着功能基因组学研究的深入，基因表达调控已经逐渐从单个基因点、线性的调控拓展到立体层面上多基因、基因簇乃至整个基因组的调控网络，其中对于 mi RNA 的功能机制研究发展十分迅速。近年来研究人员在 mi RNA 与肝癌等肿瘤发生领域的研究取得了较大进展。同时，肝癌特异性相关 mi RNA 的发现为肝癌基因治疗提供了新靶点，基于 mi RNA 的治疗会涉及到 mi RNA 和其类似物或者抑制剂 (如反义核酸
22、 mi RNA)，从而调控细胞内 mi RNA 与其靶向之间的传递水平，mi RNA 可作为多目标的治疗靶 点，这远远超过只针对单个基因或者蛋白的治疗效果。然而，又将面临着另一种障碍 如何准确靶向传递和维持体内 mi RNA 或者反义核酸 mi RNA 的稳定性，虽然目前正在研究应用脂质链接、化学修饰、特别是硫代磷酸酯、 2 O 一甲基及稳固的核酸序列对核苷酸框架的修饰来克服这种障碍 ，但并不完全成熟。所以尽管 mi RNA 在肝癌等肿瘤学领域的研究取得了一些进展，但仅是冰山一角，仍需进一步的深入研究。 参考文献： 【 1】 Lee RC, Fe inbaum RL, Ambros V. Th
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