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1、 1 分子生物学常用实验技术课堂练习题 参考答案 学号： 姓名： 一、填空题。 1. 在用 SDS分离 DNA时，要注意 SDS浓度， 0.1%和 1%的 SDS作用是不同的，前者 ，后者 。 2. SDS 是一种提取 DNA 时常用的阴离子去污剂，它可以溶解膜蛋白和脂肪，使细胞膜和核膜破裂，使核小体和核糖体解聚，释放出 。它还可以使蛋白质变性沉淀，也能抑制 。 3. 在分离 DNA 时，需要带手套操作，是因为 。 4. 用酚 -氯仿抽提 DNA 时，通常在氯仿或酚 -氯仿中加入少许异戊醇，这是因为 有机溶剂 异戊醇可以 。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含 DNA的水相、中间的变性蛋白

2、质相和下层有机溶剂相维持稳定。 5. 在分离 DNA 时，要用金属离子螯合剂，如 EDTA 和柠檬酸等，其目的是： 。 6. 在 DNA 分离过程中，造成 DNA 分子断裂的因素很多，主要有： 、 和 。 7. 在分离 DNA 时，常用 酸变性、碱变性、热变性和 来去除蛋白质。 8. 用乙醇沉淀 DNA 的原理是： 。 9. 用乙醇沉淀 DNA 时，通常在 DNA 溶液中加入单价阳离子，如氯化钠和乙酸钠，其目的是 。 10. 通常可在 3 种温度下保存 DNA： 4 5、 -20和 -70，其中以 为好。 11. 浓缩 DNA 的方法通常有：包埋吸水法、蒸发法、膜过滤法和 。 12. 碱裂解法

3、和清亮裂解法是分离质粒的两种常 用方法，二者的原理不同，前者是根据 ，后者是根据 。 13. 在 技术中， DNA 限制性酶切片段经凝胶电泳分离后，被转移到硝酸纤维素薄膜上，然后与放射性标记的 DNA 探针杂交。 14. SSC 是氯化钠和柠檬酸钠组成的试剂， 其中前者作用是： ，后者的作用是： 。 15. 在 southern 杂交中 ， DNA 转移的速度取决于 、 和 。 16. 在重蒸酚中加入 1%的 8-羟基喹啉及少量 -巯基乙醇，不仅可以防止酚氧化，还可以抑制 2 活性 以及 。 17. RNA 分子经凝胶电泳后按大小不同分开，然后被转移到一张硝酸纤维素膜（尼龙膜）上，同一放射性

4、DNA 探针杂交的技术称 _ _。 18. 根据 Northern 杂交结果可以说明 _ _。 19. cDNA 技术是进行真核基因克隆的一种通用方法，因为它可以用 为模 板。 20. 将含有一个 mRNA 的 DNA 拷贝的克隆称为一个 ，源于同一批 RNA 制备物的克隆群则构建成了一个 。 21. 受体细胞的感受态是 的生理状态。 22. 感受态细胞是可以诱导的，诱导方法有 、 和 等。 23. 人工感受态细胞的大肠杆菌在温度为 时吸附 DNA，在 时摄入 DNA。 24. 为了提高重组 DNA 分子对 E . coli 的转化效率，通常可采取 和 。 25. 环 状 质粒的转化效 率很低

5、，通常是 线性双链 DNA 转化效率的 。 26. Sal是识别 6 个核苷酸的酶，其识别切割的理论值是每 个碱基就有一个切点，但在哺乳动物中大约 300Kb 个碱基才有一个切点。 27. 重组 DNA 技术常用的限制性内切核酸酶可识别某些特异碱基序列，具有 结构。 28. 产生平末端的方法通常有： 、 和 。 29. 在酶切反应管加完各种反应物后，要离心 2 秒，其目的是： 和 。 30. 连接酶是一类用于核酸分子连接形成 的核酸合成酶，有 DNA 连接酶和 RNA 连接酶之分。 31. 为了防止 载体 DNA 自身环化，可用 脱去双链 DNA 的 。 32. 用于克隆的 DNA 片段，在质

6、量上要求： 1）稳定性，保持其分子构型； 2）低蛋白质含量； 3）纯度要高，不含 ； 4）不含可透析的小分子，如酒精等。 33. 构建基因 组文库 时连接 方法主 要是 ；而构建 cDNA 文库，可用 或 。 34. 克隆一 个编码某种蛋白质的基因必须考虑其表达的三个基本条件： 、 和 。 3 二、判断题。 1. 氯霉素扩增 DNA 时，加氯霉素的时间是重要的，因为加得太早，菌数不够，加人时间过迟，菌龄过老，容易自溶。 （ ） 2. 在 DNA 贮存液中加一滴三氯甲烷，可防止真茵的污染。 （ ） 3. DNA、 RNA 在 pH8.5 的 TAE 缓冲夜 中 电泳时， 由正极向负极移动。 （

7、） 4. 作为一个基因克隆的载体，主要由药物抗性基因、供插入外源 DNA 片段的多克隆位点和外源片段插入筛选标志这 3 大部分构成。 （ ） 5. 用 pUC 质 粒作克隆载体克隆 DNA 时，人们用显色法筛选重组质粒，即在有 IPTG 和 X-gal 的平板上，显示白色的菌落含有原始质粒，而显示蓝色的菌落含有重组质粒。 （ ） 6. 在克隆载体 pUC 系列中，完整的 lacZ 基因提供了一个外源基因插入的筛选标记，蓝色的转化菌落通常表明克隆是失败的。（ ） 7. 在克隆载体 pBSK 质粒中，利用完整的 lacZ 基因作为筛选标记， 白色的转化菌落表明重组质粒肯定插入外源片段。（ ） 8.

8、 X-gal 显色反应的基本原理是使载体与受体互补的失活。（ ） 9. 碱法和煮沸法分离质粒 DNA 的原理是不同的。（ ） 10. 根据构建方法 的不同，基因文库分为基因组文库、 cDNA 文库等。 （ ） 11. 一旦有了一套已知序列的基因组克隆，通过从文库中获得覆盖目的突变基因所在 基因组区的所有克隆，就可以进行染色体步移。（ ） 12. 核酸杂交的原理是根据分子间杂交。（ ） 13. 在 Northern 杂交中，为了防止 RNA 形成部分发夹结构，影响迁移率，所以要用变性缓冲液进行电泳。（ ） 14. 用限制性内切核酸酶 Bgl（识别位点是 A GATCT）酶切载体 DNA，用 Ba

9、mH（识别位点是 G GATCC）酶切供体 DNA，可以直接通过粘性末端进行连接。（ ） 15. 不匹配的粘性末端可以通过部 分填补或补平后进行连接。 （ ） 16. 单克隆抗体是淋巴细胞和瘤细胞杂交后形成的单个杂交瘤细胞经无性繁殖而生特异性抗体。（ ） 17. 基因组学强调从基因组的整体而不是单个基因的角度把握生物体遗传变异的规律。 （ ） 18. 利用足够数量的 STS 标签，可确定所有 DNA 大片段在染色体或基因组中的位置。 （ ） 19. clone contig 法的原理是首先用酸水解法把待测基因组降解为数 10 万碱基对以上的片段，再分别对各片段进行测序。 （ ） 20. 靶标鸟

10、枪法首先根据染色体上已知基因或遗传标签的位置来确定部分 DNA 片段的排列顺序，再逐步确定各片段在染色体 上的相对位置。 （ ）4 三、单项选择题。 1. 乙醇沉淀 DNA 时，下列何种长度的核苷酸不能被沉淀？ _ A、 10bp； B、 100bp； C、 200bp； D、 1000bp。 2. 用碱法分离质粒 DNA 的基本原理是： _ A、染色体 DNA 断裂成碎片； B、染色体 DNA 分子量大，不能释放； C、染色体 DNA 变性后来不及复性； D、染色体 DNA 未与蛋白质分开而沉淀。 3. Southern 杂交可检测 _： A、 目的 基因的 表达丰度 B、基因组中目的基因

11、的存在 C、蛋白质表达 D、目的基因是否表达 4. 蛋白质双向电泳中， _决定了 SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率。 A、等电点 B、相对分子量 C、空间结构 D、电荷量 5. 粘末端连接法，不仅操作简单，而且 _ A、产生新切点； B、易于回收 外源片段； C、载体不易环化； D、影响外源基因表达。 6. 下面哪一种 不是 产生限制性内切酶星号活性的主要原因： _ A、酶切反应体系中酶浓度过低； B、甘油含量过高； C、酶切反应体系中含有有机溶剂 ； D、含有非镁离子的二价阳离子。 7. 关于 cDNA 的最正确的提法是： ( ) A、 同 mRNA 互补的单链 DNA ； B、 同

12、 mRNA 互补的双链 DNA； C、以 mRNA 为模板合成的双链 DNA； D、 以上都正确 。 8. 在分离 mRNA 的溶液中， Mg2+离子的浓度不能低于 0.5m mol/L，因为低了 _ A、 mRNA 会降解 ； B、 mRNA 会沉淀 ； C、核搪体解体； D、 mRNA 会变性 。 9. 关于类限制性内切酶的作用，下列不正确的是： _ A、识别序列长度一般为 4-6bp； B、识别序列 通常 具有 回文结构； C、识别和切割双链 DNA 分子； D、只能切割非甲基化序列。 10. 有关 PCR 的描述下列哪项不正确？ _ A、是一种酶促反应； B、引物决定了扩增的特异性；

13、C、扩增的对象是 DNA 序列； D、扩增的对象可以是氨基酸。 11. PCR 试验的特异性主要取决于： _ A、 DNA 聚合酶的种类； B、反应体系中模板 DNA 的量； C、引物序列的长度和结构； D、 PCR buffer 中的镁离子浓度 12. 蓝白斑试验筛选时，加入 IPTG 的作用是： _ A、诱导肽的合成； B、作为酶作用的底 物； C、诱导肽的合成； D、作为显色反应指示剂。 13. 基因敲除（ knock out）方法主要用来阐明： _ A、 基因的结构； B、基因的调控； C、基因的表达； D、基因的功能。 5 14. _利用单链小 RNA 高效、特异性降解细胞内同源 m

14、RNA，从而阻断体内靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。 A、 RNA 干扰技术 ； B、 原位杂交技术 ； C、 RACE 技术 ； D、点突变技术 。 四、名词解释。 1. 载体： 2. 限制性核酸内切酶： 3. cDNA：互补 DNA，指以 mRNA 为模板反 转录得到的 DNA。 4. 聚合酶链反应（ polymerase chain reaction, PCR）： 5. RT-PCR (reverse transcription PCR)： 以 mRNA 为模板先逆转录合成 cDNA，再以 cDNA 为模板进行聚合酶链式反应。 6. Real-time PCR： 7. cDNA

15、文库（ cDNA library）： 8. 基因文库（ gene library）： 9. 定点突变技术（ site-directed mutagensis）： 10. 酵母单杂交系统（ yeast one-hybrid system）： 提示：该系统目的 ：用于鉴定 DNA 和蛋白质之间的相互作用。 11. 酵母双杂交系统（ yeast two-hybrid system）： 提示：该系统目的：鉴定反式作用因子之间的相互作用对真核基因转录调控的影响。 12. 凝胶阻滞试验（ electrophortic mobility shift assay, EMSA; gel retardation）

16、： 13. RACE（ Rapid amplification of cDNA End）技术： 14. RNA 干扰 （ RNA interference， RNAi）： 15. 核酸杂交 ， southern blotting， Northern blotting， western blotting 16. 转化 17. DNA 芯片 18. 基因组学 19. 功能基因组学 20. 比较基因组学 （ comparative genomics） 21. 蛋白质组学 22. 转录谱（ expression profiling） 23. 表达序列标签（ expressed sequence tag

17、, EST） 6 五、简答题： 1. 在分离 DNA 过程中，为什么苯酚和氯仿联合使用？即使不联合使用也要在苯酚抽提后用氯仿再抽提一次？ 提示：原因是酚和水有一定程度的互溶，所以单独使用酚抽提 DNA，最终不能除去酚，残留的酚会使限制性核 酸内切酶 、 Taq 酶 和连接酶变性 ，影响后续试验 。 氯仿也是蛋白质变性剂，它不与水互溶，但它与苯酚互溶。这样，两者联合使用，可让 DNA 溶液中没有残留酚。 2. 比较说明 SDS-PAGE（ SDS-聚丙烯胺凝胶电泳）与琼脂糖凝胶电泳的分离原理和特点。 提示 ： SDS-PAGE： 1） SDS 作用 ； 2） 分子筛 ； 3） 主要用于蛋白质的定

18、性分析、分离。琼脂糖凝胶电泳： 1）凝胶的孔径； 2）用于蛋白质和核酸电泳， 双链 DNA 的电泳迁移率主要与其分子大小有关。 3. 简述 PCR 扩增的原理及过程。 提示： PCR 技术的基本原理：在模板、引物、 4 种 dNTP 和赖耐热 DNA 聚合酶存在的条件下，按照碱基互补配对的原则，特异扩增 DNA 区段。 PCR 的过程：变性 -退火 -延伸， 三个基本步骤循环 。 4. 什么是蓝白斑筛选？为什么蓝白斑筛选法也会有假阳性？ 提示： 该法是 利用组织化学的方法，通过插入失活来筛选重组体。 原因是： -半乳糖苷酶的 N端不是必须的， 对其修饰不会影响酶的活性或肽的互补性。如果插入的外

19、源片断引起肽ORF 的移码，或外源片断含有终止密码使得肽不表达，就会形成白色斑。如果插入的片断不含终止密码、是 3 的倍数，仍然会形成蓝色斑。 5. 酵母单杂交的原理。 很多真核转录 调控因子有两个相互独立的结构域组成： DNA 结合域（ DNA binding domain, BD）和转录激活域 (activation domain, AD)。 BD 能和特定的基因的启动子区结合，但不能接获基因的转录。 酵母单杂交是一种研究 DNA 和蛋白质互相作用的系统，运用基因重组技术将特定顺式作用元件构建到基本启动子上游，把报告基因连接到基本启动子下游。 将待测转录因子 cDNA 与已知酵母激活域（

20、AD）融合表达载体转入酵母，如果待测转录因子能和顺式作用元件结合，就能激活基本启动子，从而激活报告基因的表达 。 6. 现已知一种蛋白因子可以与 DNA 上的一段 100bp 的专一序列结合，请设计出克隆这种蛋白因子的 cDNA 的基本技术路线。 提示：酵母单杂方法。 7. 从 GenBank 中查到某一基因的 cDNA 序列，如何得到该基因的内含子序列？ 提示：根据 cDNA 序列设计引物，以基因组 DNA 为 模 板 PCR，产物测序后， 序列 比对。 7 8. 从 GenBank中查到某一基因的完整 ORF序列 ， 如何得知其 mRNA的加帽和加尾信息 ？ 提示： 5-RACE 和 3-

21、RACE。 9. 转录因子一般具有转录激活域和 DNA 结合域，简述它们的作用。 DNA 识别或结合域能和特 定的基因的启动子区结合，但不能接获基因的转录。对各种转录因子的序列进行比较，可发现其基序 (motif)的共同点是都与 DNA 结合。基序通常很短，仅为蛋白质结构中的一小部分。在蛋白质与转录装置相互作用中，负责激活转录的基序可以被鉴定出来。 转录激活结构域可以在适当的空间激活转录。 10. 简述凝胶阻滞试验（ EMSA）的原理。 EMSA 是体外分析 DNA 与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术，用放射性同位素标记待测 DNA 片段，然后与提取物温育，形成 DNA-蛋白质复合物，电

22、泳后用放射性自显影技术可以确定 DNA 条带的位置， 从而确定它与蛋白质是否结合。基本原理： 蛋白质与 DNA 结合后，将大大增加 DNA 分子量，在凝胶电泳中， DNA 朝正电极移动的距离与其相对分子量成正比。没有结合蛋白质的 DNA 移动较快，结合了蛋白质的 DNA 由于受到阻滞移动较慢。 11. 现在已知一个基因的启动子序列（包括其顺式作用元件和基本启动子），如何找到调控该基因表达的 反式作用因子 ？ 提示：有 多种方案。 EMSA 是其一。 12. 简述 sanger DNA 测序法的原理和基本过程。 双脱氧测序法 原理： 2,3-ddNTP 与普通 dNTP 不同之处在同它们在脱氧核

23、糖的 3 位置缺少 一个羟基 ， 可以在 DNA 聚合酶作用下通过其 5 三磷酸基团掺入到正在增长的 DNA 链中，但由于没有 3羟基，它们不能同后续的 dNTP 形成磷酸二酯链，因此，正在增长的 DNA 链不可能继续延伸。 核酸模板在核酸聚合酶、引物、 4 种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管独立的酶反应系统中分别按比例引入 4 种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。 如此每管反应体系中便合成以共同引物为 5端，以双脱氧碱基为 3端的一系列长度不等的核酸片段，其长度取决于从用以起始 DNA合成 的引物末端到出现过早链终止的位置之间

24、的距离。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段 (长度相邻者仅差一个碱基 )，根据片段 3端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序 。 基本过程： 1） 分离待测核酸模板，模板可是 DNA，也可 是 RNA，可是双链，也可 是单链。 2） 在 4 只试管中 分别 加入适当的引物、模板、 4 种 dNTP(包括放射性标记 dATP，例如 32P 标记的 dATP 和 DNA 聚合酶（如以 RNA 为模板，则用反转录酶），再在上述4 只管中分别加入一种一定浓度的 ddNTP(双脱氧核苷酸 )。 3） 与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理 )结合的引物，在 DNA 聚

25、合酶作用下从 5端向 3端进行延伸反应， 32P随着引物延长掺入到新合成链中。当 ddNTP 掺入时，由于它在 3位置没有羟基，故不与下一个 dNTP 结合，从而使链延伸终止。 ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的 DNA 链。 4） 用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离 4 只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种 ddNTP(如 ddATP)，则该管中各种长度的 DNA 都终止于该种碱基 (如 A)处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的 DNA 3 末端都为同一种双脱氧碱基。 5） 放射自显影。根据四泳道的编号和每个泳道中 DNA 带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的

26、新链序列。 8 13. 如何用 PCR 法获得点突变 DNA 分子？ 指通过 聚合酶链式反应 （ PCR）等方法向目的 DNA 片段中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括 碱基 的添加、删除、点突变等。 采用具有互补末端的引物，使产物形成了重叠链从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。 该技术主要包括以下几步：设计引物，扩增基因两端，回收两端片段，两端片段退火 延伸，扩增全长基因。 实验步骤： 1） 引物设计 ： 引物 F 及 R 为基因两端特异引物，其中 Fm 及 Rm 为中间引物。其中引物 Fm及 Rm 中间共享一段序列（至少 10bp 完全匹配

27、，否则后续实验很难成功），突变点可以设计在 Fm 或 Rm，也可以两条引物上都有突变点 ； 2） 分别用引物 F 和 Rm 及 Fm 和 R 进行配对用 pfu 酶进行 PCR； 3） 分别用胶准确回收第 2 步所得两条目的 PCR 产物带 ； 4） 将第 3 步所得两份 PCR 产物进行混合使其互为模板及引物，加入 dNTP 及 Pfu 或Taq 酶进行 5-10 轮 PCR。 5） 取第 4 步 PCR 产物做为模板，加入引 物 F 及 R 进行 PCR 扩增出具有突变的全基因。 14. 什么是 RNAi？试述其应用和发展前景。 RNAi (RNA interference) 即 RNA

28、干涉，是由双链 RNA（ dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象 ,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。 或是 RNAi 是有dsRNA 参与指导的，以外源和内源 mRNA 为降解目标的转基因沉默现象 。应用： 1） RNAi 方法在植物遗传及发育等研究领域得到广泛的应用。 通过 基因敲除来 调控某个代谢途径的关键基因， 筛选 出目的 性状 改良的个体 ，如抗病或耐旱 植株 。 Gutterson 等敲除了康乃馨的一种激素，使花期延长。多聚半乳糖醛激酶在西红柿成熟时消化细胞壁， Zenera 实验室将它敲除后，西红柿可晚一些采摘，味道变得更为鲜美。 2） RNAi

29、 是研究 候选基因功能、 信号转导通路 的新方法 。 从大规模数据库中获得全基因组序列，找到感兴趣基因的序列，据此设计出使该基因沉默的 dsRNA， 研究该候选基因沉默或下调后的性状表现，从而探讨该候选基因的功能 。 Clemens 等应用 RNAi 亦研究了果蝇细胞系中胰岛素的信号转导通路 。 15. 获得一个功能未知的基因克隆后，怎样才能阐述该基因的功能？ 提示：对此 基因进行定位，运用基因敲除或 RNAi 技术封闭此基因，寻找蛋白表达的差异和生物体遗传表型的差异，通过研究荧光探针定位此蛋白的分布，通过研究蛋白与蛋白相互作用确定其在细胞中的功能。 16. 如果知道某基因的功能及其相应得蛋白

30、质的氨基酸序列组成，可以通过何种方法克隆该基因？ 提示： 可以通过合成核苷酸探针或设计兼并 PCR 引物从基因组文库（或 cDNA）文库中筛选。或者利用相应的抗体从 cDNA 表达文库中筛选相应的克隆。 17. 常用的基因表达研究技术有哪些？ 18. 什么是遗传图谱？ 答案 1： 遗传图又称为连锁图，是指标志基因或 DNA 在染色体 上的相对位置与遗传距离，后者通常以基因或 DNA 片段在染色体交换过程中的分离频率（厘摩， cM ）来表示， cM 值越大，两者之间距离越远。遗传图的绘制方法是以染色体上某一点为遗传标记，以与之相伴的遗传特征为对象，经连锁分析，测定遗传距离，将编码该特征的基因定位

31、于染色体特定位置。连锁分析的实质是通过分析同一遗传位点在不同个体中等位基因的不同来研究同一染色体上两个位点之间的相互关系，科学上用减数分裂过程中这两个位点之间的交换或重组频率来表示其9 遗传学距离。 答案 2： 通过遗传重组所得到的基因在具体染色体上线性排列图称 为遗传连锁图。它是通过计算连锁的遗传标志之间的重组频率，确定他们的相对距离，一般用厘摩 (cM，即每次减数分裂的重组频率为 1%)来表示。绘制遗传连锁图的方法有很多，但是在 DNA 多态性技术未开发时，鉴定的连锁图很少，随着 DNA 多态性的开发，使得可利用的遗传标志数目迅速扩增。早期使用的多态性标志有 RFLP(限制性酶切片段长度多

32、态性 )、 RAPD(随机引物扩增多态性 DNA)、AFLP(扩增片段长度多态性 )； 80 年代后出现的有 STR(短串联重复序列，又称微卫星 )DNA 遗传多态性分析和 90 年代发展的 SNP（ 单个核苷酸的多 态性 ） 分析。 19. 什么是物理图谱？ 答案 1： 物理图是指以已知核 苷 酸序列的 DNA 片段（序列标签位点， 即 STS；或是 一类染色体定位明确且可用 PCR 扩增的单拷贝序列）为“路标”，以碱基对 ( bp , kb , Mb ）作为基本测量单位（图距）的基因组图。 答案 2： 物理图谱是利用限制性内切酶将染色体切成片段，再根据重叠序列确定片段间连接顺序，以及遗传标

33、志之间物理距离碱基对 (bp) 或千碱基 (kb)或兆碱基 (Mb)的图谱。以人类基因组物理图谱为例，它包括两层含义，一是获得分布于整个基因组 30 000 个序列标志位点（ STS，其定义是染色体定位明确且可用 PCR 扩增的单拷贝序列）。将获得的目的基因的 cDNA克隆，进行测序，确定两端的 cDNA 序列，约 200bp，设计合成引物，并分别利用 cDNA 和基因组 DNA 作模板扩增；比较并纯化特异带；利用 STS 制备放射性探针与基因组进行原位杂交，使每隔 100kb 就有一个标志；二是在此基础上构建覆盖每条染色体的大片段：首先是构建数百kb 的 YAC(酵母人工染色体 )，对 YA

34、C 进行作图，得到重叠的 YAC 连续克隆系，被称为低精度物理作图，然后在几十个 kb 的 DNA 片段水平上进行，将 YAC 随机切割后装入 粘粒的作图称为高精度物理作图。 遗传图表现得是通过连锁分析确定的各基因间的相对位置；物理图表现的是染色体上每个DNA 片段的实际顺序。 20. 什么是图位克隆？ 图位克隆 (Map - based cloning) 又称定位克隆 (positional cloning)， 1986 年首先由剑桥大学的 Alan coulson 提出 。 用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的 ， 无需预先知道基因的 DNA 顺序 ， 也无需预先知道其表达

35、产物的有关信息 ， 但应有以下两方面的基本情况 ： 一是有一个根据目的基因的有无建立起来的遗传 分离群体 ,如 F、 DH、 BC、 RI 等 。 二是开展以下几项工作 ： 1) 首先找到与目标基因紧密连锁的分子标记 ； 2) 用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体的特定位置 ； 3) 构建含有大插入片段的基因组文库 (BAC 库或 YAC) ； 4) 以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库 ； 5) 用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群 ； 6) 通过染色体步行、登陆或跳跃获得含有目标基因的大片段克隆 ； 7) 通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆 ； 8) 通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列。