1、 1、基因：是遗传的物质基础，是 DNA（脱氧核糖核酸）分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的 DNA 分子片段。 2、基因组该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部 DNA 分子 3、操纵子 :原核生物的几个功能相关的结构基因往往排列在一起，转录生成一个 mRNA，然后分别翻译成几种不同的蛋白质。这些蛋白可能是催化某一代谢过程的酶，或共同完成某种功能。这些结构基因与其上游的启动子，操纵基因共同构成转录单位，称操纵子。 4、启动子 :是 RNA 聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，包括至少一个转录 起始点。在真核基因中增强子和启动子常交错覆盖或连续。有时，将结构
2、密切联系而无法区分的启动子、增强子样结构统称启动子。 5、增强子 :是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，最早是在 SV40 病毒中发现的长约 200bp 的一段 DNA，可使旁侧的基因转录提高 100 倍，其后在多种真核生物，甚至在原核生物中都发现了增强子。增强子通常占 100 200bp 长度，也和启动子一样由若干组件构成，基本核心组件常为 8 12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。 6、基因表达： 是指细胞在生命过程中，把储存在 DNA 顺序中遗传信息经过转录和 翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。 1、说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。 答：限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则
3、 ,即属名 +种名 +株名的各一个首字母 ,再加上序号 . 基本原则 : 3-4 个字母组成 ,方式是 :属名 +种名 +株名 +序号 ; 首字母 : 取属名的第一个字母 ,且斜体大写 ;第二字母 : 取种名的第一个字母 ,斜体小写 ;第三字母 : (1)取种名的第二个字母 ,斜体小写 ;(2)若种名有词头 ,且已命名过限制酶 ,则取词头后的第一字母代替 .第四字母 : 若有株名 ,株名则作为第四字母 ,是否大小写 ,根据原来的情况而定 ,但用正 体 . 顺序号 : 若在同一菌株中分离了几种限制酶 ,则按先后顺序冠以 I, , , 等 ,用正体 . 2、什么是限制性内切核酸酶的星号活性？受哪些
4、因素影向？ 答：类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星号活性。概括起来，诱发星活性的因素有如下几种： (1)高甘油含量 (5 , v v)； (2)限制性内切核酸酶用量过高 (100U ugDNA)； (3)低离子强度 (100U/ g）、高浓度的甘油（ 5%）、低离子强度（ pH8.0)等，会使一些核酸内切酶的识别和 切割序列发生低特异性，即所谓的
5、 star activity 现象 . 抑制 star activity 的措施 减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度 保证反应体系中无有机溶济或乙醇 提高离子强度到 100 150mM 降低反应 pH 至 pH7.0 使用 Mg2+作为二价阳离子 DNA 连接酶 需要在一条 DNA 链的 3 -末端具有一个游离的羟基 (-OH)，和在另一条 DNA 链的 5 -末端具有一个磷酸基团 (-P)，只有在这种情况下，才能发挥其连接 DNA 分子的功能作用。 体外连接 DNA 片段的方式 黏性末端 同 种内切酶产生的黏性末端的连接，同尾酶产生的黏性末端的连接，不同黏性末端的连接。平末端的直接连接
6、，末端修饰后的连接，加上连杆（ linker ），使之形成黏性末端后，再用 DNA 连接酶连接，DNA 接头 (adapter)连接法。 平末端 DNA 片段的连接 （ 1）直接用 T4DNA 连接酶连接；（ 2）先用末端核苷酸转移酶，给平末端 DNA 分子加上同聚物尾巴之后再用 DNA 连接酶进行连接；（ 3）用连杆连接平末端 DNA 分子；（ 4） DNA 接头连接法。 载体应具备的条件 1.具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性 2. 具有与特定受体细胞相适 应的复制位点或整合位点 3. 具有多种单一的酶切位点 4.具有合适的选择性标记 自我复制表达，外源基因的插入不影响其功能的发挥，易于从宿
7、主细胞分离出来 5.分子量尽可能小，以提高其载装能力 质粒 DNA的复制类型 严谨型质粒 松弛型质粒 天然质粒的缺陷 （ 1）分子量大，拷贝数低（ 2）筛选标志不理想 构建质粒克隆载体的基本策略 1 能在受体中进行有效的复制（有复制起始位点）。 2 含多克隆位点 3 含有供选择克隆子的标记基因，如：常用的标记基因： Apr， Kmr， Smr， Tcr 基因等 4 DNA 分子尽可能小和较高的拷贝数。 5 根据特殊 需要，组装各种“元件”，构建不同用途的质粒克隆载体。 质粒克隆载体的构建 1选择合适的出发质粒 2正确获得构建质粒克隆载体的元件 3组装合适的选择标记基因 4选用合适的启动子 5
8、构建过程力求简单 DNA 插入而导致基因失活的现象，称之为 插入失活效应。 蓝白斑筛选 Ampicillin 抗性和 lacZ -半乳糖苷酶能把无色的化合物 Xgal 分解成半乳糖和一个深蓝色的物质 5-溴 -4-氯靛蓝 Ti 质粒介导转化的过程 根癌农杆菌对植物细胞的识别和附着根癌农杆菌对植物信号物质的感受根癌农杆菌 Ti质粒上的 vir 基因以及染色体上操纵子的活化 vir 区基因被激活， virD 基因编码的核酸内切酶分别将 T-DNA的 RB 序列和 LB 序列切出单链切口，释放出 T-DNA 的单链线性拷贝， T-DNA 复合体的产生 T-DNA 复合体在 RB 序列的引导下定向地穿
9、过农杆菌的细胞膜、细胞壁、进入植物细胞壁并整合到植物的染色体基因组中 TA 克隆的优点 不需使用含限制酶序列的引物，不需把 PCR 产物做平端处理，不需在 PCR 扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。 TA 克隆注意事项 1.要获得目的基因的 TA 克隆， PCR 产物的特异性要好。 2. PCR 产物在 TA 克隆前要通过纯化。 3. 在 PCR 产物回收、纯化过程中防止外来 DNA 污染。 真核生物的启动子： 真核生物有三种类型的 RNA 聚合酶，每一种都有对应的启动子 。 1.RNA 聚合酶 I 只转录 rRNA，故只有一种启动子。 2.RNA 聚合酶 II 转录 mRNA，其启动子最为
10、复杂； 3.RNA 聚合酶 III 转录 tRNA 和 5S rRNA，其启动子大都是位于转录的 DNA 序列之内，称为下游启动子。 目的基因的获得 :直接分离法 ;PCR 扩增 ;构建基因组文库法 ;构建 cDNA文库法 ;化学合成法 直接分离法 : 限制酶酶切法 (DNA 分子已测 序 /目的基因已定位 ) 基因组文库的构建 (DNA 未测序或未定位 )： 采用限制酶切割，构建基因组文库，筛选目的基因克隆 基因文库构建的一般步骤：（ 1）染色体 DNA 大片段的制备 酶切法物理切割法 （ 2）载体与基因组 DNA 大片段的连接粘性末端直接连接人工接头法 （ 3）转导受体（ 4）筛选重组子
11、cDNA： 以 mRNA为模板合成的互补脱氧核糖核苷酸序列。 cDNA 文库： 某种生物基因组转录的的全部 mRNA 经反转录产生的各种 cDNA 分别与克隆载体重组，贮存在一个受体菌的群体中，这个群体就称为 cDNA 文库 。 cDNA 文库与基因 组文库的区别在于 cDNA 文库是 有时效性 的。 cDNA 文库的特点优点： 分离的目的基因可直接用于表达；比 DNA 文库小的多，容易构建 缺点： 只与编码序列有关；不能反映内含子；不能反映启动子、终止子以及与核糖体识别的序列 构建 cDNA文库的一般步骤：（ 1）总 RNA（ total RNA）提取 （ 2） mRNA 的分离纯化 原理
12、： 利用 mRNA 都含有一段 polyA 尾巴，将 mRNA 从总 RNA（ rRNA、 tRNA 等）中分离纯化。 mRNA 的分离纯化 Column（柱） （ 3） cDNA 的合成 cDNA 第一链合成降解 mRNA 模板 cDNA 第二链合成（ cDNA 第二链合成的方法有四种，自身引导合成法，置换合成法，引导合成法和引物衔接头合成法。 （ 4） cDNA 与载体连接： （ 5） 噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化（导入宿主中繁殖） 基因的化学合成： 寡核苷酸单链的化学合成 ； 探针的化学合成 ； 连接子和接头的合成 ； 基因的半合成 ； 全长基因化学合成 目的基因的分离：目的序列已
13、知： 一般采用 PCR 技术或分子杂交技术分离克隆目的基因 目的序列未知： 差异表达序列；无差异表达的目的序列，可采用文库筛选法、功能蛋白分离法、序列克隆法 基因克隆的方法：一、目 的基因的功能克隆二、 序列克隆法三、差别杂交法四、减法杂交技术五、 mRNA 差别显示技术 功能克隆 ：根据已知基因的产物推断出其相应核苷酸序列，再根据此序列合成寡核苷酸探针，从 cDNA 文库或基因组文库中调取目的基因 表型克隆 ：如差异筛选法、差减杂交（ SH）、 mRNA 差别显示技术（ DDRT-PCR）、代表性差异分析（ RAD）、抑制型差减杂交（ SSH）等。无基因序列及表达功能信息，但具有基因遗传图，
14、转座子标签等条件，常用图位克隆和转座子标签法克隆 目的基因的功能克隆： 在纯化相应的编码蛋白后构建 cDNA 文库或基因组文库 ，然后从文库中筛选目的基因 1、根据特异蛋白分离目的基因： 分离、纯化目的蛋白，测定特异的氨基酸顺序，推测编码该蛋白的核苷酸序列，人工合成一段寡核苷酸探针，从 cDNA 文库或基因组文库中筛选编码基因，分离、纯化目的蛋白，目的蛋白免疫动物，制备抗体，从 cDNA 表达文库中筛选目的基因 根据特异蛋白分离目的基因局限性： 特异蛋白已鉴定并分离纯化，某些基因产物，难以分离纯化，非所有基因有蛋白质产物，遗传密码的简并性。 2、功能互补法克隆基因： 利用被克隆的外源片段与宿主
15、细胞染色体 DNA 具有功能互补。 筛选营养缺陷型互补基 因 序列克隆法 ：根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因；采用核酸探针杂交筛选或用 PCR 技术进行分离 差别杂交法： 组织 特异性表达 或特定发育阶段表达的基因；受生长因子调节的基因；经特殊处理诱导表达的基因 应用前提： 基因在两种不同的细胞群体中的差异性表达（一个细胞群体中正常表达，另一个细胞群体中目的基因不表达）。 基本过程： 制备两种细胞群体的的 mRNA 提取物 ； 以两种总 mRNA 或 cDNA 为探针 ； 以表达目的基因的细胞群体构建 cDNA文库 局限性： 灵敏度比较低，不适于低丰度 mRNA 目的基因分离，需要筛
16、选大量的杂交 滤膜，鉴定大量的噬菌斑，差别杂交重复性较差，不同滤膜间 DNA 保有量不均一，杂交信号强度不一致，重新点杂交。 减法杂交技术： 又称差减杂交、扣除杂交、减数杂交、消减杂交 本质： 尽量 去除两种样品中普遍共同存在的基因序列 ，从而使目的基因序列得到有效的富集，从而提高基因筛选分离的敏感性 mRNA 减法杂交；基因组减法杂交 感受态细胞的制备： 1、挑取平板上的大肠杆菌单菌落接种于 2 mL LB 液体培养基中， 37振荡培养过夜 2、按 1的接种量接种于 3 mL新鲜 LB培养液， 37剧烈振荡培养至 OD600 为 0.4-0.6(可见 雾状 )3、倒至 1.5mL 的 epp
17、endorf 管中 ,4下 12,000 rpm 离心 1 min，倒出培养液，用无菌滤纸尽量吸干 4、加入 1mL 预冷的无菌 0.1mol L-1 CaCl2 溶液涡旋 4下 12,000 rpm 离心 30 秒 ,尽量去除上清 5、沉淀以 50-100 L 预冷的 0.1mol L-1 CaCl2 重悬， 4保存备用， 7d 内可用。 大肠杆菌的转化方法： 1.Ca 2诱导大肠杆菌转化法 CaCl2 的诱导原因： 在 0的 CaCl2 低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀， Ca 2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细 胞外膜与内膜间隙中部分核酸酶解离，诱导形成感受态 Ca 2 能与加入的 DNA
18、 分子结合，形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基磷酸钙复合物，黏附在胞膜的外表面； 42 热激处理，细胞膜的液晶结构发生扰动，出现间隙。 对照试验： 转化处理过程中，可能感染杂菌，导致假阳性 2.电穿孔转化法 基本原理 ：利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间通道，促进外源 DNA 的有效吸收。 影响因素 ：电场强度，电脉冲时间，外源 DNA浓度 3.三亲本杂交接合转化大肠杆菌 重组 DNA分子导入植物细胞 （ 1）农杆菌介导的 Ti 质粒载体转化法 作用机制： 将待转移的目的基因组入农杆菌中的 Ti 质粒载体；农杆菌识别敏感植物，将 Ti 质粒的 T-DNA 转移到植物细胞内
19、部基本程序：选择合适的外植体；农杆菌的接种操作；洗菌并筛选培养常用方法： 1.创伤植株感染法 2.共培养感染法 ： 叶盘转化法 ； 植物愈伤组织共培养转化法 ； 植物悬浮细胞共培养转化法 ； 原生质体共培养转化法 （ 2） DNA 的直接转移法： 多聚物介导法 ； 电穿孔转化法 ； 激光微束穿孔转化法 ； 显微注射法 ； 超声波介导转化法 ； 基因枪法 ； 脂质体介导法 ； 花粉管通道法 重组 DNA分子导入哺乳动物细胞 病毒介导的 转染 ：病毒颗粒转导法 生化转染 ：磷酸钙转染法； DEAE葡聚糖转染法；聚阳离子 DMSO 转染法；脂质体介导法 物理转染： 显微注射法；电穿孔法 常见的筛选重
20、组子方法 1 遗传表型直接筛选： 抗药性筛选；插入失活筛选法；插入表达筛选法；显色互补筛选法 2 PCR 法鉴定 3 酶切法鉴定 4 杂交法鉴定： Southern blot； Northern blot； Western blot 等 5 测序 原核生物基因表达的特点 只有一种 RNA 聚合酶识别原核细胞的启动子，催化所有 RNA 的合成。 基因的表达是以操纵子为单位的。 原核 生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。 原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中 缺乏真核细胞的转录后加工系统 。 原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物的直接控制要慢。 mRNA 的核
21、糖体结合位点 上，含有一个 S-D 序列 ，而真核基因则缺乏此序列 。 启动子的特性： 列特异性；向性；置特异性；属特异性 几种类型的原核表达载体： 非融合蛋白 ： 不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白 优点： 它具有非常接近于真核细胞体内蛋白质的结构，因此表达产物的生物学功能也就更接近于生物体内天然蛋 白质。缺点 ：易被细菌蛋白酶破坏。 融合蛋白： 由一条短的原核多肽或具有其他功能的多肽和真核蛋白质结合在一起。 优点：大大增加，不易被细菌蛋白酶降解；于分离纯化 影响基因表达效率的因素： 启动子的强度、 DNA 转录起始序列、密码子的选择、 mRNA 分子的二级结构、转录的终止、质粒的
22、拷贝数以及质粒的稳定性和寄主细胞的生理特征等 提高基因表达效率的途径： 1.采用强启动子； 35 和 -10 区之间保持的距离（ 16 19bp） 2.确定合适的 SD 序列后面的几个碱基成分及起始密码子上游的碱基成分 3.起始密码子和 S-D 序列之间的距离必须 接近到一定程度（ 7 个核苷酸时最合适） 4.在基因内部的适当位置上存在着转录的终止区，就能够保证使质粒的拷贝数 (也就是基因的表达效率 )控制在一个正常的水平上。 5.提高基因的拷贝数（将基因克隆到松弛型的质粒载体上） 6.轻细胞的代谢负荷：（ 1）诱导表达 ： 细菌的生长与外源基因的表达分开，是减轻宿主细胞代谢负荷的最为常用的一
23、个方法 (2)表达载体的诱导复制：将宿主菌的生长和质粒的复制分开 7.高表达蛋白的稳定性，防止其降解 (1)克隆一段原核序列，表达融合蛋白 (2)采用某种突变菌株，保护表达蛋白不被降解 (3)表达分泌蛋白 基因工程的应用：医药业： 疾病的预防 ;病的诊断 ;病的治疗 农业及食品工业 : 提高作物抗性 ;良作物品质 ;长果实货架期 ;用农作物生产药物，畜牧业 ;工食品 环境 : 环境检测 ;环境净化。 影响限制性核酸内切酶活性的因素 1、 DNA 样品的纯度： 2、 DNA 样品的甲基化程度 3、缓冲液性质： 4、酶切反应的温度 1、完全酶切： 内切酶在 DNA 上的所有识别位点都被切开。 2、
24、不完全酶切： 只有有限数量的酶切位点被切开，可以通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。 连接酶的作用机理与反应条件： （ 1） ATP（ NAD+)提供激活的 AMP（ 2） ATP 与连接酶形成共价“连接酶 -AMP”复合物，并释放出焦磷酸 PPi。（ 3） AMP 与连接酶的赖氨酸 e-氨基相连。（ 4） AMP -氨基转移到 DNA 一条链的 5端 P 上，形成“ DNA-腺苷酸”复合物。（ 5） 3 -OH 对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出 AMP。 2、 反应条件 （ 1）必须是两条双链 DNA，如果为粘性末端，末端必须配对。（ 2） DNA 的
25、 3端有游离的 -OH， 5端有一个磷酸基团（ P）。（ 3）需要能量：动物或噬菌体中： ATP 大肠杆菌中 NAD+ 影 响连接酶效果的因素 1、酶切片段的状态： 2、插入片段与载体的浓度比例 3、反应温度： 4、反应液中的成分（特别针对平端连接）凝聚剂： DNA 聚合酶 I： 聚合酶活性： 5 3，需要引物。外切酶： 5 3 3 5校正功能应用：缺平移探针标记 2、 Klenow fragment： 聚合酶活性： 5 3，需要引物。外切酶： 3 5 用途： A：末端标记法 B：合成 cDNA 的第二链 C：随机引物（ 6nt）标记 D：末端终止法进行 DNA 序列分析 3、 T4-DNA聚
26、合酶 ：聚合酶活性： 5 3，外 切酶： 3 5外切酶活性较 klenow 片段的活性大 200 倍，对单链 DNA 的活性大于双链 DNA。特点：当没有 dNTP 时， T4DNA 聚合酶行使 3 5外切酶功能，制造出 3隐蔽端。如果只有一种 dNTP，则降解到该 dNTP 的位置。 T4 用途： A、填补或标记限制酶切割 DNA 后产生的凹缺 3 B、末端标记带 3突出末端的 DNA： 利用 3 5外切酶活性作用于所有末端形式的 3端（平端、 3隐蔽端、 5隐蔽端）制造出 3隐蔽端，再利用它的 5 3聚合酶活性补平，并加入放射性标记的 dNTPC、标记用作杂交探针 的 DNA 片段 D、将
27、双链 DNA 的末端转化成平 E：体外诱变 4、 T7-DNA 聚合酶 :从 T7 噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：（ 1） T7 基因 5 编码的大亚基：有 53聚合酶和 3 5外切酶活性。（ 2）大肠杆菌编码的小亚基：硫氧还蛋白，增加大亚基对模板的亲和性 T7-DNA 聚合酶的 用途： A、用填补或交换（取代）反应快速进行末端标记； B、将双链 DNA 的末端转化成平末端； C、复制较长的模板进行引物延伸反应，在测序中读出较长的序列。 5、修饰的 T7DNA 聚合酶，通过修饰使 3 5外切酶活性下 降 99%以上，但聚合能力不受影响，修饰后的 T7DNA 聚合酶在聚合反
28、应中有很高的持续性；进一步改进的基因工程生产的测序酶 2.0，完全没有核酸外切酶花性。 用途： （ 1） DNA 序列分析，可读出较长的序列，（ 2）标记 DNA 3隐蔽末端和更有效地补平末端。 6、末端转移酶 ：罕见的 DNA 聚合酶：从小牛胸腺中纯化出的碱性蛋白质，催化单链或双链 DNA 分子的 3 -OH 末端添加一个至多个脱氧核苷酸的反应。 用途： （ 1）在载体或 cDNA 上加换互补的同源多聚尾，以便连接。（ 2）标记 DNA 片段的 3末端 。 3）快速扩增 cDNA 末端 （ Rapid Amplification of cDNA End 简称为 RACE）。 7、反转录酶 （
29、依赖 RNA的 DNA聚合酶）（ Reverse transcriplase, RT） 用途： 合成 cDNA。以 oligo dT 为引物（与 mRNA 的 polyA 尾巴互补结合）。 RNA 聚合酶： 1、依赖 DNA的 RNA 聚合酶 包括： E.coli RNA 聚合酶， phage SP6、 T7和 T3RNA 聚合酶 以 DNA为模板，从启动子开始，经过延伸、终止，合成转录产物。 用途： A：合成单链 RNA探针 B：体外翻译，基因表达分析 2、不依赖 DNA 的 RNA 聚合酶 ： 多聚 （ A）聚合酶， ATP 存在下，催化在单链 RNA3末端加上 AMP，任何 RNA 可作
30、底物 。 用途： A：在 RNA末端加上多聚（ A）尾，以合成 cDNA； B：标记 RNA 的 3端 。 修饰酶： 主要为三类：末端转移酶（在 DNA聚合酶中已述），碱性磷酸酶，多核苷酸激酶 多核苷酸激酶的用途： DNA5 -OH端磷酸化、标记 DNA的 5端。 碱性磷酸酶（ alkaline phosphatase， AP） 种类：细菌性碱性磷酸酶、小牛肠碱性磷酸酶 用途： A：载体 5末 端脱磷，防止载体自我环化。 B：在 RNA/DNA 末端除去 5磷酸，便于标记 5末端 。 PCR 的英文全称： Polymerase Chain Reaction PCR 技术的基本原理： 类似于 D
31、NA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 过程： PCR 由变性 -退火 -延伸三个基本反应步骤构成：模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 93左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 模板DNA 与引物的退火 (复性 )：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；引物的延伸： DNA 模板 -引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新
32、的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性 -退火 -延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2 4 分钟， 2 3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 反应体系：影响 PCR 特性、扩增效率的因素 影响 PCR产量及准确性 的因素： 1、酶的浓度： 常用范围为 1 4U/100 l。由于 DNA 模板的不同和引物不同，以及其它条件的差异，多聚酶的用量亦有差异，酶量过多会导致非特异产物的增加。酶量低，扩增产物不够 。 2、 dNTPs 的浓度： dNTPs 的浓度：主要影响产量、特异性和保真度。在 PCR 反体系中 dN
33、TP 终浓度高于 50mmol/L 会抑制 Taq 酶的活性，使用低浓度 dNTP 可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，高浓度 dNTPs 易产生错误掺入，而浓度太低，势必降低反应物的产量。 PCR 常用的浓度为 50 200 mol/L，不能低于 10 15 mol/L。四种 dNTP 的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。 决定最低 dNTP 浓度的因素是靶序列 DNA 的长度和组成，例如，在 100 l 反应体系中， 4 dNTPs 浓度若用 20 mol/L，基本满足合成 2.6 g DNA或 10pmol的 400b
34、p 序列。 50 mol/L 的 4 dNTPs 可以合成 6.6 g DNA,而 200 mol/L 足以合成 25 g/DNA。 3、 PCR 缓冲液 ： 72时，反应体系的 pH 值将下降 1 个单位，接近于 7.2。二价阳离子 的存在至关重要，影响 PCR 的特异性和产量。实验表明，Mg2+优于 Mn2+，而 Ca2+无任何作用。 （ 1） Mg2+： 对引物退火、解链的温度、 PCR 产量和特异性、 引物二聚体形成和酶的活性和特异性有影响。 Mg2+的最佳浓度为 1.5mmol/L(当各种 dNTP 浓度为 200 mol/L 时 )，但并非对任何一种模板与引物的结合都是最佳的。首次
35、使用靶序列和引物结合时，都要把 Mg2+浓度调到最佳，其浓度变化范围为 1 10mmol/L。Mg2+过量易生成非特异性扩增产物， Mg2+不足易使产量降低。样品中存在的较高浓度的螯合剂 如 EDTA 或高浓度带负电荷的离子基团如磷酸根，会与 Mg2+结合而降低 Mg2+有效浓度。 dNTP 含有磷酸根，其浓度变化将影响 Mg2+的有效浓度。标准反应体系中 4 dTNPs 的总浓度为 0.8mmol/L，低于 1.5mmol/L的 Mg2+浓度。因此，在高浓度 DNA 及 dNTP条件时，必须相应调整 Mg2+的浓度。常用范围： 0.5-2.5mmol/L 之间，常用为 1.5-2.0 mmo
36、l/L（ 2） Tris -HCl 缓冲液 ： 在 PCR中使用 10 50mmol/L 的 Tris HCl 缓冲液，很少使用其他类型的缓冲液。 Tris 缓冲液是一种双极化的离子缓冲液，20mmol/l Tris pH8.3(20 )时，在典型的热循环条件下，真正的 pH 值在 7.8 6.8 之间。 （ 3） KCl 浓度： K+浓度在 50mmol/L 时能促进引物退火。但现在的研究表明， NaCl 浓度在 50mmol/L 时， KCl 浓度高于 50mmol/L 将会抑制 Taq 酶的活性，少加或不加 KCl 对 PCR 结果没有太大影响。 （ 4）明胶： 明胶和 BSA 或非离子
37、型去垢剂具有稳定酶的作用。一般用量为 100 g/ml （ 5）二甲基亚砜（ DMSO）： 加入 10%DMSO 有利于减少 DNA 的二级结构 ，使（ G+C） %含量高的模板易于完全变性，在反应体系中加入 DMSO 使 PCR 产物直接测序更易进行，但超过 10%时会抑制 Taq DNA 聚合酶的活性、降低保真性 ，因此，大多数并不使用 DMSO。 4、退火 (复性 )温度与时间： 退火温度是影响 PCR 特异性的重要因素。变性后温度快速冷却至 40 60，可使引物和模板发生结合。由于模板 DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取
38、决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长 度。对于 20 个核苷酸， G+C 含量约 50%的引物， 55为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm 值 (解链温度 )=4(G+C) 2(A+T) 复性温度 =Tm 值 -(5 10 )。在 Tm 值允许范围内， 选择较高的复性温度（特别是开始的阶段）可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高 PCR 反应的特异性。复性时间一般为 30 60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 5、变性温度及时间： 虑模板的因素和酶的因素：普通 TaqDNA 聚合酶酶的半衰期： 92.5 95 97 2
39、h 40m 5m变性温 度低，解链不完全是导致 PCR 失败的最主要原因。一般情况下， 93 94 lmin 足以使模板 DNA 变性，若低于93则 需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或 PCR 产物完全变性，就会导致 PCR 失败。 常用 94 30 秒 6、延伸温度与时间： 主要考虑 Taq DNA 聚合酶的生物学活性以及引物与模板结合的温度： 75 80时每个酶分子每秒钟可延伸约 150 个核苷 酸， 70延伸率大于 60 个核苷酸 /秒， 55时为 24 个核苷酸 /秒 .温度过高 (90以上 ) 或过低(22 )都可影响 Taq DNA聚
40、合酶的活性，该酶虽然在 90以上几乎无 DNA合成。 PCR反应的延伸温度一般选择在 70 75之间，常用温度为 72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 PCR 延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般 1Kb 以内的 DNA 片段，延伸时间 1min 是足够 的。 3 4kb 的靶序列需 3 4min；扩增 10Kb 需延伸至 15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 7、循环次数： 循环次数决定 PCR扩增程度。 PCR 循环次数主要取决于模板 DNA的浓 度。一般的循环次数选在 30 40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
