1、（一） 36.限制性内切酶 识别和切割 dsDNA分子内特殊核苷酸顺序的酶统称为限制性内切酶，简称限制酶 37.代谢工程 利用基因重组技术强化细胞中某一代谢途径或赋予细胞新的代谢能力是代谢工程的主要研究内容 38.愈伤组织 植物体受到切割等伤害后会产生愈伤组织，愈伤组织的形成实际上是一种创伤反应，使植物脱分化的结果，产生愈伤组织的植物器官可以是种子，根，茎叶等 。 39.神经干细胞 神经干细胞位于成体神经组织中，具有再生神经元。星形胶质细胞和少突状细胞的潜在能力 40.基因组重排育种 基因组重排技术可以用来改 造细菌的基因组，实现表型的改良。重排技术具有多亲本杂交的优势。对细菌群体进行重复的基
2、因组重排可以有效构建新菌株的组合文库。如果将它应用到带表型筛选的细菌群体中，就会产生很多表型有显著改良的新菌株 酵母菌的生长特性 酵母菌是一类最简单的真核微生物。细胞中有结构完整的细胞核。绝大多数酵母菌是单细胞，但体积比细菌要大得多，一般呈球形，卵形或柠檬型。出芽生殖是酵母菌最常见的生殖方式。有些酵母细胞也能以与细菌类似的裂殖方式来产生后代。这两种生殖方式都是无性繁殖。很多酵母菌还能通过产生子囊孢子的形式进行有性繁殖。若出 芽形成的字细胞未能与母细胞分开，又长了新芽，形成成串的细胞，看起来像丝状，称为假菌丝，这类酵母称为假丝酵母。酵母菌在自然界中分布很广，尤其喜欢偏酸性且含糖较多的环境。我们每
3、天吃的面包馒头，喝的啤酒葡萄酒等各类酒类饮料，是酵母菌参与制造的，酵母菌还可以用于生产微生物，甘油，酶制剂，菌体蛋白。 基因组文库的筛选方法 构建基因文库后，就要鉴定出文库中带有目的基因序列的克隆。有三种通用的鉴定方法： 1是用标记的 DNA探针进行 DNA杂交。 2是用抗体对蛋白质进行免疫杂交。 3是对蛋白质的活性进行鉴定 1） DNA杂交法：热 处理或减变性后的双链 DNA分子会变成单链 DNA分子。加热后若缓慢降低温度，那么 DNA双链结构就会在碱基配对作用下重新恢复（复性）退火后的 DNA分子探针和目的序列之间的碱基应能形成稳定的碱基配对 2）免疫反应法：若一目的基因 DNA序列可以转
4、录或翻译成蛋白质，那么只要出现这种蛋白质，甚至只需要该蛋白质的一部分，就可以用免疫的方法检测 3）酶活性法，若目的基因编码一种酶，而这种酶又是宿主细胞所不能编码的，那么就可以通过检查酶活性来筛选目的基因的重组子 微生物工程的发展史 人类利用微生物的历史非常悠久。我们的先人 很早就知道一些采摘的野果存放一段时间后会有酒味。大约在 9000年前就已经开始了原始的啤酒生产 。公元前 2400年左右，埃及第五王朝的墓葬壁画上，就有烤制面包和酿酒的大幅浮雕。我国利用微生物酿酒起源于公元前 2200-2600年，已经有 4000多年的历史。早期的发酵源自对于自然发酵的模拟。 17世纪下半叶，随着显微镜的发
5、明，人们才逐渐认识到微生物的存在。 19世纪中叶，法国著名生物学家巴斯德证明酒精发酵是活的酵母引起。其他发酵过程也是各种微生物作用的结果。随着人们对发酵过程原理的认识逐步加深，以及纯种培养技术的发 明，从 19世纪末 -20世纪 30年代，相继出现了乳酸，丙酮 /丁醇，甘油等工业化生产的发酵产品。特别是丙酮 -丁醇发酵和甘油发酵的出现，标志着人类开始有目的的利用人工筛选的微生物生产新的工业产品。 20世纪 40年代的抗生素革命，它标志发酵工程作为一门独立的工程学科诞生，具有划时代的意义。近 30年来，随着人类在基因水平上改造微生物的技术 -基因工程，代谢工程，组合生物合成等技术的突飞猛进，发酵
6、工业的应用领域迅速扩展，研究内容也日益丰富 。 酶的活力 酶是催化剂，酶的活力是指酶催化特定底物转化成产物的速率 。 一般而言，酶活 力是在规定的环境条件，化学因素和生物因素下，根据酶所催化反应的初速度而测定的。酶活力的单位一般是：单位时间，单位质量酶蛋白所催化的底物反应或产物生成的物质的量（或质量）。 胚胎干细胞 干细胞的研究最早是从胚胎干细胞开始的。 3-5天的胎儿（或囊胚中），有几十个内层细胞是非常特殊的细胞，经过 6个月的增殖，这几十个内层细胞能分化出千万个不同的细胞。这些内层细胞就是胚胎干细胞，胚胎干细胞具有形成所有组织和器官的能力，具有全能性 。 造血干细胞 造血干细胞分布于骨髓，
7、外周血和脐血中。尤其脐血中含有丰富的造血千细胞，造 血干细胞是造血细胞的 “种子 ”，体内所有血细胞，包括红细胞白细胞血小板等部由它分化发育而来，它是人们认识最早的 干 细胞之一。 在 间歇 发酵过程中如何结合微生物 的生长特征实现发酵过程中的优化操作。 在间歇培养中，当微生物种子罐接种到发酵罐后，为了适应新的环境需要一段缓冲期称为迟滞期。为接下来的快速生长做好必要的准备工作，适应了新的环境后，微生物数量开始成倍增长，这个时期称为指数生长期 。 在间歇培养过程中，当微生物对数生长期维持一段时间后，由于某些养分消耗殆尽，微生物生长代谢过程中产生了抑制微生物生长的代谢产物 ，以及因为微生物密度已经
8、很高造成氧供应不足等原因，微生物生长速度开始减慢，而同时有一部分微生物逐渐死亡。此时为了延长细胞处于稳定期的时间，极大可能的增加某些代谢产物的生成，有必要对发酵罐内为环境进行调整，比如补加酸碱以维持恒定的 pH环境，补加 c,n以满足微生物生长代谢的营养需要，这都要求对发酵过程的参数进行实时控制和优化。 过程控制是保证发酵过程稳定，降低成本，提高效益的主要手段之一。过程控制的两个基本要素如下： 1过程参数的测量与操作变量的调节。准确的参数测量是了解和掌握过程当前状态的基础，操作变量的调节 技术是实现控制的基本手段，这些都构成过程控制的硬件 2过程的模型化与控制策略。通过模型可以将不同的过程参数
9、动态的关联起来，了解这些参数反映的过程变化情况。根据控制目标和实际状况的差别，可以采用合适的策略调节某些可以控制的参数。过程参数的测量是了解发酵过程的窗口。可测量的参数可分为环境参数和操作变量两大类。在环境参数方面， Ph值，温度，溶氧值，出口 co2浓度的在线测量技术已经成熟。菌体浓度和部分底物或产物的在线测量技术也已经基本成熟。操作变量方面，搅拌转速，通气量，冷却水流量，罐压，酸碱泵流速，流加速率等的 测定和控制也已经不存在技术问题。只要知道了间歇培养时细胞生长的动力学模型和细胞生长和次级代谢生成两者之间的关系，就可以通过参数优化控制的方式进行发酵过程的优化操作 如何实现基因工程菌的高效表
10、达 要实现基因工程菌的高效表达，第一要选择适宜的启动子。真核细胞的启动子不能被大肠杆菌RNA聚合酶识别，因此必须将外源基因置于大肠杆菌启动子控制下。翻译水平影响外源基因表达的重要因素是翻译起始区。 二目的基因的不溶性高效表达。采用目的蛋白与带纯化标记的细菌蛋白融合的新策略，所得到的融合蛋白不仅能够抵抗蛋白酶的进攻，而且 可以利用纯化标签的蛋白与相应的抗体之间的亲和反应，实现目的蛋白的高效亲和分离。 三目的基因的高效可溶性表达。若目的蛋白能够抵抗蛋白酶的进攻或采用蛋白酶缺失的宿主菌，目的基因有可能在细胞内进行高水平的可溶性表达。 四目的基因的高效分泌型表达。当采用大肠杆菌作为表达系统时，如果在质
11、粒设计时加上一段信号肽基因，就有可能实现目的蛋白质的分泌型表达。 五基因工程宿主菌的改造。通过代谢工程的方法改变宿主菌的代谢途径以提高目的产物的合成 六利用细胞培养工程手段提高基因表达水平。 1提高工程菌的质粒稳定性。 2。实现重组 菌的高密度培养。 3 减少乙酸等抑制性副产物的形成。 4。提高目的蛋白表达的质量 （二） 逆转录酶 是从 mRNA逆转录形成互补 DNA（ cDNA）的酶，或称为依赖于 RNA的 DNA聚合酶 。 分子印迹技术 是指制备对某一特定分子具有选择性的聚合物的过程，该特定分子通常称为印迹分子或模版。分子印迹技术借助模板在高分子物质上形成特异的识别位点和催化位点。 诱变育
12、种的基本原理 是利用一些物理或化学的因素处理微生物细胞，使其遗传性状发生随机的突变，得到大量形状各异的突变株，然后再从众多突变株中以一定的方法筛选出生产性能改 善的个体。用于处理微生物以使其发生突变的物理或化学因素称为诱变剂 。 组织工程 的研究几乎遍及肌体的所有组织和器官。组织工程安组织器官的构筑方式可以分为两个部分：组织再生工程和组织替代工程。组织再生工程采用自体细胞，借助人工细胞外基质，在各种生长因子的促进下使细胞分裂，增殖，分化，以构建患者自己的组织。 植物细胞具有 全能性 ，即单一的离体细胞在一定环境下能分化成不同的细胞组织乃至整个植株。胚胎干细胞也具有全能性，它具有形成所有组织器官
13、的能力 。 非水系统的酶催化特点 与传统的水溶液中酶催化反应相比，非水系统 的酶催化有以下的一些特点： 1绝大多数有机化合物在非水系统中的溶解度高于水溶液 2。根据热力学原理，一些在水中不可能进行的反应，有可能在非水系统中进行 3。与水相比，酶在非水系统中的稳定性比较高 4。从非水系统中回收反应产物比水相中容易。 5在非水系统中酶很容易回收和反复使用 。 酶的修饰方法 酶的结构决定了酶的性质和功能，只要酶的结构发生某些精细的变化，就能使酶的特性和功能随之改变。在研究酶的结构 -功能关系的基础上，在分子水平上对酶进行化学修饰的方法有：金属离子置换修饰，大分子结合修饰，肽链有限水解修饰，酶蛋白侧链
14、 基团修饰，氨基酸置换修饰以及物理修饰等。金属离子置换修饰是通过改变酶分子所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变。大分子结合修饰利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变。蛋白质侧链基团修饰可以改变蛋白质表面电荷和疏水性，从而影响其催化活性和稳定性。酶蛋白中个别氨基酸的置换可以采用点突变的方法很容易就可以完成。点突变是研究蛋白质结构和功能关系的重要工具。 动物细胞培养 动物细胞培养分贴壁与悬浮培养两种。只有在固体基质上付着才能增长或存活的细胞称为贴壁依赖型细胞，而可在悬浮状态下生长的细 胞为非贴壁型细胞。而动物细胞的悬浮培养方式有间歇培养，补料 -分批培养和灌流培养等 从基因
15、表达系统构建和目的基因表达过程两个方面分析，目的基因的表达效率不仅取决于 宿主菌的特性和表达载体的构建 ，还取决于 重组菌的培养工程 。从表达系统来看，主要表现在 转录和翻译 两个水平上 。 影响活性淤泥活性的主要因素 影响活性淤泥活性 的主要因素包括 :溶解氧，营养物， pH值和温度 1溶解氧。氧是好氧微生物生存和代谢的必要条件，供氧不足会妨碍微生物代谢过程，造成丝状菌等耐低溶解氧的微生物滋长，是污泥不易沉淀，这种现象称为污泥膨胀。 2营养物。微生物生长繁殖需要一定的营养物。碳元素的需要量以 BOD5负荷率表示，它直接影响到淤泥增长，有机物降解速率，需氧量和沉淀性能。 3 PH和温度，为维持
16、活性淤泥法处理设施正常运转，混合液的 pH值应控制在 6。 5-9。 0范围内，温度是 20-30C为宜 。 纯种培养的意义 微生物细胞从环境中吸收营养物后，通过细胞的新陈代谢作用合成新的细胞成分，并向环境释放代谢产物，某些细胞组分和代谢产物就成了我们需要的目标产物。不同微生物的代谢产物不同，而混菌培养时由于争夺养分，或者受不同微生物代谢产物的抑制或杀害作用 。 会造成一次工业生产过程，投入和目标产物的产出不能符合工业经济预期值的问题，甚至在某些情况下，由于生长繁殖能力的差异，会造成目标产物产生菌在生长过程中完全处于抑制状态，而非目标产物产生菌大量繁殖，这会造成极大的工业损失。所有这一切都要求
17、我们在发酵过程中完成纯种培养。 干细胞 是一类极特殊的来自胚胎或成体的未分化细胞 ,同时具有不断增长繁殖的功能以及向多种功能细胞分化的潜能 .正是这种双重功能 ,干细胞具有可用于组织器官生产或新药筛选的巨大潜能 .机体的各种细胞 ,组织和器官 ,甚至完整的生物都是通过干细胞分化发育而成 的 .干细胞分为胚胎干细胞和组织干细胞 . 胚胎干细胞 干细胞研究最早是从胚胎干细胞开始 .3-5天的胎儿（或囊胚中），有几十个内层细胞是非常特殊的细胞，经过 6个月的增殖，这几十个内层细胞能分化出千万个不同的细胞。这些内层细胞就是胚胎干细胞，具有形成所有组织和器官的能力，具有全能性 。 多能干细胞 胚胎干细胞
18、逐渐定向分化，朝着特定的组织器官发展，失去全能性而变得比较专一，他们能继续发育成器官组织，它们只能发育分化成一个系统中的几种细胞，但不能生成其它系统的细胞，因此这些干细胞称为 “多能干细胞 ”。 专能干细胞 多能干 细胞继续分化发育 ,将生成更加专门化的细胞 ,即他们只能再增殖分化为一种类型的终端细胞 ,如红细胞 ,肌细胞 ,神经细胞等 .多能及专能干细胞统称为 组织干细胞 ,如造血干细胞 ,皮肤干细胞及神经干细胞 干细胞的研究进展主要集中在 胚胎干细胞 ,造血干细胞 ,神经干细胞和间充质干细胞 . 胚胎干细胞 不能发育成单独的生物体 ,但可以发育成多个组织器官的多能性细胞 。 （三） 36原
19、代细胞 原代细胞是直接从组织器官中分离得到的，原代细胞培养一般由组织器官解剖分离解聚 和离体细胞培养三个步骤组成。 37. 核酸酶 20世纪 80年代初 cech和 altman各自独立的发现了 RNA具有生物催化功能，人们发现除蛋白质具有酶的催化功能外，某些 RNA 和 DNA分子也具有催化功能，这种具有催化功能的核酸就是核酸酶 38. DNA的复制 DNA携带着生物细胞的全部遗传信息，作为遗传物质， DNA分子必须能够准确地自我复制 一个 DNA分子可以通过半保留复制机制精确的复制完成两个完全相同的 DNA分子，并分配到两个子细胞中，从而将亲代细胞所含的遗传信息原原本本的传导子代细胞 39
20、. 细菌 细菌是单细胞原核生物，各体极小，没有成型的细胞核，一般以典型的 “一分为二 “的裂殖方式繁殖。 40. DNA重排 DNA重排的基本原理是首先将同源基因（单一基因或基因家族）切成随机 DNA片断，然后进行PCR重聚。那些带有同源性但核苷酸序列有差异的随机 DNA片段，在每一轮 PCR循环中互为引物和模板，经多次 PCR循环后能迅速产生大量的重组 DNA，创造出新基因 发酵过程操作方式 根据发酵过程操作方式的不同，可以将工业发酵分为三种模式：间歇发酵，连续发酵和流加发酵。 间歇发酵 阶段，将发酵罐和培养基灭菌后，向发酵罐中接入种子，开始发酵过程。在发酵过程中，除气体进出外，一般不与外界
21、发生其他物质 交换，在某些情况下，根据发酵体系的要求，须对发酵过程的 Ph值进行控制。发酵结束后，整批放罐。 连续发酵 是在发酵过程中向生物反应器连续的提供新鲜培养基（进料）并排出发酵液（出料）的操作方式。稳定操作时，进料和出料的流量基本相等，因而反映器内发酵液体积和组成保持恒定 。 流加发酵 介于间歇发酵和连续发酵之间的一种操作方式。流加发酵的特点是在流加阶段按一定规律向发酵罐中连续的补加营养物和或前体，发酵罐不向外排放产物，罐中发酵液体积不断增加，直到规定体积后放罐。流加发酵适合于细胞高密度培养也广泛用于次级代谢产物的生成。 微生物的生长特征 微生物的个体虽然微小，但由于其群体数量惊人的庞
22、大，因而具有极强的代谢能力。微生物大都具有极大的比表面积，这使得微生物与外部环境之间进行物质和能量交换的能力非常强。这样强的代谢能力也使微生物具有惊人的繁殖速率。当然当微生物数量接近某一限制量时，由于微生物相互竞争养分和氧气等，使微生物数量难以继续增加。微生物个体小，繁殖快，数量多，使微生物具有分布广，种类多，容易变异，适应能力强等特点。微生物代谢能力强，生长繁殖快的特点使其非常适于工业和其他领域。地球上微生物种类繁多，性能各异，针对特定的用途 ，通过大范围的筛选，我们能够从环境中找到所需代谢途径的微生物 。 基因组重排技术 基因组重排技术可以用来改造细菌的基因组，实现表型的改良。重排技术具有
23、多亲本杂交的优势。对细菌群体进行重复的基因组重排可以有效构建新菌株的组合文库。如果将它应用到带表型筛选的细菌群体中，就会产生很多表型有显著改良的新菌株 。 DNA重排的基本原理是首先将同源基因（单一基因或基因家族）切成随机 DNA片断，然后进行 PCR重聚。那些带有同源性但核苷酸序列有差异的随机 DNA片段，在每一轮 PCR循环中互为引物和模板，经多次 PCR循环后能迅速产生大量的重组 DNA，创造出新基因 。 在重聚 PCR过程中，当来自一种拷贝的小片断与另一种拷贝的小片断相互为引物时，即可发生模板的移位，这样可使亲本基因群中的突变发生多种组合，导致各种各样的突变体，这些变异的 DNA分别转
24、移入宿主细胞后，就会形成很多具有不同性状的重组菌株，从中可以筛选出符合目标的阳性突变重组子 。 常见的 反应器 发酵工业常用细胞为微生物细胞，而动植物细胞也已成为最常用发酵对象。在发酵工业中搅拌器是最常用的反应器。在机械搅拌式反应器中，实现物质混合传递最常用的部件是搅拌浆。用空气分布器 实现发酵罐中细胞对于氧气的需求。根据培养细胞对于剪切力耐受能力的不一样，对于植物细胞和动物细胞培养时，他们的搅拌器和微生物细胞培养的搅拌器常做了不同的改进，特别是动物细胞，他所用的是笼式搅拌器装置以保证发酵过程中动物细胞不受剪切力的损伤。其他鼓泡塔和气升式反应器也是最常见的生物反应器类型。而对于固定化的微生物细
25、胞或者植物细胞除了普通的搅拌罐外还可以采用流化床反应器和填充床反应器或中空纤维与膜反应器。根据动物细胞培养分为悬浮培养和贴壁依赖型培养，可以用中空纤维进行动物细胞的固定化培养或者使用微载体进行动物细胞 的贴壁培养，但后者是动物细胞才具有的培养类型 诱变育种 诱变育种的基本原理是利用一些物理或化学的因素处理微生物细胞，使其遗传性状发生随机的突变，得到大量形状各异的突变株，然后再从众多突变株中以一定的方法筛选出生产性能改善的个体。 用于处理微生物以使其发生突变的物理或化学因素称为 诱变剂 。 常见的诱变剂 类型及其特征 常见的诱变剂可以分为 物理诱变剂和化学诱变剂 两大类。常见的物理诱变剂如紫外线
26、， x射线 ,r射线，快中子，常见的化学诱变剂如碱基类似物，羟化剂，脱氨剂，烷化剂和诱发移码突变的诱变剂。他的缺点是可以引起微生 物 DNA发生突变的诱变剂往往也能造成人和动物 DNA的变异。经过诱变处理后，变异细胞一般只占存活细胞的百分之几甚至更低，由于诱变剂诱发的突变是随机的，可发生正突变或副突变，而诱变造成的变异位点位于 DNA的一条链上，而一个 DNA分子有两条链，多核微生物体内还有多个相同功能的 DNA分子，因此诱变处理后需要对微生物进行短时间的培养，以保证每个细胞中基本上只含有一种类型的 DNA，筛选突变株的工作量十分巨大，可分为初筛和复筛两种 。 酶的来源 酶的来源可以是从动植物
27、细胞，微生物细胞或微生物的发酵液中产生的酶。对于胞内酶 必须经过细胞破碎，固液分离，提纯浓缩和产品精致几个阶段。而对于胞外酶除了不需要细胞破碎外，其他步骤一致 。 除了天然酶外，还可以通过酶修饰的方式来获得一些结构和功能获得改进或提高的酶。这些方法包括金 属离子置换修饰，大分子结合修饰，肽链有限水解修饰，酶蛋白侧链基团修饰，氨基酸置换修饰以及物理修饰等 。 金属离子置换修饰 是通过改变酶分子所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变。大分子结合修饰利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变。 蛋白质侧链基团修饰 可以改变蛋白质表面电荷和疏水性，从而影响其催化活性 和稳定性。酶蛋白
28、中个别氨基酸的置换可以采用点突变的方法很容易就可以完成。 根据酶的作用原理，用人工方法合成的具有活性中心和催化作用的非蛋白质结构的化合物称为人工合成酶或人工模拟酶，简称 人工酶或模拟酶 。 最简单的模拟酶无疑是利用现有酶或蛋白质为母体，并在此基础上引入相应的催化基团。也可以参照酶的活性结构合成一些简单的小肽作为模拟酶，包括利用环糊精构建模拟酶和分子印迹制备出的人工酶 。 环糊精可提供一个疏水的结合部位并能与一些无机和有机分子包接形成络合物，以此影响和催化一些反应 。 或者制备抗体酶。 抗体酶 是指通过一系 列化学与生物方法制备的具有催化活性的抗体。这种抗体除了具有相应的免疫学性之外，还具有类似
29、于酶催化某些反应的特性，因此也称为 催化抗体 。 或者利用具有催化功能的某些 RNA 和 DNA分子，即 核酸酶 。以及从自然界中存在着一类能在超常生态环境下生存的嗜极微生物里寻找大量适应极端条件的 极端 酶 。 分子印迹技术 是指制备对某一特定分子具有选择性的聚合物的过程，该特定分子通常称为印迹分子或模版。分子印迹技术借助模板在高分子物质上形成特异的识别位点和催化位点。 常见转基因动物方法 常见转基因动物方法有显微注射法 ,逆转录病毒法 与干细胞法等 1） 显微注射法 .利用显微操作系统和显微注射技术将外源基因直接注入实验动物的受精卵原核 ,将外源基因整合到动物基因组 ,再通过胚胎移植技术将
30、整合外源基因的受精卵移植到手提的子宫里继续发育 ,进而得到转基因动物 。 2） 逆转录病毒感染法 .对于鸡受精卵 ,无法对其进行显微注射操作 ,适合采用逆转录病毒的操作方式 3） 胚胎干细胞法 .胚胎干细胞打靶技术的成熟 ,为利用胚胎干细胞建立转基因动物获得了进展 4)精子载体法 .将外源基因与精子共同培养 ,再通过电穿孔或脂质体介导的方法将外源基因导入成熟的精子 ,使精子携带的外源 DNA进入卵中 并受精，从而使外源 DNA整合到染色体中 5）体细胞核移植法，该技术以动物体细胞为受体，将目的基因导入能传代培养的动物体细胞，再以这些动物体细胞为核供体，进行动物克隆，进而得到带有外源基因的转基因动物
