1、正相高效液相色谱法法测定恩替卡韦原料的对映异构体摘 要：目的：建立高效液相色谱法测定恩替卡韦对映异构体的方法。方法：色谱柱为 CHIRALPAK AD-H （250mm4.6mm，5m） ，以正己烷-异丙醇-无水乙醇-三氟乙酸（70：10：20：0.5）为流动相，流速为0.8mlmin-1，检测波长为 254nm。结果：在本方法中，恩替卡韦的线性关系良好，r 为 0.9999；专属性强，恩替卡韦与对映异构体之间的分离度良好；精密度和稳定性良好，RSD 均小于 2%。结论：该方法准确、简便、快速，可用于恩替卡韦的对映异构体测定。 关键词：恩替卡韦 对映异构体测定 高效液相色谱法 Enantiom
2、ers of Entecavir by HPLC Zhao Hai-qiao Wu Shuang-jun Fu Jian Su Gui-yong （Shandong Fangming Pharmaceutical Group CO.，LTD.，Dongming 274500 ，China） Abstract：Objective To establish a method for the enantiomers of Entecavirby HPLC.Methods The determination was carried out on CHIRALPAK AD-H，with Hexane -
3、 Isopropanol -ethanol - trifluoroacetic acid （70：10：30： 0.5） as the mobile phase at the flow rate of 0.8ml？min-1 .The detection wavelength was 254nm. Results The method showed good linearity with a correlation coefficient （r） of 0.9999； the precision and stability were satisfactory with all RSDs bel
4、ow 2%. Conclusion This method is an accurate，fast and simple method for the enantiomers of Entecavirtablets. Key word： entecavir Enantiomers HPLC 恩替卡韦（Entecavir）为最新抗乙肝病毒的一线药物，恩替卡韦是环戊酰鸟苷类似物。II/III 期临床研究表明，成人每日口服 0.5mg 能有效抑制 HBV-DNA 复制，疗效优于拉米夫定；III 期临床研究表明，对发生YMDD 变异者将剂量提高至每日 1mg 能有效抑制 HBVDNA 复制。对初治患者
5、治疗 1 年时的耐药发生率为 0，但对已发生 YMDD 变异患者治疗 1 年时的耐药发生率为 5.8%。我国 SFDA 也已批准用于治疗慢性乙型肝炎患者。恩替卡韦对映异构体测定目前还未有报道，本文建立的方法，方法简便，结果可靠。 一、仪器与试药 1.仪器 日本岛津 SPD-20A 高效液相色谱仪。 2.试药 恩替卡韦对照品（山东方明药业集团股份有限公司，1301001） ；正己烷、三氟乙酸、无水乙醇为色谱纯；对映异构体对照品（山东方明药业集团股份有限公司，1205001） ；恩替卡韦（山东方明药业集团股份有限公司；批号：1310001、1310002、1310003） 二、方法与结果 1.色谱
6、条件 色谱柱为 CHIRALPAK AD-H （250mm4.6mm，5m） ，以正己烷-无水乙醇-三氟乙酸（70：30：0.5）为流动相，流速为 0.8mlmin-1，检测波长为 254nm，柱温为 30，进样量为 20l。 2.供试品溶液的制备 取恩替卡韦对照品约 20mg，精密称定，置 20ml 容量瓶中，加稀释剂（正己烷：无水乙醇=1：1）溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。 3.对照溶液的制备 精密量取恩替卡韦供试品溶液 0.1ml，置 100ml 量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。 4.专属性试验 为考察空白溶剂对本品异构体检测的影响，进行专属性试验。取恩替卡韦对映异构
7、体及恩替卡韦对照品各约 5mg，分别置两个 100ml 量瓶中，加稀释剂适量超声使溶解，放冷至室温，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。精密量取分离度试验溶液 20l，注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果表明，空白溶剂不干扰本品异构体的检测。恩替卡韦与其对映异构体能有效分离。 5.线性关系考察 通过试验考察本品对照溶液浓度与峰面积在一定范围内是否呈线性关系。线性储备液的配制：取恩替卡韦对照品约 25mg，精密称定，置25ml 量瓶中，加稀释剂超声使溶解并稀释至刻度；精密量取 1.0ml，置100ml 量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。样品溶液的配制：精密量取线性储备液 0.1、0.2、0.5
8、、1.0、2.0ml，分别置 10ml 量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得系列线性溶液。测定方法：精密量取上述样品溶液各 20l，注入液相色谱仪，记录色谱图，采用最小二乘法，以恩替卡韦峰面积（A）为纵坐标，其浓度（C）为横坐标，进行线性回归。结果显示本品在浓度为 0.10g /ml2.00g /ml 的范围内与峰面积具有良好的线性关系，回归方程为 y=74478x-3302.1，相关系数r=0.9999。 6.精密度试验 以在相同条件下，由同一分析人员对同一样品重复进样 6 次峰面积的偏差为考察目的，配制本品 0.1%对照溶液进行精密度试验。结果显示RSD 为 0.51%，小于 2%，表明
9、进样精密度良好。 7.稳定性试验 样品检测过程中可能会将样品溶液在室温里放置数小时，为考察样品溶液在室温放置的稳定性，进行溶液稳定性考察。试验结果显示，供试品溶液室温放置 8 小时，主峰峰面积的 RSD 为 0.75%，小于 2.0%，结果表明，样品溶液在 8 小时内稳定性良好。 8.样品测定 对批号为 1310001，1310002，1310003 的恩替卡韦样品，按照“2.2及 2.3”项下方法制备供试品及对照溶液，结果均未检出。 三、结果与讨论 1.流动相的选择 刚开始选正己烷-无水乙醇（1：1） ，结果发现主峰出峰时间太长，改用正己烷-无水乙醇-三氟乙酸（60：40：0.1）分离效果好，且峰形比较好，故选择该流动相。 2.检测波长的选择 以无水乙醇为溶剂，配置 0.05 mgmL 的溶液，在 200400nm 范围内扫描，结果表明，在 254nm 波长有最大吸收，故将 254nm 作为检测波长。 参考文献 1国家药典委员会.中华人民共和国药典 2010 年版（二部）S.北京：中国医药科技出版社，2010：附录D. 2王文娜，邓桂凤，张玲娣. 手性高效液相色谱法检测恩替卡韦中光学异构体杂质的含量J.分析化学，2009，91（8）：136-137.
