1、PCR分子诊断技术,王洋 2016.12.27,内容,PCR技术的概念及发展简史PCR反应的基本成分PCR基本原理和反应过程实时荧光定量PCR检测基本原理和方法PCR技术的应用、临床意义及发展趋向临床PCR检验的实验室管理,PCR技术的概念及发展简史,PCR概念 PCR的由来是Polymerase chain reaction的首个字母的组合，是聚合酶链式反应的简称，是一项体外扩增DNA序列的技术。PCR发展简史 1985年美国科学家Kary Mullis在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文，从此PCR技术得到了生命科学界的认同，并与1993年获得了诺贝尔化学奖。 1,1988年
2、saiki 从水生嗜热杆菌中提取到一种耐热DNA聚合酶，此酶能耐高温，在热变性中不会失活，从而解决了PCR操作技术中酶钝化为实际操作而带来的困扰，极好的提高了PCR的扩增效率，从此，此酶被命名为 Taq DNA聚合酶。 自PCR方法不断改进后，现PCR方法已衍生几十种之多，目前实时荧光定量PCR方法已被临床广泛应用，不仅可以用于定性检测而且可以确定原始样品含量。广泛应用于遗传学、微生物学乃至整个生命科学研究中，由于PCR方法有着极强的实用性，因此仍会被不断完善，进一步在生命科学研究中发挥更好的作用。,PCR反应的基本成分,模板 是待扩增序列的核酸，包括基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、c
3、DNA、mRNA和细胞等都可以作为PCR反应的模板。特异性引物 是与靶DNA 3和 5端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定PCR特异性的关键。当每条引物都能特异性地与模板DNA中的靶序列复性形成稳定的结构，才能保证其特异性。热稳定DNA聚合酶 是PCR技术实现自动化的关键，是从嗜热古细菌中最早分离出的，最常用的DNA聚合酶。 2,脱氧核甘三磷酸（dNTP） 标准PCR反应体系中包含4种等物质的量浓度的脱氧核甘三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。二价阳离子 所有的热稳定DNA聚合酶都要求有游离的二价阳离子，常用的是Mg2，Mn2+ 缓冲液 维持PCR反应体系中的PH，使用TrisCl
4、缓冲液。一价阳离子 标准的PCR缓冲液中包含50mmolL的KCl，有益于DNA片段的扩增。,PCR的基本反应原理和特点,PCR原理 PCR基本过程类似于DNA的天然复制，特异性依赖于靶序列两端互补的寡核苷酸引物。整个过程由变性退火延伸三个基本反应步骤构成。 变性：模版DNA经加热至94左右，双链之间的氢键断裂，双股螺旋解链，变成两条单链，为与引物结合做准备。 退火：DNA加热变性成单链后，当温度降至一定程度（55左右）时，引物即与模板DNA单链的互补序列配对结合。 延伸：在Taq DNA聚合酶的作用下，DNA模板上的引物以dNTP为原料，按AT、CG碱基配对与半保留复制原则，合成一条新的与模
5、板DNA链互补的链。 3,重复上述变性退火延伸的循环过程，每一循环获得的“半保留半复制”链继续成为下次循环的模板。通常一个完整的循环时间需要2-4min，2-3h就能将靶核酸放大几百万倍。 一般临床扩增目的核酸将循环次数设定在40-50个循环之间，以此达到扩增目的。,PCR的特点特异性高 包括：引物的特异性及延伸时，碱基配对的正确性；Taq DNA聚合酶的稳定性。灵敏度高 PCR扩增产物的量以指数方式增长，能在2-3h内，将1个靶分子DNA扩增至10亿个分子，因此一个反应体系中如有2-3个靶分子，则可成功检测出目的基因。简便快速 通过PCR技术可在2-4小时之内获得目的基因，为临床患者提供快速
6、准确的确诊检测。,实时荧光定量PCR法,概念 指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化来及时分析目的基因的拷贝数目，通过与已知量的标准品进行比较，实现实时定量的方法。反应过程 在实时荧光定量PCR反应过程中，对整个过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。产生的DNA拷贝数是呈指数方式“S”增加的，随着反应循环数的增加，最终不再以指数方式生产模板，而进入“平台期”。 4,实时荧光定量PCR法荧光阈值和循环阈值,荧光阈值（threshold） 概念：是在荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强
7、度标准，即PCR扩增产物量的标准。,循环阈值（cycle threshold value，Ct） 概念：PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经过的扩增循环次数。特点 操作简便、快速、高效、较高的灵敏性及特异性、污染性低。,PCR技术的临床应用、意义及发展趋向,PCR临床应用感染性疾病的诊断与治疗 包括：病毒：肝炎病毒、HIV、HPV、流感病毒等 细菌：结核杆菌、TP、UU、CT、NG等 寄生虫：弓形虫、疟原虫等遗传性疾病的诊断及预防 包括：染色体疾病、血红蛋白病、血友病、遗传性耳聋、糖尿病等 肿瘤标志物的监测与诊断 包括：乳腺癌、肠癌、白血病等 个体化用药的临床指导 包括：
8、药物作用靶点相关基因、药物代谢酶基因、药物副作用相关基因等,PCR临床意义： 快速确诊是否有病毒、细菌等致病性微生物感染；了解体内感染的数量、复制程度，是否具有传染性；对临床治疗的用药监测，有无好转或耐药情况，如产生耐药，如何指导用药种类及计量等。PCR的发展趋势 随着临床分子生物学的不断发展，DNA测序技术已逐渐成熟，可为临床疾病的分子诊断提供更精确的判定依据，现由一代测序技术已发展至三代测序技术，为医疗领域带来更方便、快捷的检测手段。,临床PCR检验的实验室管理,PCR实验室的布局设计临床PCR检验标本的采集、运送PCR核酸检测的工作流程PCR污染的产生及预防措施实时荧光PCR扩增仪简介临
9、床PCR检验的质量控制实验室质量管理体系的建立,PCR实验室的布局设计,原则：各区独立、注意风向、因地制宜、方便工作。区域划分：试剂准备区、标本制备区、扩增区、产物分析区。注意事项：1.每个区域应分开独立，各区域设计缓冲间。不能将各区域的设施物品交叉使用，不易使用中央空调、注意传递窗的设置避免发生区域间空气直通的现象。2.实验室内空气在PCR实验室专用走廊内应按照试剂准备区标本制备区扩增区产物分析区单一方向流动，避免空气反向流动，将PCR后区的扩增产物带入前区的洁净区域。3.各区域应配置专用的工作用品、紫外灯及仪器设备等物品。,临床PCR检验标本的采集、运送,标本采集采集时间（选择最具有临床感
10、染特点的时间点，防止临床出现假阴性结果）标本类型和采集量（针对不同病原体的特性，选择正确的标本类型及采集量）采样质量的评价（指标本的质量是否符合检测要求，如血液标本有无溶血、脂血，分泌物标本有无采集到足够的脱落细胞等）采样容器的选择（一般应选择无菌密封的容器，血液标本需选择含EDTA、枸橼酸盐抗凝剂的容器，防止肝素纳抑制核酸物质的提取）,标本运送及保存核酸为DNA的标本在室温下建议8h内送至实验室检测，2-8可保存3d；RNA的标本4h内送至实验室检测，如不能及时检测应立即分离血清20存放（1-2周）。分泌物室温下8h内送检，如不能及时检测，应使用生理盐水洗涤处理后保留沉淀于80保存。检测完毕
11、的阳性标本应分离血清至80冰箱存放。,PCR核酸检测的工作流程,试剂准备区 该区域为PCR室最洁净区域，仅存放PCR备用试剂，在配制试剂前应从冰箱提前半小时取出，室温解冻后使用。试剂应根据当日工作量酌情拿取或配制，避免反复冻融。配制及分装过程中应在超净工作台内完成，避免来回走动，手套应注意洁净避免污染试剂。标本制备区 将待检测离心后的标本放入生物安全柜或全自动核酸提取仪内进行核酸的提取，标本制备期间应及时更换可能被污染的手套，避免交叉污染。,扩增区 将提取好的核酸扩增反应物加盖密封好后放置于相应的核酸扩增仪中，设置好该批实验的模板后进行核酸扩增反应。在扩增结束后，运用仪器软件分析出扩增产物的浓
12、度值。产物分析区 此区域一般用于基因突变、分型检测的反向点杂交实验中，将核酸扩增产物加入已固定多种探针的硝酸纤维素膜或尼龙膜中，将样本中与膜条上同源序列的探针结合，再经显色后得到基因序列。 以上两个区域是PCR实验室污染较为严重的区域，因此应每次在实验结束后应对仪器、操作台等物品进行紫外灯照射及消毒液（10的次氯酸钠、75%的酒精）擦拭，以助于扩增产物的降解。,PCR污染的产生及预防措施,污染的来源：标本间的交叉污染（标本收集时、容器密封不严溢洒、加样时污染加样器、标本中病毒可随气溶胶扩散等）PCR试剂的污染（耗材、加样器等）扩增产物的污染（最常见的污染源）气溶胶的污染（最可能、严重的污染源）
13、气溶胶：由固体或液体小质点分散并悬浮在气体介质中形成的胶体分散体系，体积为1-100nm。是由空气与液体表面摩擦形成，实验操作中的剧烈震荡反应管，污染加样器的反复吸样以及在室内来回的走动等行为。据计算统计一个气溶胶颗粒可含4.8104个拷贝数。,污染的监测与预防措施加样器：对污染的加样器进行及时处理，并使用一次性含有滤芯的吸头，同时对吸头及反应管进行高压灭菌后再行使用。试剂的配制存放：严防试剂配制过程中产生的污染、配制好的试剂必须与标本、扩增产物分开存放。操作手法：严格按照PCR实验操作要求及预防污染的原则进行核酸提取。设立空白及阴、阳性对照：每批试验。,实时荧光PCR扩增仪简介,美国ABI公
14、司在1996年推出实时荧光7700系列，于1997引入国内，成为我国第一台使用的扩增仪，随后又研发出一系列的扩增仪，如5700、7000、7300、7500、7900等型号。1.仪器组成：ABI 7300扩增检测系统（半导体PCR仪，卤钨灯光源、四色滤镜轮和冷CCD照相机进行荧光检测）及配套应用分析软件、电脑。2.检测原理：采用精确的化学原理和复杂的多组分计算方法，准确地检测和处理PCR指数级扩增的数据，得出高精度的Ct值。,3.特点：多色荧光检测（FAM、SYBR Green I、VICJOE、TAMRA和ROX多种荧光染料）；实时数据监控，并有熔点曲线实时分析；96个样品孔采用卤钨灯作为光
15、源，稳定但寿命短。4.仪器使用的注意事项：放置水平、有稳定的电压并连接地线（配备UPS不间断电源）、保证正常运行的室温温度不超过15-25，仪器要放置在通风、散热较好的区域，远离水源、火源、有腐蚀性物质及磁场感染等环境影响。,5.仪器的维护与保养：在日常实验结束，仪器冷却后对仪器表面进行正常维护及保养工作；使用中应小心热盖与反应槽的污染，并定期使用95%的乙醇进行擦拭，如被污染严重应先使用中性消毒液进行处理；每年应要求仪器厂家对仪器的光学部分、温控部分、ROI及背景进行荧光强度的校正。,临床PCR检验的质量保证,检验的质量控制是整个实验室质量体系运行的核心工作，只有对检验的每一个环节进行严格把
16、关，才能保证检验质量准确有效。临床PCR检验的质量保证重点包括：试剂（标准品、质控品等）及消耗品的质检；人员资质的要求；仪器的校准及维护保养；实验操作的规范性；实验室日常工作的规章制度（实验室及人员的生物安全和保护措施、清洁消毒）；质量控制等环节。,PCR实验室质量管理体系的建立,依据国内临床基因扩增检验实验室管理暂行办法和ISO15189认可：CNAS CL02医学实验室质量和能力认可的准则和美国CAP认证的PCR分子实验室要求等相关规定，建立标准、规范化的实验室质量管理体系内容。体系结构质量手册：阐明实验室的质量方针、并描述质量体系的文件，包括实验室的质量方针、目标、组织结构及质量体系要求等。程序文件：对实验室工作流程的文件化描述，包括目的、范围、职责及具体工作流程等。,作业指导书：实验室日常工作的指导性文件，一般分为管理、仪器、项目三大类，内容包括检验目的、原理、标本类型、操作步骤、参考区间、临床可报告范围及参考文献等。记录表格：对日常工作操作行为的实时记录。总结 质量体系文件一般依据各个实验室的实际工作状况而建立，不能一昧的照搬医院或其他企业模式套用，归总起来有十六字方针“写我所做、做我所写、记我所做、纠我所错”。,谢谢！,
