1、1六氯苯与雌二醇共存时内分泌干扰活性拮抗效应及其机制研究摘要：以典型天然雌激素雌二醇为代表，以人体乳腺癌细胞 MCF-7增殖为手段，检验了六氯苯与雌二醇共同作用时的内分泌干扰活性及其机理.结果发现六氯苯具有强烈的内分泌干扰活性，但与雌二醇混合后，呈现明显的拮抗效应，内分泌干扰活性被显著抑制.机理分析表明六氯苯、雌二醇、二者混合物都可以干扰雌激素受体和胞外信号调节激酶（ERK）信号通路、激活转录因子、诱导细胞增殖.路径分析表明，六氯苯与雌二醇的拮抗作用与雌激素受体通路无关，主要原因是雌二醇降低了六氯苯对 ERK的活化程度、降低了 p-ERK蛋白的表达、从而干扰了丝裂原活化蛋白激酶信号转导.转录因
2、子分析表明，雌二醇弱化六氯苯内分泌干扰活性的主要原因是降低了 c-Myc蛋白表达.上述发现为六氯苯的控制提供了理论依据. 关键词：雌二醇；六氯苯；雌激素活性；拮抗；ERK 信号通路；机理 中图分类号：X703.1 文献标识码：A 内分泌干扰物（EDCs）具有生物内分泌干扰活性、可破坏免疫系统、引起多种器官和神经损伤，是目前国际研究热点1.我国多地检出多种EDCs，其典型代表是六氯苯（HCB）2.环境中的六氯苯进入生物体后，必然与天然雌激素共同发挥作用.而这方面的研究未见报导. 研究发现，有的物质混合时出现明显的协同作用，如2Dieldrin，Toxaphene，Endosulfan 和 Chl
3、ordane任何两种混合，雌激素反应强度可增加 1601 600倍3.双酚 A、异黄酮、壬基酚在低浓度下也出现明显协同4-5.与此同时，也有报道发现狄氏剂和毒杀酚混合后雌激素效应无协同作用6；而镉与 E2之间甚至出现了拮抗作用7.上述现象表明不同 EDC的混合效应不同、作用机制不同，需要逐一研究.本文选择天然雌激的代表雌二醇（E2） ，研究它与六氯苯共同作用时的内分泌干扰活性及其作用机制. 1 材料与方法 人体乳腺癌细胞 MCF7来自哈尔滨工业大学生物系，属 ATCC细胞系.酶与蛋白标样购自美国 Sigma公司.化学试剂购自美国 Ameresco公司.根据六氯苯的毒性检测结果和生物体内 E2浓
4、度，单独投加六氯苯浓度为10-8 mol/L，单独投加 E2的浓度为 10-12mol/L，混合物的浓度为二者各取一半.所用主要设备包括 GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems公司） ，DYY6B 电泳仪（北京市六一仪器厂） ，蛋白质电泳及Western杂交转膜系统（BioRad） ，LSM Meta510 激光共聚焦仪（Zeiss公司）和 IGO 150二氧化碳培养箱（Thermo 公司）. 雌激素活性检测采用经典 EScreen法，细胞增殖效应（PE）为实验组的吸光度平均值与溶剂对照组吸光度平均值的比值2. 采用 WESTERN BLOT法测定
5、乳腺癌 MCF7细胞内雌激素受体 蛋白，以及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导通路相关蛋白.该方法可检测到低至 10pg的 EDC干扰效应8.以 Tublin 蛋白作为内参照，对目的蛋白表达量进行校正9.采用 RTPCR法测定 EDCs干扰效应相关的转录因3子，具体步骤为：细胞培养、RNA 抽提、分离、沉淀、洗脱、再溶解、定量、逆转录、聚合酶链式反应、电泳鉴定2. 每次试验均进行三组平行试验，每组平行实验设定 6个平行样，共18个样品，最终实验数据经 SPSS13.0方差分析进行处理. 2 结果与讨论 2.1 六氯苯与雌二醇混合后内分泌干扰活性研究 首先考察 E2与六氯苯的混合对其内分泌干
6、扰活性的影响，结果见图1.图 1表明六氯苯明显促进 MCF7细胞增殖效应，E2 在 48 h时的细胞增殖效应最强，96 h时二者均失去增殖效应.二者混合后产生明显的拮抗效应，在 24 h时甚至比溶剂对照组弱.这一现象十分重要，意味着天然雌激素对六氯苯的内分泌干扰活性存在强烈的抑制，可以有效消除其内分泌干扰活性，对于保护生物体内分泌系统稳定具有重要作用.本文的结果来源于单一浓度实验，这一拮抗现象并非决定性的结论，不同实验条件下二者的混合效应需要进一步的实验验证. 2.2 内分泌干扰活性路径分析 接下来研究 E2，六氯苯、两者混合物的内分泌干扰活性路径.EDCs干扰内分泌系统活动的路径有多种.其中
7、最常见的是与生物体内的雌激素受体（ER）结合，阻止天然雌激素作用，被称为经典路径；此外，EDCs还可以通过非经典路径如 MAPK通路发挥作用.本文同时考察了二者. 2.2.2 非经典路径分析 图 2表明经典路径不是 E2抑制六氯苯的路径，拮抗效应可能通过MAPK信号通路起作用.MAPK 信号通路中最重要的一条是外界因子激活细4胞外信号调节蛋白激酶（ERK）10，活化的 ERK磷酸化多种核转录因子，进而参与调控雌激素活性，调节增殖相关蛋白的合成与表达.ERK 的激活情况如图 3所示，E2 使 ERK蛋白表达量升高，六氯苯使 ERK蛋白的表达量降低，混合物作用时效果与六氯苯单独作用时接近，远低于
8、E2的单独作用. 被激活的 ERK蛋白转变成 pERK蛋白，如图 4所示.六氯苯能够强烈地诱导 pERK蛋白的表达，混合物对 pERK蛋白表达的诱导能力与雌二醇单独作用时强度相当、远低于六氯苯的单独作用.因此，推测雌二醇弱化六氯苯内分泌干扰活性的途径主要是通过干扰 ERK的活化，降低了 pERK蛋白的表达. 2.3.3cJun 基因 试验发现，E2，六氯苯，混合物均能使 cJun基因表达量下降 8%13%，差异缺乏显著性.说明 E2与六氯苯的拮抗作用与 cJun基因表达无密切关系. 3 结论 本文研究了典型环境内分泌干扰物六氯苯与天然雌激素雌二醇共存时对人体乳腺癌细胞 MCF7的增殖效应.结果
9、发现，六氯苯与雌二醇均有较强的内分泌干扰活性、可诱导 MCF7细胞增殖；二者共存时呈现明显的拮抗作用，这对减轻六氯苯的内分泌干扰活性具有重要意义.由于本文是单一浓度实验，该结论尚需进一步梯度实验确认.机理研究表明，雌二醇可通过雌激素受体通路及 MAPK通路发挥作用、增加 DNA分裂期细胞比例.六氯苯也可以通过上述路径发挥作用、同时增加 DNA分裂期及间歇期的细5胞比例、促进细胞增殖.二者混合后，拮抗效应主要是通过 MAPK信号通路实现，降低 pERK蛋白的表达、进而减弱 cFos基因表达. 参考文献 1WITORSCH R J. Endocrine disruptors： can biolog
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