1、肿瘤免疫治疗新技术研究中心,一. NSFC资助的项目二.面上项目三.申请注意事项四.申请书的写作要求五.申请书的撰写六.申请书各部分之间的关系七.基金申报相关规定及要求,报告提纲,第一部分 NSFC资助的项目,研究项目板块,人才资助体系,面上项目,重点项目,重大项目,国际合作与交流项目,国家杰出青年科学基金项目,海外及港澳学者合作研究基金项目,创新研究群体项目,优秀青年科学基金项目,青年科学基金,自由申请项目青年科学基金项目 地区科学基金,重大研究计划项目,国家自然科学基金,NSFC资助的项目,面上项目的类型,自由申请项目(A类) ：允许申请人的学术思想自由，选题自由；青年科学基金(C类)：申
2、请人的年龄需在35周岁以下（指申请当年1月1日未满36周岁）；地区基金(D类)：面向老、边、少地区的研究单位。在同等水平的情况下，老、边、少地区的项目有可能优先送审。,第二部分 面上项目,面上项目,面上项目也叫一般项目，照顾的面比较大是国家自然科学基金研究项目系列中的主要部分支持从事基础研究的科学技术人员在国家自然科学基金资助范围内自主选题开展创新性的科学研究，促进各学科均衡、协调和可持续发展。面上项目是科学基金最基本的资助项目类别，其经费额约占科学基金总额的60%。面上项目包括自由申请项目、青年科学基金项目和地区科学基金项目。,2016年面上项目资助情况,面上项目申请人的条件,面上项目的要求
3、,生命科学部,生命科学一处：微生物学、植物学生命科学二处：生态学、林学生命科学三处：生物物理和生物化学与分子生物学、免疫学、生物力学与组织工程学生命科学四处：神经学、生理学与整合生物学、心理学生命科学五处：遗传学与生物信息学、细胞生物学、发育生物学与生殖生物学生命科学六处：农学基础与作物学、食品科学生命科学七处：植物保护学、园艺学与植物营养学生命科学八处：动物学、畜牧学与草地科学、兽医学、水产科学,生命科学一处：微生物学科,生命科学三处：生物物理、生物化学与分子生物学,生命科学三处：免疫学,生命科学三处：生物力学与组织工程学,生命科学四处：神经学,生命科学四处：生理学与整合生物学,生命科学四处
4、：心理学,生命科学五处：遗传学与生物信息学,生命科学五处：细胞生物学,生命科学五处：发育生物学与生殖生物学,生命科学八处：动物学,生命科学八处：兽医学,医学科学部（基础和临床研究）,医学科学一处：呼吸系统、循环系统、血液系统医学科学二处：消化系统、泌尿系统、内分泌系统、眼科学、耳鼻咽喉头颈科学、口腔颅额面科学医学科学三处：神经系统疾病、精神疾病、老年医学医学科学四处：生殖系统、围生医学和新生儿、医学免疫学医学科学五处：影像医学与生物医学工程、特种医学、法医学医学科学六处：运动系统、急危重症-创伤-烧伤-整形、康复医学、医学病原生物与感染、检验医学医学科学七处：肿瘤学医学科学八处：皮肤及其附属器
5、、放射医学、地方病学、职业病学、预防医学医学科学九处：药物学、药理学医学科学十处：中医学、中药学、中西医结合领域,第三部分 申请注意事项,（1）申请者不具备申请资格或违反了自然科学基金委的有关规定（2）申请手续不完备或申请书不符合要求（3）申请项目主要研究内容不属于申报学科的资助范围（4）申请书纸质与电子版内容不一致（5）其它,面上项目 (自由、青年、地区）形式审查不合格原因,A、纸质申请书上没有项目组成员签名B、纸质申请书缺页C、单位盖章为非注册章D、合作单位未盖章或盖的不是注册（法人）章E、中级无博士学位人员无专家推荐 （初级无博士学位不得做负责人申请）F、在职研究生申报项目需导师同意函G
6、、项目被查重（已获得青年基金的再申请青年）H、申请金额过高（平均强度四倍）,较容易犯的错误有：,生命科学五处面上项目初筛不合格原因,第四部分 申请书写作要求,一、申请书中的注意事项,基金项目的评审只是评价一份申请书的质量，而不完全是评价申请项目的实际水平和学术水平。,二、项目的写作要求,1、表达能力：告诉评议人您是如何思考问题的2、归纳总结能力：从新的角度和高度对所研究的问题提出新的观点3、区分问题主次的能力4、对研究中所需技术的掌握能力5、对申请书研究内容准确而又令人信服的安排能力,所有这些方面便反映出申请人的科研能力,三、四个重要方面的信息,你为什么要做？即研究意义和立论依据 你想做什么？
7、即研究内容、研究目标 你如何去做？即研究方案 你以前做过什么（为什么你能做）？即研究基础,四、立项依据的要求,立项目的要明确，申请理由要充分，立项依据既不要太科普，又要把关键问题交待清楚，能引起评审人的兴趣，愿意继续读完您的申请。初审专家关注问题关键推断不成立：例如：本项目立项依据不充分，且对信号转导通路的概念尚不十分清楚，仅分析未磷酸化的信号通路蛋白不能判断通路运行状态 关键推断缺乏依据：例如：立论依据中对诱导的效应与其特异的现象的关系未阐述清楚。 在中的作用意义的论据也欠充分,四、立项依据写作（1）,（l）既要介绍国外动态，也要介绍国内研究情况，避免评议人会认为申请人对国内研究情况不了解，
8、就以“不了解国内情况”为由，不同意资助该项目的申请。（2）国内情况应包括申请者自己的意见、工作，以使评议人比较顺畅地了解申请人的思路。,（3）必须阐明申请人要从事本项研究的理由究竟是您在前期工作中发现什么问题，还是别人的工作中存在什么问题，或者您对哪个科学问题有什么特殊想法等等（4）坚持“有所为，有所不为”的基本国策，填补空白不是立项依据科学基金是要使我国的基础研究在世界上占有一席之地，而不是跟踪或填补空白。（5）主要参考文献，包括国内、外的关键性研究工作都要有所显示，注意时间性和篇数。,四、立项依据写作（2）,五、研究方案,研究目标、内容和拟解决的关键问题研究目标不是简单地去做一件具体的事，
9、而是要研究和解决其中的科学问题和学术性问题。泛泛地讲探索什么规律，而不能很好地论证要了解某个规律意义，那就难以得到支持。要从学术角度提出可行性分析突出申请人学术思路方面的好想法，阐明你的设计方案、研究方法、技术路线能否实现预期的研究目标。,研究队伍、研究条件和学术思想方面的综合优势,研究内容过大或过小： 研究内容充实，设计细致，但主攻重点不突出 该研究计划过于庞大研究内容不属于资助范围： 申请侧重于技术和应用研究，科学意义不明确。研究内容安全性有疑问： 在上海这样人口高度密集的地区进行饲养繁殖（该类昆虫），本身就有很大风险。,研究内容,但本课题将研究内容、研究目标及拟解决的关键问题混淆项目执行
10、期内无法完成任务： 但是，质量的正向演变和响应是一个十分缓慢的过程研究内容无法实现研究目标： 通过标书的阅读，难以判断通过本研究能达到作用机制的研究；题目与研究目标、拟解决关键问题不完全一致,研究方案部分表述不清：,关注实验重现性： 但实验设计欠合理，很难实现预期目标，试验的重现性难以保证取材可能性太小： 从自愿患者取10ml骨髓，很困难对所用方法了解不够： 也说明申请人没有芯片研究的经历，没有理解和掌握该技术。本项目科学性不强,初审专家关注的问题研究方法与技术路线,六、本项目的创新之处,(1) 创新之处：指申请人要开展的研究项目的特色和新颖的学术思想，而不是泛指的一个新领域的特色；研究条件的
11、特色并不能完全表明申请人的研究特色和学术思想新颖性。学术思想可以有一点新颖性，或者可以把其它领域的好思想借鉴到你的研究课题里。创新性不明显约占异议比例的50%,(2) 不要泛泛地谈学科交叉基金委鼓励学科交叉，但不等于说，申请项目属多学科交叉，就算有特色、有创新，就该给予资助。“学科交叉必须对相关学科的发展都有促进作用” 如果你的申请项目属于学科交叉项目，必须阐明交叉点在哪儿？(3) 填补国内外空白不是创新和特色目前，基础研究可以有所为的，首先应该关注的是国家国民经济急需领域的基础研究和国内已经有一定研究基础，有可能在世界上占领一席之地的研究领域的基础研究两方面。,专利,正确理解专利的地位专利是
12、不是成果？当然，你的基础研究成果推广应用了，申请若干项专利，基金委还是承认你的，但不能把专利作为基金的主要成果。专利只是一种知识产权保护方法，难以判断基金项目的研究水平，可以作为结题时的辅助成果，申请时不必过分强调。,创新性部分-初审专家关注的问题：,无明显的创新性，评议人认为填补国内空白不能作为创新。 本项目的创新性不强，仅为动物模型的一些指标的观察，评议人认为难以达到研究目的。 国内外对于方面已经有比较多的报道 第二个问题已被研究组解答（评审人均为专家） 该研究的创新性仅在于在此材料中尚无此方面的研究。,七、研究基础,（1）与本项目有关的工作积累和成绩应该是申请人以及合作者的，而不是你所在
13、的单位、研究集体或者导师的工作和成绩。对于刚毕业的研究生，作为基金委和评审专家不会强求他们在新的研究领域有很多积累，但必须详尽地介绍他们自己过去的工作，让评审专家能够判断他们的研究能力。,研究基础,（3）申请人和主要成员的研究背景情况都要介绍不少申请中只介绍申请者的情况，不符合申请书的要求。申请人和主要成员的背景情况介绍要具体，必须符合申请书的要求，有关论著应注明作者位置、论文题目、发表的刊物以及发表时间，获得学术奖励应注明获奖人的名次等等。有一半人没有按项目指南要求填写。原因可能有两种，不是没有读过项目指南，就是没有相应的业绩来填写。,从推论做推论： 第一步工作就可能达不到预期目标，使后续的
14、实验无法进行。建议不予资助。在关键步骤或方法中无工作经验： 特别是申请者及课题组成员均没有细胞诱导分化研究的工作基础未准备好解决关键问题的方法： 对整个项目的限速步骤，并没有令人信服的研究设计和检测指标，使得整个项目看起来可行性不够,初审专家关注的问题研究基础,八、申请者承担国家自然科学基金资助项目情况,其中进展或完成情况一栏，应填写详细一些不要简单地填写“已完成”、“顺利进行”。最好能注明获得什么奖励，发表多少论文，引用情况如何，培养了几名研究生等等。让评议人能一目了然。前一结题项目完成情况；三篇主要论文首页必须反映是基金资助项目，否则，应附上能反映基金资助的那一页，如：致谢或英文刊物中的A
15、cknowledgment。,用途,项目类型,比例,面上,=15%,重大、重点,=10%,国际合作与,交流费,外国专家来访和,项目组成员出访,杰出青年,=,20,%,面上,= 15%（不封顶）,重大、重点,= 10%,劳务费,参加项目的研究,生、博士后,杰出青年,=,20,%,面上,重大、重点,管理费,依托单位为组织和支,持项目而支出的费用,杰出青年,5%,九、经费预算,间接费用,自2015年起，各类项目申请经费分为直接费用和间接费用两部分。直接费用包括设备费、材料费、测试化验加工费、燃料动力费、差旅费、会议费、国际合作与交流费、出版/文献/信息传播/知识产权事务费、劳务费、专家咨询费、其他支
16、出。间接费用是指依托单位在组织实施项目过程中发生的无法在直接费用中列支的相关费用，主要包括依托单位为项目研究提供的现有仪器设备及房屋，水、电、气、暖消耗，有关管理费用的补助支出，以及绩效（ 按照直接费用扣除设备购置费后的5%核定 ）支出等。间接费用计算：项目直接费用扣除设备购置费后，金额在500 万元及以下部分为20%，金额为500万元以上至1000 万元的部分为13%，金额超过1000 万元的部分为10%。,十、结语,申请书是写给别人看的，不仅要你自己认为清楚、满意，而且要让小同行、大同行、基金管理人员和有关领导都能认可。“外行看了有兴趣，内行看了有水平”。,申请书是否满足以下要求,1、立论
17、依据是否充分，提出的问题是否属该研究领域的重要问题；2、研究目的是否明确，研究内容是否合适，二者间是否一致；3、有关的文献资料是否已经全面掌握，是否真正明白其中的问题，是否熟悉该领域的研究进展，您提出的问题是否属于还未解决的问题，是否能为本研究领域增加新的内容和新的结论；4、前期的工作是否能说明你熟悉项目中所采用的研究方法，是否能使评议人相信你胜任此项目的工作；5、研究方案是否可行，是否创新，是否清晰，是否能说服评议人，是否组织合理；6、研究方法是否合适，是否创新，是否可能遇到困难，有何补救措施，方法有何优点和不足；7、经费预算是否合理。,A、标书书写不规范 标书撰写不太认真，存在关键字错误，
18、如摘要中的“斑快”（斑块）,水稻（小麦） 文中有多处错字，说明申请人在书写和校对时缺乏严肃认真的态度 此外，项目申请书的科技写作不够规范，如立项依据部分文中的文献引用没有标注、文中有的文献引用在参考文献目录中没有等问题,其他问题（1）,B、论文造假 申请者自我介绍中的论文11(p26)应为会议摘要，并有页码错误。 p2论文2,3应为会议摘要而不是论文C、项目组成员工作时间问题（不初筛） 主要成员已有23项国家自然科学重点、杰出、面上或973、863项目在研D、同室操戈 本申报材料与其所在科室另一申报书内容雷同，工作人员重复，本课题组与之相比,没有良好的研究基础,其他问题（2）,其他问题（3）-
19、报送学科,报送学科要准确，但别把学科代码当指南代码1表示投送学科，代码2表示相关学科，准确填写相关学科代码，将会便于学科寻找合适的同行评议专家。如果投送学科完全错了，就相当于考大学时报错了志愿，白白申请了。尽管NSFC的指南还不十分理想，但它终究反映了学科的资助动向，有一定的导向作用。申请内容涉及多个学科，就要比较各相关学科的项目指南，看一看研究重点与哪个学科更接近？,第五部分 申请书的撰写,一、摘 要（限400字）包括：研究方法、内容、目标、科学意义。,如：采用方法，进行研究， 阐明机制或揭示规律， 为奠定基础提供思路。,作用：画龙点睛效果：引发评议专家的兴趣，使其产生探个究竟的好奇心 “他
20、到底是怎么做的 ？ ”,采用改良的消减杂交技术建立老年性白内障晶状体上皮细胞差异表达基因文库并制备基因芯片，利用此芯片筛选出白内障相关基因。通过基因转染在体和培养的晶状体上皮细胞，观察细胞的形态、增殖和凋亡、骨架蛋白及晶状体蛋白的变化，研究基因的功能。从晶状体上皮细胞的角度阐明老年性白内障发生的分子生物学机制，为防治白内障提供新思路和理论依据。,摘要举例,对基础研究，着重结合国际科学发展趋势， 论述科学意义 对应用基础研究，着重结合学科前沿，围 绕国民经济和社会发展中的重要科技问题 论述应用前景,二、立论依据,在立论依据的阐述中，对研究领域、研究方向、 具体科学问题的理解 研究领域：白内障的研
21、究，包括发病机制、预防、诊断、 治疗措施等研究 研究方向：白内障发病机制的研究，包括环境因素、致病 靶点、细胞水平、分子水平研究等 科学问题：白内障发病过程中的相关基因研究，包括致病 基因筛选、功能研究、调控机制、信号转导等,在研究领域层面,从研究方向展开,围绕某一具体科学问题（本项目研究目标）进行归纳分析,提出研究设想,从研究领域切入,研究意义,国内外现状分析,1、项目的研究意义 存在问题：对科学意义的阐述不足或夸大 撰写方法： 从领域入手，提出主要问题，引出热点研究方向。 围绕热点研究方向进行简要分析，找出目前尚未解决的具体科学问题，以此为切入点提出假设，阐述如果解决了该问题（研究目标），
22、对该领域甚至相关领域的科学贡献（理论意义或应用前景）。,老年性白内障是与年龄相关的疾病，随着年龄的增 加，其发病比率也不断升高。特别是人类趋向老龄化， 白内障的患病人数还将持续增加。目前，它已是人类 第一位的致盲疾病。迄今为止, 治疗白内障唯一有效的 方法是通过手术摘除混浊的晶状体并植入人工晶状体。 虽然手术后患者可以恢复良好的视力，但是不可避免的 术后并发症以及手术设备、材料耗资巨大，治疗白内障 所花费的资金已成为世界各国包括富裕的发达国家严重 的医疗负担。最近的调查表明，如果把老年性白内障的 发病时间延缓10年，白内障手术的数量就会减少45%1。 所以，一些学者认为通过预防白内障发生或延缓
23、其发展 的途径征服白内障已成为一项全球性的社会和社会经济 问题2。,但是目前我们对老年性白内障发病机理的认识还不十分清楚。多年以来许多学者的研究结果证实晶状体上皮细胞在老年性白内障发生中起重要的作用，但对其中进一步的基因调控知之甚少。如果从参与老年性白内障晶状体上皮细胞变化的相关基因入手，研究基因的生物学功能，有可能抓住引起白内障发生、发展的主要环节。据此，本研究拟利用改良的消减杂交技术和基因芯片技术准确、全面、快速的特点，以晶状体上皮细胞为研究对象，一次性筛选出老年性白内障全部有差异表达的基因，从中再筛选出与白内障相关基因，并着重对其功能进行研究，从基因水平阐明白内障的发病机制，为防治白内障
24、提供新思路和理论依据。,2、国内外现状分析（与综述的区别） 存在问题： A、低水平重复：不了解最新进展，对国内外现 状缺乏真正了解，提出的问题别人已解决。 B、文献复习不全：检索文献方法不当、选择关键词 不妥，甚至人为缩小检索范围。 C、总结表达不够：对国内外现状缺乏归纳分析， 只是简单罗列，缺乏逻辑性和针对性。 D 、对方法原理理解不够：对研究方法不熟悉，简 单移植或夸大其作用，缺乏实际应用的可行性。,撰写方法：要紧紧围绕本次申请项目的主题。 A、从领域切入，简要论述国内外研究成果，并引 出当前的热点研究方向。 B、从研究方向展开，较详细地分析国内外的研究 进展，阐明在该方向上存在的问题。
25、C、围绕存在的问题，结合国内外以往的研究结果、 当前的现状及今后的发展趋势，详细论述和分 析这些问题产生的原因，提出该方面的空白点、 未知数、以及研究的难点、焦点，从而为自己 申请项目确立研究目标奠定充分的立论基础。,D、对拟采用的技术方法进行介绍和分析。 成熟的方法重点介绍可以应用于本研究的理论依据和实验依据。 新方法在详细介绍其原理的基础上，阐明可以应用于本研究的理论依据和实验依据。 需特别注意的问题：必须对所运用的技术方法的原理、流程尤其是在实际运用中可能出现的问题要十分清楚，绝不能是一种简单的移植。E、提出本项目的研究设想。,防治白内障必须针对其发病的主要环节。多年以来，国内外学者从不
26、同的角度探讨白内障的发生机理。就致病的环境因素讲，氧化因子、紫外线辐射、晶状体周围环境中离子浓度改变及一些生长因子、细胞因子的改变均与老年性白内障的发生有关。就研究的部位分，晶状体中皮质与核的蛋白质改变及晶状体纤维的改变与白内障的形成有关，而位于晶状体前囊膜下单层的晶状体上皮细胞在白内障的形成中的变化更引人关注。,因为晶状体上皮细胞是晶状体中唯一有分裂活性、数量相对稳定的细胞，它们分裂、分化出晶状体纤维细胞、产生晶体蛋白，终生不停息，形成了晶状体均一、对称的结构，对维持晶状体的透明起重要作用。不仅如此，晶状体上皮细胞还是晶状体中受外来刺激影响较早的部位，已有研究证实老年性白内障的晶状体上皮细胞
27、还发生退行性变、细胞膜通透性增加、细胞内酶活性改变、细胞数量减少、凋亡细胞增多等改变，与单纯老化的晶状体之间存在差异3-5 。,体外实验也证实多种因素(H2O2、UV-B、晶状体蛋白的自身抗体)诱发的白内障模型中晶状体上皮的损伤是晶状体混浊的主要环节6-8。因此，从晶状体上皮细胞的变化入手探讨白内障的成因，有可能抓住揭示白内障发病机理的主要环节。而晶状体上皮细胞变化的基因调控机制是问题的关键所在，也是有待我们深入研究的问题。,白内障的形成与晶状体的老化密不可分，是晶状体老化的极端表现。晶状体的老化是多种因素相互作用的结果，包括基因的和非基因的随机变化的不断积累，也有程序性的、非随机性的组织特异
28、性多种基因表达的改变。目前，国内外对白内障相关基因的研究主要以下三方面：,一是对体外培养的晶状体白内障模型及上皮细胞的研究。UV-B辐射作用诱导的白内障中晶状体上皮细胞是主要的靶细胞，其Na-K-ATP酶的活性增加，蛋白质的合成和分泌增加；上皮细胞的凋亡增加，其中有c-fos基因的表达增加；还有组蛋白H4、H3 的低表达和蛋白酶C、-肌动蛋白、-肌动蛋白基因的高表达9-12。Carper等13利用RT-PCR-DD(reverse transcription-polymerase chain reaction differential display)技术研究H2O2诱导的晶体上皮细胞的基因差
29、异性表达结果显示NADH脱氢酶4亚基、细胞色素b、谷氨酰胺转移酶基因表达减少以及细胞因子的核蛋白、替代拼接因子2 （alternative splicing factor）、-三羟基异丁酰辅酶A水解酶基因表达的增加。,二是利用转基因动物的研究。波形纤维蛋白基因（vimentin）、杂交的型中间纤维蛋白基因的转基因小鼠表现出白内障，而且有随小鼠年龄增加白内障加重的趋势。晶状体改变的共同特点是晶状体纤维细胞分化受抑制14,15。Gong等16报告晶状体的细胞膜蛋白连接蛋白3（3 Connexin）基因敲除小鼠（knockout mouse）在晶状体形成的早期及纤维细胞分化早期不受影响，其后出现与晶
30、状体蛋白溶解有关的核性白内障。 虽然体外实验和白内障转基因小鼠都提示我们一些基因的变化与白内障有关，但是，这些变化的基因是否与老年性白内障形成有关，目前尚缺乏进一步的报告。,三是对人老年性白内障晶体上皮的研究。Lee17利用RT-PCR技术研究显示前极性白内障与核性白内障上皮细胞中纤维连接蛋白、I型胶原纤维、-平滑肌蛋白、TGF-1、TGF-2、TGF-型受体、结缔组织生长因子的基因表达有差异。Kantorow等18利用RT-PCR-DD研究老年性白内障与正常晶状体上皮的基因差异性表达的初步结果是老年性白内障有三个高表达基因和12个低表达的基因。但就DD-PCR技术来讲，在实验中难以解决假阴性
31、、假阳性以及克隆全长cDNA的问题。,上述三方面的研究均取得了不同程度的研究结果，但由于当时技术条件的限制都未能全面阐明与白内障相关的基因及其功能。 寻找白内障时晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差异表达的基因有可能揭示白内障的发病机理。,寻找差异表达基因的经典方法是消减杂交技术（subtractive hybridization, SH），它是，但是实验操作复杂。 经过改进后的抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization ,SSH是Diatchenko等1996年建立的方法）简化了实验操作，但仍然问题很多。 我校生化教研室建立了改良消减杂交技术
32、19，20，其特点是：简便易行，能够获得目的细胞特异表达的全长基因，对低丰度基因也能有效分离。,该方法的建立者已利用这一技术从脂多糖刺激前后的人牙髓细胞的差异表达的基因中克隆到脂多糖刺激后特异表达的基因，其中5个为新基因。同理，利用此方法也能快速、有效地获得白内障晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差异表达的基因，并克隆到全长cDNA，为进一步的结构和功能研究打下基础。,基因芯片技术的出现，使检测差异表达基因和未知DNA分子变得更快捷、准确、高效。基因芯片是在1996年被提出并开始研制的，该技术是将成千上万的DNA探针集中到1厘米见方的基片上，利用碱基互补原理，DNA探针中的已知碱基序列与被测
33、定的未知DNA分子杂交后由标记分子标记杂交体，经自动阅读设备分析杂交结果，从而对检测基因进行定性、定量和结构分析，确定未知DNA分子。,由于目前尚没有针对白内障研究的现成基因芯片，根据本研究的需要，我们将筛选到的差异表达的所有基因建立cDNA文库，再利用基因芯片技术制备成基因芯片，以此检测多个样本中白内障晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差异表达的基因，从中进一步筛选出白内障特异的基因，它们中可能有已知基因，也可能有未知基因。通过以上两种技术的有机结合，我们能更快捷、有效、准确地得到白内障相关基因。,综上所述，分子生物学技术的发展为研究白内障发生过程中的功能基因及特异调控基因提供了有利武器。
34、本项目从晶状体上皮细胞入手，利用改良的消减杂交技术和基因芯片技术系统研究与白内障相关的基因，并采用对体外培养细胞和在体晶状体上皮细胞的基因转染，探讨它们在晶状体上皮细胞变化和白内障形成中的作用，可望阐明白内障晶状体上皮细胞变化的分子生物学机制，为防治白内障提供新的思路和理论依据。,3、参考文献 A、文献类别要全：以英文文献为主，同时也要引用 中文文献- 国内同行中知名专家的文献。 B、引文信息要全：文章题目、作者姓名、具体出处 （包括期刊名、年份、卷期、页码等）。 C、文献年代要新：主要是近五年的文献，最好能有 2017年的最新文献。,三、研究方案,1、研究目标 撰写要求： 有限目标，与研究内
35、容相呼应,如：明确关系，揭示规律， 阐明原理（机制），建立方法等,举例：筛选出与老年性白内障相关的基因，明确部分基因在白内障形成中的作用，从晶状体上皮变化的角度阐明白内障的发生机理，为防治白内障提供线索。,2、研究内容： 存在问题：内容过多，一个研究周期难以完成 内容分散，不能集中阐明研究目标 撰写要求：内容要适当确保研究周期内完成 为目标服务与目标相辅相成 要重点阐述注意与技术路线区别,举例： （1）筛选白内障相关基因：采用改良的消减杂交技术，获得人老年性白内障晶状体上皮细胞和正常晶状体上皮细胞差异表达的基因片段，建立cDNA文库。制备差异表达基因的基因芯片，利用基因芯片技术从多个标本的老年
36、性白内障晶状体上皮细胞中筛选出白内障相关基因。,（2）研究白内障相关基因的结构： （3）研究白内障相关基因在晶状体上皮细胞变化中的作用： 观察指标如下： 存活细胞数；光镜、透射电镜下细胞形态的变化；细胞凋亡检测：用原位末端标记和连接酶介导PCR方法，从形态和DNA水平分析细胞凋亡；细胞增殖的检测：；细胞骨架蛋白的检测：；晶状体蛋白的检测：,3、拟解决的关键问题： 存在问题：抓不住关键问题或抓得不准。 什么是关键问题 ？ -研究过程中对达预期目标有重要影响的某些研究 内容或因素。 -为达预期目标所必须掌握的关键技术或研究手段。 撰写要求：找出关键问题，提出解决办法。,举例： （1）建立差异表达的
37、cDNA文库： 建立差异cDNA文库是筛选老年性白内障相关基因的前提。为使差异cDNA文库具有代表性，我们采取以下解决方案： 选择各种类型老年性白内障晶状体的前囊膜、取足够大量的标本（拟取50例标本）作为建库的mRNA的来源。 利用改良的消减杂交技术可快速、有效地获得差异表达的完整cDNA片段。此技术是本课题组成员主要的研究成果，在应用此项技术中已积累了较丰富的实验经验。,（2）制备基因芯片： 制备用于本研究的芯片是筛选老年性白内障相关基因的关键环节。制备基因芯片的关键是在 1平方厘米的基片上放上成百上千的不同基因探针而不使它们发生任何混淆。在制作基因芯片时做到：严格按操作程序进行；在标本的处
38、理及RNA提取时避免污染，否则即会造成严重的损失。只要严格按操作程序进行操作就可以避免发生差错。,（3）在体基因转染： 在体基因转染是进行白内障相关基因功能研究的关键。在体的晶状体上皮细胞大部分处在静息状态，只有位于赤道前区的少量细胞具有分裂活性，而且晶状体表面有一层胶原性质的囊膜包裹。在体晶状体的基因转染的关键是如何使大量分裂后细胞转染，如何使病毒穿过晶状体的囊膜，针对以上问题我们拟采取下列方法解决：选用反转录病毒的慢病毒载体（ lentiviral vector ），它克服了一般反转录病毒只能转染有分裂能力细胞的局限性，对分裂后细胞也能有效的转染。这对在体晶状体的基因转染有很大的优越性。采
39、用直径1-2m玻璃微管在显微镜下将病毒载体注入晶状体的前囊膜下，既不破坏晶状体的完整性，又可使病毒接触到囊膜下的上皮细胞。,4、研究方法 存在问题： 过于简单：在方案中只有方法名称而无具体步骤。 过于繁杂：大量罗列一些常规的实验方法。 撰写要求：以研究项目的需求为前提，尽量采用最适合的方法和手段，并将其操作步骤和关键环节体现在技术路线当中。,5、技术路线 存在问题： 不清楚，不详细，不可行。 撰写要求： 清晰、详细、注意逻辑性。 撰写方法： 以时间顺序为主线设计技术路线 以研究内容为主线设计技术路线 分大小标题，突出逻辑关系。 详细地写清楚每个具体步骤。,（1）人晶状体上皮细胞的获得：老年性白
40、内障晶状体上皮细胞取自白内障患者手术中取出的前囊膜（晶状体上皮细胞紧贴于前囊膜），直径约5mm。正常晶状体上皮细胞取自角膜移植供体眼的晶状体，在显微镜下撕下前囊膜，直径约8mm。按文献提供的方法去除晶状体纤维细胞，仔细清洗以去除血细胞污染。 （2）建立差异cDNA文库：从50例白内障手术患者的前囊膜上取下的晶状体上皮细胞作为实验组，从25例正常晶状体前囊膜上取下的晶状体上皮细胞作为对照组，利用改良的消减杂交技术19，20，获得差异表达的cDNA，并建立文库。主要的实验流程如下：,正常晶状体上皮细胞 白内障晶状体上皮细胞 Promega PolyATtract System 1000 mRNA分
41、离 mRNA分离oligo-dT18反转录 ntech Cap-finder方法反转录 cDNA Biotin-21-dUTP pending-cDNA 随机引物PCR 杂交 Sephacryl S-400柱,除盐及小片段 链亲和素-生物素磁性分离 除去杂交体及过量正常晶状体上皮细胞cDNA “长距离”PCR 目的cDNA的特异扩增 克隆、鉴定、转化 建立差异基因文库,（3）制备基因芯片筛选白内障相关基因： 基因芯片的制备： 白内障相关基因的筛选： （4）白内障相关基因的结构分析： 序列测定：. . 序列的计算机分析： . . 获得全长基因： . . （5）基因转染： 培养人晶状体上皮细胞的转
42、染： 在体晶状体的转染：,6、可行性分析 对实验方案设计的分析 理论分析 研究手段方法分析 预实验结果分析 对相关条件的分析 所用特殊实验材料（试剂）的分析 对所具备的实验条件进行分析 对项目组成员搭配及其运用技术方法的能力分析,(1)关于建立差异cDNA文库： 老年性白内障晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞是处在不同状态下的细胞，细胞基因表达的改变 是细胞蛋白功能等改变的基础。寻找这些有差异的基 因是探索细胞功能、状态变化原因的突破口。利用的 消减杂交技术是筛选差异表达基因的有效方法。改良 的消减杂交技术是我们研究组成员建立的方法，应用 此方法已经从脂多糖刺激前后的人牙髓细胞的差异表 达的基因中克隆到脂多糖刺激后特异表达的基因，其 中 5个为新基因，这一研究成果进一步证实了该方法 的可操作性，而且我们在运用此方法过程中也积累了 较丰富的经验，因此，本研究利用这一方法从两种状 态的晶状体上皮细胞中筛选差异表达的基因并建立 cDNA文库是可行的。,7、创新性 存在问题： 对创新点提炼不够 把运用新技术、新方法理解为创新 与研究目标、研究内容相混淆 对创新的理解： 原始创新：填补空白或修改传统的理论 发明创造新技术、新方法 跟踪创新：补充、完善现有理论 修改、完善现有技术方法（112） 提炼方法：用逆向思维方法提炼创新点,
