1、蛋白质分离纯化与检测技术,聚丙烯酰胺凝胶电泳,PolyAcrylamide Gel Electrophoresis,聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（Acr）和交联剂亚甲双丙烯酰胺(Bis) 在加速剂N，N，N，N四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素(C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。凝胶聚合时所形成的微孔影响了不同分子的迁移率，当施加一定电压时小分子的物质的迁移速率将快于大分子的物质，即所谓的分子筛效应。,聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,消除蛋白质分子形状的影响,掩盖不同类蛋白质分子原有的电荷差别,聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，
2、蛋白样品与上样缓冲液混合变性，上样缓冲液中含有SDS和巯基乙醇使得蛋白质分子中的二硫键还原，氢键、疏水键打开，SDS按1.4g SDS/1g蛋白质的比例结合到蛋白质多肽链分子上，形成SDS-多肽复合物。由于十二烷基磺酸根带负电，SDS覆盖于蛋白质的表面，破坏了蛋白质分子的四级结构而使多肽复合物具有近似的形状（长椭圆棒状），并且复合物所带有的负电荷大大超过了多肽分子原有的电荷量，因而掩盖了多肽分子原有的电荷差别。,聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,如图所示，蛋白质所带的电性主要取决于氨基酸R集团所带的电性。图中的H代表无极性的R集团为了躲避水而聚集于内部。 当SDS结合到蛋白质多肽链分子上，形成SDS-多
3、肽复合物后， SDS均匀覆盖于蛋白质的表面，破坏蛋白质分子的疏水作用而成为线性分子。,SDS- 聚丙烯酰胺凝胶使用一种不连续的缓冲系统。在这一系统中，一般凝胶分为低浓度的成层胶（浓缩胶）和较高浓度的分离胶。在电泳时， SDS-多肽复合物向两胶界面迁移，在分离胶表面形成了一个极薄的层，极大地浓缩了样品的体积，使样品在分离之前处于同一起跑线。,试剂,30%凝胶贮备液： 含29%（W/V）丙烯酰胺 1% （W/V）N，N-亚甲双丙烯酰胺10%SDSTEMED（N，N，N，N -四甲基乙烯二胺）10%过硫酸胺Tris- 甘氨酸电泳缓冲液： 25mmol/L Tris 250mmol/L甘氨酸（pH8.
4、3） 0.1%SDS1.5mol/L TrisCl(pH8.8) 分离胶1.0mol/L TrisCl(pH6.8) 浓缩胶,表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋 白 质 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5 核酸(RNA) 104 15-20 104-105 5-10 105-2106 2-2.6,蛋白质的分离纯化,Invitrogen ProbondTM Purification System,分离纯化原理,金属螯合层析：在琼脂糖上偶联了螯合剂亚氨基二乙酸(IDA)钠。
5、IDA的钠盐与金属离子如Ni+螯合后，可与生物分子如蛋白质结合，不同的蛋白质与金属离子结合力不同，从而将蛋白质分离。 ProBond是一种带有正电荷镍离子的琼脂糖树脂，带有6His标签的蛋白与固定在ProBond上的二价镍离子具有高度的亲和性，用某种与吸附蛋白质竞争结合的溶质洗脱亲和基质，特异性地将吸附的各种蛋白质分别洗脱下来。这类溶质包括含-NH2、-COOH、-SH等基团的物质和咪唑等取代剂。,带有HisTag 蛋白质分子,分离纯化原理,咪唑,分离纯化原理,操作流程,一、柱子的制备二、蛋白的纯化,一、柱子的制备,将装有树脂的瓶子不断的颠倒轻敲，使树脂在瓶中重悬。吸取2ml树脂加入纯化柱中，
6、静置5-10分钟，通过重力使树脂沉淀在柱底；也可以通过低速离心（800g,1min）的方法使树脂沉淀在柱底, 轻轻吸去上清液。吸取6ml无菌蒸馏水加入柱中，不断的颠倒轻敲，使树脂在柱中重悬。重复步骤2。在柱子中加入6mL Native Binding Buffer。不断的颠倒轻敲，使树脂在柱中重悬。重复步骤2。重复步骤5-7。,二、蛋白的纯化,吸取8ml溶解产物加入已经制备好的纯化柱中。轻轻滚柱子动使树脂在溶解产物中保持悬浮状态，使带有组氨酸标签的蛋白与树脂充分结合，此过程30-60min。通过重力或低速离心（800g）的方法使树脂沉淀在柱底，轻轻吸去上清夜,上清液于4储存并做SDS-PAGE
7、分析。用8ml Native Wash Binding洗涤，通过重力或低速离心（800g）的方法使树脂沉淀在柱底，轻轻吸去上清夜,上清液于4储存并做SDS-PAGE分析。重复步骤4三次以上。夹紧柱子，使柱子与地面保持垂直，将柱子底端的帽折断，用8-12ml的Native Elution Buffer洗脱蛋白，收集洗脱液，并取少量做SDS-PAGE分析。,抗体的制备,佐剂,佐剂：延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。常用的佐剂是福氏佐剂（Freund
8、adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：29（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入120mg卡介苗就成为完全佐剂。,效价,定 义：抗血清的效价，就是指血清中所含抗体的浓 度或含量。测定方法：双向琼脂糖扩散、ELISA等方法测定。,抗体制备过程,制备纯净的抗原测定抗原浓度，0.5mg/mL。抗原用佐剂乳化一般常用皮下或背部多点皮内注射，首次剂量为300500g，使用完全佐剂。加强免疫的剂量约为首次剂量为1/4左右。每23周加强免疫一次，加强免疫时用不完全佐剂。在第2次加强免疫后2周，从耳缘静脉取23ml，制备血清，检测抗体效
9、价。如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止。当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。,血清的采集,收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm，10min。在无菌条件，吸出血清，分装（0.050.2mL），贮于-40以下冰箱，或冻干后贮存于4冰箱保存。,双向琼脂板扩散免疫试验,双向琼脂板扩散免疫试验又称双向免疫扩散试验，将抗原和相应的抗体分别加入同一凝胶板的相邻小孔中，使两者相互扩散，当扩散到它们比例合适的部位时，就会形成抗原抗体复合物的沉淀，在琼脂中呈现一条乳白色的沉淀线。故此试验可用已知抗原检测未知抗体。由于沉淀线形成的位置
10、与抗原、抗体的浓度相关，抗原浓度越浓，形成的沉淀线距离抗原孔越远，同样，抗体浓度越浓，形成的沉淀线距离抗体孔越远。据此，固定抗原浓度，稀释抗体，可测定抗体效价。,双向琼脂板扩散免疫试验,配制1.5%生理盐水琼脂：100mL生理盐水中加入1.5g优质琼脂粉，置水浴中融化后，加入硫柳汞浓度为0.01%以防腐，分装于小试管中，每管3mL，置于冰箱保存备用；将盛有3mL生理盐水琼脂的小试管置水浴中融化；将融化好的琼脂倾注于载玻片上，每管铺一板，厚度为1mm，共铺3块板；琼脂凝固后，按模板打孔，中心孔为抗原孔，四周8个孔为抗体孔，孔径3mm，孔距4mm。打孔后将载玻片于酒精灯上烘烤背面（温度不宜过高，以
11、不烫手为宜），使琼脂与玻片贴紧；,琼脂板双向扩散免疫实验,将从兔中采得的血清按二倍稀释法稀释成1:2、1:4、1:8、1:16、1:32的不同浓度，同时也将抗原按二倍稀释法稀释成1:2、1:4、1:16；将已经稀释好的抗体按一定的顺序加入到四周孔中，其中一孔滴入生理盐水以做对照（均以滴满不溢出为度或用微量加样器定量加入），中心孔中加入抗原，将已经稀释好的抗原分别滴入3块板的中心孔中；放入湿盒内，置37经24小时观察沉淀线出现的情况，记录结果。以出现明显的沉淀线的最高稀释度为该抗体的效价。,兔抗血清效价检测a、b、c板中心孔为纯化的抗原SCMRP，稀释倍数分别是0、1/4、1/16；四周孔为制备
12、的抗血清梯度稀释液和对照，孔1为生理盐水，孔2-7为抗血清0、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32稀释液，孔8为空白；d板为免疫的1号新西兰大耳兔。 Detection of the rabbit antiserum valuethe center of a, b, c plate is the purification antigen, respectively dilute in the proportion 0, 1/4, 1/16; the around hole is filled with a serial antiserum diluted in grads and the
13、 blank hole; hole 1: isotonic Na chloride, hole 2-7: antiserum respectively dilute in the proportion 0, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32; hole8: blank picture; d: immune New Zealand long ear rabbit.,兔抗血清效价测定,Western Blot,Western Blot原理,Western Blot 印迹常用转移膜及其特点,电转移流程,配制电转移缓冲液，4预冷。将膜与滤纸切成与胶同样的大小。 注： 通常情况下长宽各
14、比胶小1mm； 切一个小小的角以标识正反面和上下。将膜、滤纸与海绵垫在电转移缓冲液中平衡15min-1h 注：PVDF膜在使用前先用100%甲醇浸泡15 s，然后 用去离子水浸泡2min。压膜电转移膜固定：干燥（37干燥h）膜重新湿润：先用100%甲醇浸泡15 s，然后用去离子水浸泡2min,电转移流程,转膜条件,标记,将膜在室温下用封闭试剂封闭20-60分钟，期间不断摇动，如要得到最佳结果，需在室温下封闭1小时。移去封闭剂，加上适当的初级抗体稀释液，在不断摇动下杂交1小时。如果需要，与初级抗体的预杂交可在2-8摇动过夜。洗涤杂交膜，时间5分钟，此过程重复4-6次，移去洗涤缓冲液。加入二抗(辣
15、根过氧化物酶复合物)，在不断摇动下杂交1小时。洗涤杂交膜，时间5分钟，此过程重复4-6次，移去洗涤缓冲。重复过程3以除去没有结合上的辣根过氧化物酶复合物。,显影,工作液的制备：可以可以把过氧化物溶液与发光氨（氨基苯 二酰一肼）以等体积混合。每平方厘米膜使用0.125ml工作液，工作液可以在室温下稳定贮藏8小时。注：暴露于日光或其它强光下可以损坏工作液，为了得到最好的实验结果工作液应贮存在棕色瓶中，避免长时间暴露于任何强光下。膜与工作液杂交5分钟。将杂交膜从工作液中移出，放入一塑料膜保护器中：塑料薄膜或塑料包装。用吸水组织移去多余液体，仔细排出膜杂交与塑料保护器之间的气泡。将膜保护器放入暗盒中，
16、有蛋白质的一面要朝上，关闭所有的灯除了那些适合于胶片曝光的光线（如，红外线）。小心将胶片放在膜上。建议第一次曝光时间是60s，为了得到最佳结果应优化曝光时间，增强放射能照像光强是没有必要的，在胶片曝光之前应避免提前的放射能照像闪光。,注意事项,不要直接用手直接接触杂交膜，应该戴手套或用干净的镊子。上样不应过多。滤纸和膜的长和宽都要比胶小1mm，避免短路。膜要标记好正反面，在感光时要用膜的正面与胶片相贴。压膜时膜与胶之间、膜与滤纸间、胶与滤纸之间要避免有气泡产生；感光时，膜与胶片之间都要避免有气泡产生。膜用工作液处理后，应立即在暗室中使胶片感光。初级抗体的稀释到0.2-1.0g/ml或由1mg/ml的母液按1：1，0001：5，000稀释。抗原抗体的量需要优化，次级抗体的稀释到10-50ng/ml或由1mg/ml的母液按1：20，000-1：100，000稀释。预先统计好所用药品的量；新配制的药品不要存放时间过长最好提前一天配制好，还有一些药品要现用现配。,
