1、动物细胞原代培养-技术细节1、原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。2、传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。3、无菌操作基本技术: 3.1 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射 30-60 分钟灭菌，以 70 %ethanol 擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转 10 分钟后，才开始实验操作。3.2 每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。3
2、.3 实验完毕后，将实验物品带出工作台，以 70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转 10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。3.4 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。3.5 实验用品以 70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面中央无菌区域，勿在边缘非无菌区域操作。 3.6 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约 45 角取用，尽
3、量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 3.7 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少 Class II)。操作过程中，应避免引起 aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及 TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。3.8 定期检测下列项目： CO2 钢瓶的 CO2 压力CO2 培养箱的 CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及 HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/ 预滤网，3000 小时/HEPA)。 4、
4、培养基4.1 液体培养基贮存于 4 冰箱，避免光照，实验进行前放在 37 水槽中温热。 4.2 液体培养基(加血清) 存放期为六个月，期间谷氨酰胺可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量谷氨酰胺。 4.3 粉末培养基配制(注意)： 细胞培养基通常须添加 10 % 血清、pH 为 7.2 - 7.4。粉末培养基及 NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合，然后用 CO2 气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的 pH 易发生改变。纯水配制。以 0.1 或 0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌。标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于 4。须作生
5、长试验与污染测试。 5、抗生素 5.1. 细胞库之细胞培养基不加抗生素 5.1.1. 培养自 ATCC 引进之细胞株，培养基中不加抗生素。 5.1.2. 培养自其它实验室引进之细胞株，须添加抗生素，待 token freeze 通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。 5.2. 寄送活细胞时，须将培养液充满整个培养瓶时，则须添加抗生素(青霉素100 units/ml + 链霉素 100 ug/ml)。 5.3. 若要检测支原体，则培养基内不可添加庆大霉素，因庆大霉素会抑制支原体生长。6、血清：-20或70至 4冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50 ml 无菌离心管可分装 4045 m
6、l。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由20直接至 37解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。7. 血清之沈淀物 7.1. 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质。7.2 显微镜下观察之“ 小黑点 ”：通常经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点” ，一般而言，此小黑点应不会影响细胞的生长。8、细胞冷冻保存注意事项：8.1. 欲冷冻保存之细胞应在生长良
7、好且存活率高之状态，约为 80 90 致密度。 8.2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如 hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。 8.3. 注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色以 510 ml 小体积分装，4避光保存，勿作多次解冻。甘油亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。 9、冷冻细胞活化：1.快速解冻（轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化） ，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。2. 细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生
8、单株抗体或是其它蛋白质)。解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如 DMSO 或 glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。在解冻培养后隔日更换培养基大格*细胞总数 x 2 x 104 / 4= 细胞数/ml1 冷冻管应如何解冻？ 取出冷冻管后， 须立即放入 37 C 水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。2 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除 DMSO？ 除少数特别注明对 DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性
9、细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有 10-15ml 新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除 DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源， 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法
10、存活。5 何谓 FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和 FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。 6 培养细胞时应使用 5 % 或 10% CO2？或根本没有影响？ 一般培养基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作为 pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的 CO2 浓度。当培养基中 NaHCO3 含量为每公升 3.7 g 时
11、，细胞培养时应使用 10 % CO2；当培养基中 NaHCO3 为每公升 1.5 g 时， 则应使用 5 % CO2 培养细胞。7 何时须更换培养基？ 视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。 8 培养基中是否须添加抗生素？ 除于特殊筛选系统中外， 一般正常培养状态下， 培养基中不应添加任何抗生素。 9 附着性细胞继代时所使用之 trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？ 一般使用之 trypsin-EDTA 浓度为 0.05% trypsin-0.53mMEDTA。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于20 C，避免反复冷冻解冻造成 trypsi
12、n 之活性降低， 并可减少污染之机会。 10 悬浮性细胞应如何继代处理？ 一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可， 若培养液太多时， 可将培养角瓶口端稍微抬高， 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶， 加入新鲜培养基稀释至适当浓度， 重复前述步骤即可。 11 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？ 欲回收动物细胞， 其离心速率一般为 300xg (约 1,000rpm)，5 - 10 分钟， 过高之转速， 将造成细胞死亡。 12 细胞之接种密度为何？ 依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦
13、是造成细胞无法生长之一重要原因。 13 细胞冷冻培养基之成份为何？ 动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含 5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和 90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不可将 DMSO 直接加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成。14 DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？ 冷冻保存使用之 DMSO 等级， 必须为 Tissue culture grade 之 DMSO (如 Sigma D2650)， 其本身即为无菌状况， 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于 4
14、C， 避免反复冷冻解冻造成 DMSO 之裂解而释出有害物质， 并可减少污染之机会。若要过滤 DMSO， 则须使用耐 DMSO 之 Nylon 材质滤膜。15 冷冻保存细胞之方法？ 冷冻保存方法一: 冷冻管置于 4 C 3060 分钟 (-20 C30 分钟*) -80 C 1618 小时(或隔夜) 液氮槽 vaporphase 长期储存。 冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降 1-3 C 至80 C 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 长期储存。 *-20 C 不可超过 1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80C 冰箱中，惟存
15、活率稍微降低一些。适用于悬浮型细胞之保存。16 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？ 冷冻管内细胞数目一般为每瓶 1x106 cells/ml， 融合瘤细胞则以每瓶 5x106 cells/ml 为宜。 17 应如何避免细胞污染？ 细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。 18 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？ 加入相应抗生素。直接灭菌后丢弃之。 19 支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是
16、否能以肉眼观察出异状？ 不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。 20 支原体污染会对细胞培养有何影响？ 支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数， 代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。 21 侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？ 直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。 22 CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？ 定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。 23 为何培养基保存于 4 C 冰箱中， 颜色会偏暗红色， 且 pH 值会越来越偏碱性？ 培养基保存于 4 C 冰
17、箱中， 培养基内之 CO2 会逐渐溢出 ，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为 phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时， 可以通入无菌过滤之 CO2， 以调整 pH 值。 24 各种细胞培养用的 dish，flask 是否均相同？ 不同厂牌的 dish 或 flask， 其所 coating 的 polymer 不同， 制造程序亦不同， 虽对大部分细胞没有太大之影响， 惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之 dish 或 flask 而有显著之生长差异。25 购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太
18、少之情形？ 研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少， 大都是因为离心过程操作上的失误， 造成细胞的物理性损伤， 以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心， 应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。 26 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？ 研究人员在细胞培养时出现存活率不佳， 常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后， 加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于80 C 太久。 27 收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？ 冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用
19、力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧 28 如何选用特殊细胞系培养基？ 培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在 MEM 中培养的细胞，很可能在DMEM 或 M199 中同样很容易生长。总之，首选 MEM 做粘附细胞培养、RPMI-1640 做悬浮细胞培养，无血清培养最好首选 AIM V（12005）培养基（SFM ） 。 29 L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？ L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L- 谷氨酰胺可作为培
20、养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。 30 GlutaMAX-I 是什么？培养细胞如何利用 GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？GlutaMAX-I 二肽是一个 L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的 alpha-氨基用 L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放 L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在 121 磅灭菌 20 分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。 31 什
21、么培养基中可以省去加酚红？ 酚红在培养基中被用来作为 PH 值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用， （特别是雌激素） 。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基32 培养基中丙酮酸钠的作用是什么？ 丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。34 二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入 EDTA 的目的是什么？ 二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA 用来
22、螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用 EDTA 清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。 33 目录上说，Hanks 平衡盐溶液 (HBS)要在空气中使用，不需要 CO2 培养箱。原因是什么？Hanks 平衡盐溶液 (HBS)和 Earles 平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？HBS 和 EBS 的主要差别在于 碳酸氢钠的水平,在 Eagles (2.2g/L)中比在 Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的 CO2 平衡，以维持溶液的 PH 值。Eagles 液在空气水平的 CO2 中，溶液会变碱，Hanks 液在 C
23、O2 培养箱中会变酸。如果希望在 CO2 培养箱中保存组织，需要用 Eagles 液， 。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用 Hanks 液就可以了。35 当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的 50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。 36 一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。 37 大部分添加物和试剂最多可以冻融 3 次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。 38
24、在溶解的一周内使用贮存在 4冰箱中的液体胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4就可能开始降解，如果在室温下放置超过 30 分钟，就会变得不稳定。 1. 保存血清最好的方法?建议血清应保存在-5至-2O。然而，若存放于 4时，请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。2. 如何解冻血清才不会使产品质量受损?建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于 28冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。3. 血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理?血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋
25、白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g 稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。4. 为什么要热灭活血清?加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养 ES 细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。5. 有必要做热灭活吗?实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞
26、而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在 37环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。6. 为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?GIBICO 的胎牛血清 没有预老化，储存在 28时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在20储存胎牛血清，
27、避免反复冻融。7. 如何避免血清中沉淀物的产生?解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20至 4至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20 至 37)，实验显示非常容易产生沉淀物。解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。请勿将血清置于37太久。若在 37放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。若必须做血清的热灭活，请遵守56，30 分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。8 细胞冻存复苏原则：慢冻快融当细
28、胞冷到零度以下，可以产生以下变化：1)细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 2)如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶。大结晶会造成细胞膜、细胞器损伤和破裂。3)复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。细胞的冻存 冷冻保护剂：冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。一般只有红细胞、大多微生物和极少数有核的哺乳动物细胞冻存时可不加冷冻保护剂；但对大多数有核哺乳动物细胞来说，冷冻时必须加冷冻保护剂。渗透性冷冻保护剂：甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、甲醇等小分子， 其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定
29、的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤。非渗透性冷冻保护剂：主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP） 、蔗糖、聚 乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等大分子物质。其保护机制的假说很多，其中有一种是，减少冰晶的形成。冷冻保存温度 :液氮温度（-196）是目前最佳的冷冻保存温度。在-196 时，细胞的生命活动几乎完全停止，但复苏后细胞的结构和功能完好。如果冷冻过程得当，一般生物样品在-196 下均可保存十年以上。 -70-80 保存细胞，短期内对细胞的活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显降低。在冰点到-40 范围内保存细胞的效果不佳。note:
30、甘油和 DMSO 并不防止细胞内结冰，在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷，让其渗透到细胞内，细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。DMSO 在常温下对细胞的毒性作用较大，而在 4时，其毒性作用大大减弱，且仍能以较快的速度渗透到细胞内。所以，冻存时 DMSO 平衡多在 4下进行，一般需要 4060 分钟。9. 细胞株运输：1 )贴身运输：短途运输，挑选的生长状态良好的细胞装满培养基，将瓶口用酒精棉球擦拭遍，将瓶盖拧紧，酒精消毒后用封口膜封闭，整个瓶子外表面喷上酒精，用塑料手套包裹后，竖力贴身放置（或者比较温暖的地方） ，运输途中尽量避免剧烈震荡（避免培养基与瓶口接触） 细胞取回后，半
31、量换液（保留吸出的大部分的培养基，以备以后半量换液用） 2 )冰瓶运输：短途运输，从液氮中取出细胞，放入冰盒中转运至新的实验室。3 )液氮罐运输：短途及长途运输，从液氮中取出细胞，放入装满液氮的小型液氮罐中转运至新的实验室10.收到 T25 培养瓶包装细胞， 处理方式为： 1. 寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 培养瓶均加满培养基。收到后应检查培养瓶外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题，不要打开盖子，请立即通知细胞供应者。 2. 将原封之 T25 培养瓶静置于 37 度， 5 % CO2 培养箱中，使细胞回温至 37度， 并让运送过程中少数脱落的细胞可再
32、附着生长。3.隔天后，从无菌操作箱内取出培养瓶内之培养基，(取出之培养基可以再使用)，仅留约 5-10ml，按照一般培养方式再将细胞置入培养箱中，若细胞已长满， 则将细胞做传代培养。MTT 法的原理：噻唑兰，简称 MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性 MTT 还原为难溶于水的 蓝紫色的结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在 490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。 是测定细胞线粒体琥珀酸脱酶的活性，反映的是细胞代谢和增殖活力，而非绝对的细胞数量。荧光显微镜 以紫外线为光源， 用以照射被检物体，使之发出荧光， 然后
33、在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。透射电子显微镜 ：电子束为光源，TEM 的分辨力可达 0.2nm；用电磁场作透镜 ；由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约 50nm 左右的超薄切片。 扫描电子显微镜：用电子和物质的相互作用，可以获取被测样品本身的各种物理、化学性质的信息，如形貌、组成、晶体结构、电子结构和内部电场或磁场等等。 动物细胞培养技术的应用：1. 蛋白质生物制品的生产（如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体）2. 健康细胞培养 （培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植）3. 细胞的生理、药理、病理研究 （用于筛选抗癌药物）超净工作台、生物安全柜、通风橱最主要的区别是什么？1、通
34、风柜也叫通风橱，它是专门针对实验中的一些有毒烟雾和化学气体来设计的，主要是及时排除这些有毒烟雾和化学气体的，但是它不能能有效清除微生物介质，没有装备 HEPA 过滤器，一些放置在通风柜内微生物样品会散播到柜外，污染实验室环境。 2、生物安全柜是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护工作人员、实验室环境以及实验品，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的。 3、超净台就是超净工作台通过吹过工作区域的垂直或水平层流空气防止试验品或产品受到工作区域外粉尘或细菌的污染，是为了保护试验品或产品而设计的。但是一旦微生物样品放置于工作区域，层流空气将把带有微生物介质的空气吹向前台工作人员而产生危险，使用时需十分注意。
