1、第四章 接种、分离纯化和培养技术,第一节 培养基制备技术第二节 接种、分离纯化和培养技术第三节 常用的微生物培养基原理、制作和现象（自学）,第一节 培养基制备技术,一、玻璃器皿的清洗,在制备培养基的过程中，首先要使用一些玻璃器皿，如试管、三角瓶、培养皿、烧杯和吸管等。这些器皿在使用前都要根据不同的情况，经过一定的处理，洗刷干净。有的还要进行包装，经过灭菌等准备就绪后，才能使用。,二、培养基的类型,在实验室中配制的适合微生物生长繁殖或累积代谢产物的任何营养基质，都叫做培养基（Media）。由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多。我们可根据某种标准，将种类繁多
2、的培养基划分为若干类型。,1、根据对培养基组成物质的化学成分是否完全了解来区分，可以将培养基分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基。,天然培养基是指利用各种动、植物或微生物的原料，其成分难以确切知道。用作这种培养基的主要原料有：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、牛奶、血清等。用这些物质配成的培养基虽然不能确切知道它的化学成分，但一般来讲，营养是比较丰富的，微生物生长旺盛，而且来源广泛，配制方便，所以较为常用，尤其适合于配制实验室常用的培养基。这种培养基的稳定性常受生产厂或批号等因素的影响。,1）天然培养基,2）合成培养基,合成培养基是一类化学成分和数量完全知道的
3、培养基，它是用已知化学成分的化学药品配制而成。这类培养基化学成分精确、重复性强，但价格昂贵，而微生物又生长缓慢，所以它只适用于做一些科学研究，例如营养、代谢的研究。,3）半合成培养基,在合成培养基中，加入某种或几种天然成分；或者在天然培养基中，加入一种或几种已知成分的化学药品即成半合成培养基。例如马铃薯蔗糖培养基等。这种培养基在生产实践和实验室中使用最多。,2、根据培养基的物理状态来区分，可以分为：固体培养基、液体培养基半固体培养基。,3、根据培养基的用途来区分，可分为：选择培养基、增殖培养基、鉴别培养基等。,三、培养基制备的基本方法和注意事项,1、培养基配方的选定,同一种培养基的配方在不同著
4、作中常会有某些差别。因此，除所用的是标准方法，应严格按其规定进行配制外，一般均应尽量收集有关资料，加以比较核对，再依据自己的使用目的，加以选用，记录其来源。,2、培养基的制备记录,每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最终pH值、消毒的温度和时间制备的日期和制备者等，记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。,3、培养基成分的称取,培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最好一次完成，不要中断。可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方上做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全
5、称取完毕后，还应进行一次检查。,4、培养基各成份的混合和溶化,培养基所用化学药品均应是化学纯的。使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长。最好使用不锈钢加热溶化，可放入大烧杯或大烧瓶中置高压蒸汽灭菌器或流动蒸汽消毒器中蒸煮溶化。,5、培养基pH的初步调正,因培养基在加热消毒过程中、pH会有所变化，培养基各成分完全溶解后，应进行pH的初步调正。例如，牛肉浸液约可降低 pH 0.2，而肠浸液pH却会有显著的升高。因此，对这个步骤，操作者应随时注意探索经验、以期能掌握培养基的最终pH，保证培养基的质量。pH调整后，还应将培养基煮沸数分钟，以利培养基沉淀物的析出。,6
6、、培养基的过滤澄清,液体培养基必须绝对澄清，琼脂培养基也应透明无显著沉淀，因此，须要采用过滤或其它澄清方法以达到此项要求。一般液体培养基可用滤纸过滤法，滤纸应折叠成折扇或漏斗形，以避免因液压不均匀而引起滤纸破裂。,琼脂培养基可用清洁的白色薄绒布趁热过滤。亦可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤。新制肉、肝、血和土豆等浸液时、则须先用绒布将碎渣滤去，再用滤纸反复过滤。如过滤法不能达到澄清要求、则须用蛋清澄清法。即将冷却至5560的培养基放入大的三角烧瓶内，装入量不得超过烧瓶容量的1/2，每1000ml培养基加入12个鸡蛋的蛋白，强力振摇35分钟，置高压蒸汽灭菌器中、121加热20分钟、取出趁热以绒
7、布过滤即可。,7、培养基的分装,培养基的分装，应按使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶等适当容器内。分装量不得超过容器装盛量的2/3。容器口可用垫有防湿纸的棉塞封堵，其外还须用防水纸包扎（现试管一般多有用螺旋盖者）。分装时最好能使用半自动或电动的定量分装器。分装琼脂斜面培养基时，分装量应以能形成2/3底层和1/3斜面的量为洽当。,分装容器应预先清洗干净并经干烤消毒，以利于培养基的彻底灭菌。每批培养基应另外分装20ml培养基于一小玻璃瓶中，随该批培养基同时灭菌，以为测定该批培养基最终pH之用。,8、培养基的灭菌,一般培养基可采用121高压蒸汽灭菌15分钟的方法。在各种培养基制备方法中，如无特殊规定
8、，即可用此法灭菌。,某些畏热成分，如糖类，应另行配成20%或更高的浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以后再用无菌操作技术、定量加于培养基。明胶培养基亦应用较低温度灭菌。血液、体液和抗生素等则应以无菌操作技术抽取和加入于经冷却约50左右的培养基中。琼脂斜面培养基应在灭菌后立即取出，冷至55-60时，摆置成适当斜面，待其自然凝固。,9、培养基的质量测试,每批培养基制备好以后，应仔细检查一遍，如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。并测定其最终pH。将全部培养基放入361恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。,用有关的标准菌株接种12管或瓶培养基，培养2448小时，如无菌生长
9、或生长不好。应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。,10、培养基的保存,培养基应存放于冷暗处，最好能放于普通冰箱内。放置时间不宜超过一周，倾注的平板培养基不宜超过3天。每批培养基均必须附有该批培养基制备记录副页或明显标签。,第二节 接种、分离纯化和培养技术,一、接种,将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。,1、接种工具和方法,在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均
10、匀涂布时，需要用到涂布棒。,接种和分离工具1.接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀,常用的接种方法有以下几种：,1）划线接种,这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。,2）三点接种,在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。,3）穿刺接种,在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接
11、种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。,4）浇混接种,该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。,5）涂布接种,与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。,6）液体接种,从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液
12、管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。,7）注射接种,该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。,8）活体接种,活体接种是专门用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法，因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖。所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。接种的方式是注射，也可以是拌料喂养。,2、无菌操作,培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这
13、个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。,实验台面不论是什么材料，一律要求光滑、水平。光滑是便于用消毒剂擦洗；水平是倒琼脂培养基时利于培养皿内平板的厚度保持一致。在实验台上方，空气流动应缓慢，杂菌应尽量减少，其周围杂菌也应越少越好。为此，必须清扫室内，关闭实验室的门窗，并用消毒剂进行空气消毒处理，尽可能地减少杂菌的数量。,斜面接种时的无菌操作(1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞,二、分离纯化,含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（Mixed culture）。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个
14、菌落称为纯培养（Pure culture）。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多种。,1、倾注平板法,首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在4050左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。,2、涂布平板法,首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以
15、得到单个菌落。,1、倾注平板法,2、涂布平板法,操作较麻烦，对好氧菌、热敏感菌效果不好！,使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！,3、平板划线法,最简单的分离微生物的方法是平板划线法。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。,平板划线分离法1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法,三、培养,微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外，还受到许多外界因素的影响，
16、如营养物浓度、温度、水分、氧气、等。微生物的种类不同，培养的方式和条件也不尽相同。,2、培养方法,1）根据培养时是否需要氧气，可分为好氧培养和厌氧培养两大类。,好氧培养：也称“好气培养”。就是说这种微生物在培养时，需要有氧气加入，否则就不能生长良好。在实验室中，斜面培养是通过棉花塞从外界获得无菌的空气。三角烧瓶液体培养多数是通过摇床振荡，使外界的空气源源不断地进入瓶中。,厌氧培养：也称“厌气培养”。这类微生物在培养时，不需要氧气参加。在厌氧微生物的培养过程中，最重要的一点就是要除去培养基中的氧气。一般可采用下列几种方法：,a. 降低培养基中的氧化还原电位：常将还原剂如谷胱甘肽、硫基醋酸盐等，加
17、入到培养基中，便可达到目的。有的将一些动物的死的或活的组织如牛心、羊脑加入到培养基中，也可适合厌氧菌的生长。,b. 化合去氧：这也有很多方法，主要有：用焦性没食子酸吸收氧气；用磷吸收氧气；用好氧菌与厌氧混合培养吸收氧气；用植物组织如发芽的种子吸收氧气；用产生氢气与氧化合的方法除氧。,c. 隔绝阻氧：深层液体培养；用石蜡油封存；半固体穿刺培养。d. 替代驱氧：用二氧气碳驱代氧气；用氮气驱代氧气；用真空驱代氧气；用氢气驱代氧气；用混和气体驱代氧气。,第三节 常用的微生物培养基原理、制作和现象,牛肉膏 5g蛋白胨 10g氯化钠 3g磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O) 2g0.2%滇麝香草酚蓝溶液
18、 12mL蒸馏水 1000mLpH7.4,1、糖发酵管,1）成分,2）制法, 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121高压灭菌15min。 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100mL，121高压灭菌15 min。另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入于100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。 注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。,3）试验方法,从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于361培养，一般观察23d。迟缓反应需观察1430d。,2、ONPG培养基,1）成分,邻硝基酚D-半乳糖昔(ONP
19、G) 60mg (O-Nitrophenyl-D-galactopyranoside)0.01mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.5)10mL1%蛋白胨水(PH7.5)30mL,2）制法,将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于10mm75mm试管，每管0.5mL，用橡皮塞塞紧。,自琼脂斜面上挑取培养物1满环接种，于361培养13h和24h观察结果。如果-半乳糖苷酶产生，则于13h变黄色，如无此酶则24h不变色。,3）试验方法,3、缓冲葡萄糖蛋白胨水 （MR和VP试验用）,1）成分,磷酸氢二钾 5g蛋白胨7g葡萄糖5g蒸馏水1000mLpH7.0,2）制法,3）甲基红(MR)试验
20、,溶化后校正pH，分装试管，每管1mL，121高压灭菌15min。,自琼脂斜面挑取少量培养物接种本培养基中，于361培养25d，哈夫尼亚菌则应在2225培养。滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。甲基红试剂配法：10mg甲基红溶于30mL95%乙醇中，然后加入20mL蒸馏水。,4）V-P试验,用琼脂培养物接种本培养基中，于361培养24d。哈夫尼亚菌则应在2225培养。加入6%-萘酚-乙醇溶液0.5mL和40%氢氧化钾溶液0.2mL，充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，应放在361下培养4h再进行观察。,4、西蒙氏柠檬酸盐培养基,1）成分,
21、氯化钠5g硫酸镁(MgSO47H2O) 0.2g磷酸二氢铵1g磷酸氢二钾1g柠檬酸钠5g琼脂20g蒸馏水1000mL0.2%溴麝香草酚蓝溶液 40mLpH6.8,2）制法,3）试验方法,先将盐类溶解于水内，校正pH，再加琼脂，加热溶化。然后加入指示剂，混合均匀后分装试管，121高压灭菌15min。放成斜面。,挑取少量琼脂培养物接种，于361培养4d，每天观察结果。阳性者斜面上有菌落生长，培养基从绿色转为蓝色。,5、克氏柠檬酸盐培养基,1）成分,柠檬酸钠 3g葡萄糖 0.2g酵母浸膏 0.5g单盐酸半胱氨酸 0.1g磷酸二氢钾 1g氯化钠 5g0.2%酚红溶液6mL琼脂 15g蒸馏水 1000m
22、L,2）制法,3）试验方法,加热溶解，分装试管，121高压灭菌15min。放成斜面。,用琼脂培养物接种整个斜面，在361培养7d，每天观察结果。阳性者培养基变为红色。,6、丙二酸钠培养基,1）成分,酵母浸膏 1g硫酸铵 2g磷酸氢二钾 0.6g磷酸二氢钾 0.4g氯化钠 2g丙二酸钠 3g0.2%溴麝香草酚蓝溶液12mL蒸馏水 1000mLpH6.8,2）制法,3）试验方法,先将酵母浸膏和盐类溶解于水，校正pH后再加入指示剂，分装试管，121高压灭菌15min。,用新鲜的琼脂培养物接种，于361培养48h，观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。,7、葡葡糖铵培养基,1）成分,氯化钠5g硫酸镁(MgS
23、O47H2O) 0.2g磷酸二氢铵1g磷酸氢二钾1g葡萄糖2g琼脂20g蒸馏水1000mL0.2%溴麝香草酚蓝溶液 40mLpH6.8,2）制法,先将盐类和糖溶解于水内，校正pH，再加琼脂，加热溶化，然后加入指示剂，混合均匀后分装试管，121高压灭菌15min，放成斜面。,注：容器使用前应用清洁液浸泡。再用清水、蒸馏水冲洗干净，并用新棉花做成棉塞，干热灭菌后使用。如果操作时不注意，有杂质污染时，易造成假阳性的结果。,3）试验方法,用接种针轻轻触及培养物的表面，在盐水管内做成极稀的悬液，肉眼观察不见混浊，以每一接种环内含菌数在20100之间为宜。将接种环灭菌后挑取菌液接种，同时再以同法接种普通斜
24、面一支作为对照。于361培养24h。阳性者葡萄糖铵斜面上有正常大小的菌落生长；阴性者不生长，但在对照培养基上生长良好。如在葡萄糖铵斜面生长极微小的菌落可视为阴性结果。,8、Hugh-Leifson培养基(O/F试验用),1）成分,蛋白胨2g氯化钠5g磷酸氢二钾 0.3g琼脂4g葡萄糖10g0.2%溴麝香草酚蓝溶液 12mL蒸馏水1000mLpH7.2,2）制法,将蛋白胨和盐类加水溶解后，校正pH至7.2。加入葡萄糖、琼脂煮沸，溶化琼脂，然后加入指示剂。混匀后，分装试管，121高压灭菌15min，直立凝固备用。,3）试验方法,从斜面上挑取小量培养物作穿刺接种，同时接种两支培养基，其中一支于接种后
25、滴加溶化的1%琼脂液于表面，高度约1cm，于361培养。,9、马尿酸钠培养基,1）成分,马尿酸钠1g肉浸液100mL,2）制法,将马尿酸钠溶解于肉浸液内，分装于小试管内，并于管壁画一横线。以标志管内液面高度，高压灭菌12120min。,3）试剂,三氯化铁(FeCl36H2O)12g，溶于2%盐酸溶液100mL中即成。,4）试验方法,用纯培养物接种，于42培养48h，观察培养液是否到达试管壁上记号处，如不足时，用蒸馏水补足至原量。经离心沉淀，吸取上清液0.8mL，加入三氯化铁试剂0.2mL，立即混合均匀，经1015min，观察结果。,出现恒久之沉淀物为阳性。,5）结果,10、营养明胶,1）成分,
26、蛋白胨5g牛肉膏3g明胶120g蒸馏水1000mLpH6.87.0,2）制法,加热溶解、校正至pH7.47.6，分装小管，121高压灭菌10min，取出后迅速冷却，使其凝固。复查最终pH应为6.87.0。,3）试验方法,用琼脂培养物穿刺接种，放在2225培养，每天观察结果，记录液化时间。或放在361培养，每天取出，放冰箱内30min后再观察结果。,11、苯丙氨酸培养基,1）成分,酵母浸膏 3gDI-苯丙氨酸(或L苯丙氨酸1g) 2g磷酸氢二钠 1g氯化钠 5g琼脂 12g蒸馏水 1000mL,2）制法,3）试验方法,加热溶解后分装试管，121高压灭菌15min，使成斜面。,自琼脂斜面上挑取大量
27、培养物，移种于苯丙氨酸琼脂，在361培养4h或1824h。滴加10%三氯化铁溶液23滴，自斜面培养物上流下，苯丙氨酸脱氨酶阳性者呈深绿色。,12、氨基酸脱羧酶试验培养基,1）成分,蛋白胨5g酵母浸膏3g葡萄糖1g蒸馏水1000mL1.6%滇甲酚紫-乙醇溶液 1mLL-氨基酸或DL-氨基酸 0.5或1g/100mLpH6.8,2）制法,除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶100mL，分别加入各种氨基酸：赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。L-氨基酸按0.5%加入，DL-氨基酸按1%加入。再行校正pH至6.8。对照培养基不加氨基酸。分装于灭菌的小试管内，每管0.5mL，上面滴加一层液体石蜡，115高压灭菌1
28、0min。,3）试验方法,从琼脂斜面上挑取培养物接种，于361培养1824h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。,13、蛋白胨水(靛基质试验用),1）成分,蛋白胨(或胰蛋白胨) 20g氯化钠 5g蒸馏水 1000mLpH7.4,2）制法,按上述成分配制，分装小试管，121高压灭菌15min。,3）靛基质试剂,柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中。然后缓慢加入浓盐酸25mL。 欧-波试剂：将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95mL95%乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸20mL。,4）试验方法,挑取小量培
29、养物接种，在361培养12d，必要时可培养45d。加入柯凡克试剂约0.5mL，轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧-波试剂约0.5mL，沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。注：蛋白胨中应含有丰富的色氨酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。,14、硫酸亚铁琼脂(硫化氢试验用),1）成分,牛肉膏 3g酵母浸膏 3g蛋白胨 10g硫酸亚铁 0.2g硫代硫酸钠 0.3g氯化钠 5g琼脂 12g蒸馏水 1000mLpH7.4,2）制法,3）试验方法,加热溶解，校正pH，分装试管，115高压灭菌15min，取出直立候其凝固。,挑取琼脂培养物，沿管壁穿刺，于361
30、培养12d，观察结果。产硫化氢者使培养基变为黑色。注：肠杆菌科细菌测定硫化氢的产生，应采用三糖铁琼脂或本培养基。,15、尿素琼脂,1）成分,蛋白胨1g氯化钠5g葡萄糖1g磷酸二氢钾2g0.4%酚红溶液 3mL琼脂20g蒸馏水1000mL20%尿素溶液 100mLpH7.20.1,2）制法,将除尿素和琼脂以外的成分配好，并校正pH，加入琼脂，加热溶化并分装烧瓶。121高压灭菌15min。冷至5055，加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2%，最终pH应为7.20.1。分装于灭菌试管内，放成斜面备用。,3）试验方法,挑取琼脂培养物接种，在361培养24h，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培
31、养基变为红色。,16、氰化钾(KCN)培养基,1）成分,蛋白胨 10g氯化钠 5g磷酸二氢钾 0.225g磷酸氢二钠 5.64g蒸馏水 1000mL0.5%氰化钾溶液 20mLpH7.6,2）制法,将除氰化钾以外的成分配好后分装烧瓶，121高压灭菌15min。放在冰箱内使其充分冷却。每100mL培养基加入0.5%氰化钾溶液2.0mL(最后浓度为110000)，分装于12mm100mm灭菌试管，每管约4mL，立刻用灭菌橡皮塞塞紧，放在4冰箱内，至少可保存两个月。同时，将不加氰化钾的培养基作为对照培养基，分装试管备用。,3）试验方法,将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液，挑取1环接种于氰化钾(
32、KCN)培养基。并另挑取1环接种于对照培养基。在361培养12d，观察结果。如有细菌生长即为阳性(不抑制)，经2d细菌不生长为阴性(抑制)。,注：氰化钾是剧毒药物，使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严，氰化钾逐渐分解，产生氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意。,17、硝酸盐培养基,1）成分,硝酸钾 0.2g蛋白胨 5g蒸馏水 1000mLpH7.4,2）制法,溶解，校正pH，分装试管，每管约5mL，121高压灭菌15min。硝酸盐还原试剂甲液：将对氨基苯磺酸0.8g溶解于2.5mol
33、/L乙酸溶液100mL中。乙液：将甲萘胺0.5g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100mL中。,接种后在361培养14d，加入甲液和乙液各一滴，观察结果。硝酸盐还原为亚硝酸盐时于立刻或数分钟内显红色。 注：本试验阴性的原因有三：细菌不能还原硝酸盐；亚硝酸盐继续分解，生成氨和氮；培养基不适于细菌的生长。如欲检查培养基中硝酸盐是否未被分解，可再加入锌粉少许，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐而呈现红色。,3）试验方法,18、氧化酶试验,1）试剂,1%盐酸二甲基对苯二胺溶液：少量新鲜配制，干冰箱内避光保存。 1%-萘酚乙醇溶液。,2）试验方法,取白色洁净滤纸沾取菌落。加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴，阳性者呈现粉红
34、色，并逐渐加深；再加-萘酚溶液一滴，阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色。阴性于两分钟内不变色。 以毛细吸管吸取试剂，直接滴加于菌落上，其显色反应与以上相同。,19、细胞色素氧化酶试验,1）试剂,1%盐酸二甲基对苯二胺溶液：少量新鲜配制，干冰箱内避光保存。 1%-萘酚乙醇溶液。,2）试验方法,取37(或低于37)培养20h的斜面培养物一支，将两种试剂各23滴，从斜面上端滴下，并将斜面略加倾斜，使试剂混合液流经斜面上的培养物。如系平板培养物，则可用试剂混合液滴在菌落上。,3）结果,于2min内呈现蓝色者为阳性。阳性培养物大多数于半分钟内出现强阳性反应，2min以后出现微弱或可疑反应均作为阴性结果。,20、
35、过氧化氢酶试验,1）试剂,3%过氧化氢溶液：临用时配制。,2）试验方法,挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2mL，观察结果。,3）结果,于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。,21、过氧化物酶试验,1）试剂,2）试验方法,2%儿茶酚溶液。3%过氧化氢溶液。,挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加2%儿茶酚溶液1mL及3%过氧化氢溶液1mL。静置于室温(20)中3060min，观察结果。,3）结果,阳性反应，细菌变为黑褐色；阴性反应，细菌不变色。注：过氧化物酶的作用可受氰化钾的抑制。,22、磷酸盐缓冲液,1）储存液,磷酸二氢钾34g1mol/
36、L氢氧化钠溶液 175mL蒸馏水825mLpH7.2,2）制法,先将磷酸盐溶解于500mL蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠溶液校正pH后，再用蒸馏水稀释至1000mL。,3）稀释液,取储存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL。分装每瓶100mL或每管10mL，121高压灭菌15min。,23、明胶磷酸盐缓冲液,1）成分,明胶2g磷酸氢二钠4g蒸馏水1000mLpH6.2,2）制法,加热溶解，校正pH，121高压灭菌15min。,24、乳酸苯酚溶液 （检验真菌形态用）,1）成分,2）制法,苯酚 10g乳酸(比重1.21)10g甘油 20g蒸馏水 10mL,将苯酚在水中加热溶解，然后加入乳酸
37、及甘油。,25、肉浸液肉汤,1）成分,绞碎牛肉500g氯化钠5g蛋白胨10g磷酸氢二钾2g蒸馏水1000mL,2）制法,将绞碎之去筋膜无油脂牛肉500g加蒸馏水1000mL，混合后放冰箱过夜，除去液面之浮油，隔水煮沸半小时，使肉渣完全凝结成块，用绒布过滤，并挤压收集全部滤液，加水补足原量。加入蛋白胨、氯化钠和磷酸盐，溶解后校正pH7.47.6煮沸并过滤，分装烧瓶，121高压灭菌30min。,26、肉浸液琼脂,1）成分,2）制法,肉浸液肉汤(PH7.4) 1000mL琼脂 1720g,加热溶化琼脂，分装烧瓶或试管，121高压灭菌30min。根据需要，倾注平板或放成斜面。,27、牛肉(或牛心)消化
38、汤,1）成分,绞碎牛肉(或牛心) 1000g15%氢氧化钠溶液27mL胰蛋白酶40mL三氯甲烷1mL氯化钠10g蒸馏水2000mL,2）制法, 称取碎牛肉，加蒸馏水，隔水加热到80，维持15min。 加氢氧化钠溶液，对pH试纸呈弱碱性，冷至40。 加胰蛋白酶、氯仿，在361放置45h，每小时摇动一二次。 4h后，吸取上层液5mL于试管中，加5%硫酸铜溶液0.1mL、4%氢氧化钠溶液5mL，混合之。若呈红色，则不须再消化，可由温箱取出。, 加入15%乙酸溶液45mL，对pH试纸呈酸性。 煮沸15min，使胰蛋白酶破坏，冷后，放冰箱内一夜。 次日吸取上层清液，加氯化钠10g，并加水补足原量，煮沸。
39、 校正pH7.47.6(加15%氢氧化钠溶液约10mL)，加热，用滤纸过滤，分装烧瓶，121高压灭菌20min。,注：此培养基可作为琼脂培养基的基础，不需加蛋白胨。胰蛋白酶之配制：称取去脂绞碎的猪胰500g，加入乙醇500mL、蒸馏水1500mL，混合之，装人玻塞瓶内。每日摇匀三次。3d后，用绒布过滤挤出其汁，加盐酸至0.05%，放冰箱内保存备用。,28、血消化汤,1）成分,绞碎猪胃100g绞碎猪血块100g蒸馏水1000mL浓盐酸10mL,2）制法, 洗涤猪胃，除去油脂，保留胃粘膜，用绞肉机绞碎。 用绞肉机将猪血块绞碎。 将蒸馏水加热至55，加入猪胃、猪血块和盐酸，置55水浴中24h，时常加
40、以摇动。 从水浴内取出，加入1moL/L碳酸钠溶液5mL，煮沸10min，置于冰箱内一夜。, 吸取上层清液，加磷酸氢二钾1g，加热至75，加入1mol/L碳酸钠溶液45mL，煮沸，校正pH7.27.4。 用滤纸过滤，分装烧瓶，121高压灭菌20min。,注：本培养基不含糖可供作鉴别培养基之基础，不需加蛋白胨和氯化钠。1mol/L碳酸钠溶液之配法：无水碳酸钠10.6g，溶于1000mL蒸馏水中。,29、豆粉琼脂,1）成分,牛心消化汤(PH7.47.6)1000mL琼脂 20g黄豆粉浸液 50mL,将琼脂加在牛心消化汤内，加热溶解，过滤。加入豌豆粉浸液，分装每瓶100mL，121高压灭菌15min
41、。豌豆粉浸液制法：取豌豆粉5g、氯化钠10g，加入蒸馏水100mL。置100水浴内加热1h，放于冰箱中过夜。吸取上清液即为豌豆浸液。,2）制法,30、血琼脂,1）成分,2）制法,pH7.47.6豆粉琼脂100mL脱纤维羊血(或兔血) 510mL,加热溶化琼脂，冷至50，以灭菌手续加入脱纤维羊血，摇匀，倾注平板。亦可分装灭菌试管，置成斜面。亦可用其他营养丰富的基础培养基配制血琼脂。,31、营养琼脂,1）成分,蛋白胨 10g牛肉膏3g 氯化钠5g琼脂1520g蒸馏水 1000mL,2）制法,将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.27.4。加入琼脂，加热煮
42、沸，使琼脂溶化。分装烧瓶，121高压灭菌15min。注：此培养基可供一般细菌培养之用，可倾注平板或制成斜面。如用于菌落计数，琼脂量为1.5%；如作成平板或斜面，则应为2%。,32、营养肉汤,1）成分,2）制法,蛋白陈10g牛肉膏3g氯化钠5g蒸馏水1000mLpH7.4,按上述成分混合，溶解后校正pH，分装烧瓶，每瓶225mL，121高压灭菌15min。,33、乳糖胆盐发酵管,1）成分,蛋白胨20g猪胆盐(或牛、羊胆盐) 5g乳糖10g0.04%滇甲酚紫水溶液 25mL蒸馏水1000mLpH7.4,2）制法,将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装每管10mL，并放入一个小倒管
43、，115高压灭菌15min。注：双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。,34、乳糖发酵管,1）成分,蛋白胨20g乳糖10g0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL蒸馏水1000mLpH7.4,2）制法,将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，按检验要求分装30mL、10mL或3mL，并放入一个小倒管，115高压灭菌15min。注：双料乳糖发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。30mL和10mL乳糖发酵管专供酱油及酱类检验用，3mL乳糖发酵管供大肠菌群证实试验用。,35、EC肉汤,1）成分,胰蛋白胨20g3号胆盐(或混合胆盐) 1.5g乳糖5g磷酸氢二钾4g磷酸二氢钾1.5g氯化钠5g蒸馏水1000mL,2）制法,将上述成分混合，溶解后，分装有发酵倒管的试管中，121高压灭菌15min，最终pH为6.90.2。,36、缓冲蛋白胨水(BP),1）成分,蛋白胨10g氯化钠5g磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)9g磷酸二氢钾 1.5g蒸馏水1000mLpH7.2,2）制法,按上述成分配好后以大烧瓶装，121高压灭菌15min。临用时无菌分装每瓶225mL。注：本培养基供沙门氏菌前增菌用。,37、氯化镁孔雀绿增菌液(MM),1）成分,甲液胰蛋白胨5g氯化钠8g磷酸二氢钾1.6g蒸馏水1000mL乙液氯化镁(化学纯) 40g蒸馏水 100mL丙液0.4%孔雀绿水溶液。,
