1、加强微生物监测、提高抗感染治疗水平,安徽省细菌耐药监控中心安徽医科大学临床检验诊断学教研室安徽医科大学第一附属医院检验科徐元宏,一、正确留取标本是获得准确结果的前提,1.血液、骨髓、无菌体液：（1）严格消毒、避免体表正常菌群的污染。（2）应在抗生素使用之前抽血。如果病人已使用抗生素，应选择含中和剂（活性炭、中性树脂）的培养瓶，或在下次用药前采血。（3）由于血液、骨髓、无菌体液含有极少量的病原体，就可以造成感染性疾病，而实验室检出率与病原体数量有关，并非只要有病原体就能检验出来，因此血液、骨髓、无菌体液等必须增菌才能获得满意结果。成人未使用抗生素治疗采集骨髓0.5-1毫升，血液、胸腹水、关节液3
2、-10毫升接种成人培养瓶（蓝盖）；成人已使用抗生素治疗采集上述标本接种加中性树脂培养瓶（灰盖）；儿童采集骨髓0.5-1毫升，血液、胸腹水，关节液1-3毫升接种儿童培养瓶（红盖）；厌氧培养接种上述标本3-10毫升于厌氧培养瓶（黄盖）。（4）由于菌血症、败血症是间歇排菌，应在发热高峰时采血，对于感染性心内膜炎患者增加采血次数，以提高阳性率。,2.导管相关性的血流感染（CRBSI）血培养（1）第一采集方法经外周静脉穿刺采血1套（送两个培养瓶）；从导管中心或静脉留置口隔膜采血1套，两者的采血时间应该接近（5分钟）。,结果解释：（a）依据细菌鉴定和药敏试验确认，若两套阳性血培养是同一种细菌，又没有其它部
3、位的感染，提示CRBSI；（b）若两套阳性血培养瓶是同一种细菌，从导管采血血培养报告阳性时间比外周静脉穿刺采血早120分钟，又没有其它部位的感染，提示CRBSI；,（c) 依据细菌鉴定和药敏试验确认，若两套阳性血培养是同一种细菌，又没有其它部位的感染，从导管采血血培养报告阳性时间比外周静脉穿刺采血不足120分钟，提示CRBSI；（d）若外周静脉穿刺采血血培养是阴性，只有导管采血的血培养是阳性，不能定为CRBSI；,（e）若只有外周静脉穿刺采血的血培养是阳性，但分离菌为金黄色葡萄球菌或念珠菌，且没有任何其它部位感染的证据，提示高度可疑为CRBSI；（f）若再次导管采血/外周采血，若培养阳性，且是
4、同一种细菌，可定为CRBSI；,（2）第二种采集方法： 外周静脉穿刺采血采集12套，同时拔出导管，用Maki导管平皿滚动法，对导管尖片段进行半定量培养。,结果解释：（a）如果两套外周静脉穿刺采血培养是阳性，导管片段培养为阳性（15CFU/平皿），提示为CRBSI；（b）如果两套外周静脉穿刺采血培养是阴性，导管片段培养为阳性，提示可能为导管上的定植菌，不支持CRBSI；,（c）若所有的血培养和导管片段培养是阴性，不太可能是CRBSI；（d）如果有1套的血培养是阳性，导管片段的培养是阴性，但分离株是金黄色葡萄球菌或念珠菌，且没有任何其它部位的感染证据，提示仍有可能是CRBSI。,3.尿液：（1）导
5、尿法：是一种较好的无菌采集法，主要适用于手术后患者，取10-15毫升尿液于无菌容器内送检，但留置导尿管易造成医院内感染。（2）中段尿采集法：是临床上最多采用的方法，女性病人先以肥皂水或1：1000高锰酸钾水溶液冲洗外阴及阴道口；男性病人应翻转包皮冲洗，用1：1000新洁尔灭消毒尿道口，在用无菌纱布擦干，让病人排尿，弃去前段尿，收集中段尿1020ml，盛于无菌容器内，立即加盖送检。,（3）肾盂尿采集法：为确定菌尿是否来自肾脏，可用导尿管采集肾盂尿。首先充分冲洗膀胱，以最后一次冲洗尿作对照，后用导尿管插入输尿管，分别标记左右侧，收集3次尿；如果输尿管菌数比对照尿菌数多或第3次尿中菌数比第1次多，该
6、菌尿可能来自肾脏。反之，如果第1次尿菌数多于第3次尿菌数，则可能来自膀胱。肾盂尿采集法一般应该请泌尿科医师协助进行，并确实做好标记，以防左右侧搞错。,（4）膀胱穿刺尿采集法：将病人耻骨上皮肤碘酒、酒精消毒后，以无菌针筒作膀胱穿刺。此法主要用于尿液中厌氧菌的培养，故在取得尿液后，针头插于橡皮塞上送检。当儿童或婴儿采集中段尿困难或培养结果与患者病情有矛盾时，可考虑用此法采集尿液。（5）留尿法：尿液检查结核分枝杆菌时，可用一洁净容器，留取24h的尿液，取其沉淀部分200-250毫升盛于清洁瓶内送检。实验室人员接受后应全部离心，涂片镜检。,4.痰液：正常人下呼吸道是无菌的，上呼吸道有正常菌群寄居。下呼
7、吸道的分泌物必须通过上呼吸道，常受上呼吸道的正常菌群的污染。因此对于下呼吸道分泌物培养出来的结果必须分析、判断。一般要求病人清晨用无菌生理盐水漱口6次，再用冷开水漱口一次，用力咳深部的痰液于无菌容器内送检，避免口水的污染。对于痰液不能自主咳出，可采用高渗盐水雾化吸入排痰。,实验室在收到痰标本，涂片革兰染色（SEC25/LPF）可做细菌培养，记录涂片结果，SEC25/LPF，WBC1菌落=耐药推荐质控菌：金黄色葡萄球菌ATCC29213敏感，金黄色葡萄球菌ATCC43300-耐药,目前治疗方案：MRS轻度感染 ：利福平、SMZ-TMP、环丙沙星；严重感染：万古霉素。对万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌
8、称之为VRSA（Vancomycin-risistant S.aureus） 只能用链阳霉素治疗。目前金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药尚不多见，国外学者将肠球菌耐万古霉素基因转移到金黄色葡萄球菌中已获得成功；日本、香港散在报道且仅万古霉素低度耐药（MIC8 g/ml），且国际上尚未承认；2002年6月美国从一40岁患有糖尿病、慢性肾脏衰竭患者导管中分离到对苯唑青霉素MIC 16 g/ml,对万古霉素MIC128 g/ml的耐万古霉素的金黄色葡萄球菌，VRSA就在我们眼前。,2.肠球菌的检测：肠球菌是一种重要的病原微生物，实验室应做高耐庆大霉素肠球菌的检测。若高耐庆大霉素，则不能和作用细胞壁的药物（
9、如氨苄西林、青霉素、万古霉素）协同使用。 有条件的实验室还应作Van A,Van B,Van C耐药基因监测。治疗原则：Van A：青霉素敏感（S），氨基糖苷类非高耐-青霉素+庆大霉素；青霉素耐药（R），氨基糖苷类非高耐-青霉素/头孢类+壁霉素+庆大霉素。Van B：氨基糖苷类非高耐株-壁霉素+庆大霉素。氨基糖苷类高耐株-壁霉素，新生霉素+氟喹诺酮类。多重耐药的肠球菌目前尚无有效的治疗方案。,（2）肠球菌高水平氨基糖苷类耐药和万古霉素耐药筛选试验（琼脂稀释法）筛选试验 庆大霉素HLAR抗生素含量： 500g/ml接种： 液体生长法或直接菌落法至 0.5麦氏比浊管。琼脂-10ul0.5麦氏比浊管
10、悬液点种在琼脂表面。 孵育条件 35空气孵育时间 24小时结果：琼脂：1菌落=耐药；肉汤：任何生长=耐药,耐药-不能和作用细胞壁的药物协同（如氨苄西林、青霉素、万古霉素），敏感-可以和敏感的作用于细胞壁的药物协同（如氨苄西林、 青霉素、万古霉素）。质控菌株：粪肠球菌ATCC29212-敏感；粪肠球菌ATCC51299-耐药,筛选试验： 万古霉素耐药抗生素含量： 6 g/ml接种：肉汤-推荐标准肉汤稀释法。 液体生长法或直接菌落法至 0.5麦氏比浊管。1-10 l0.5麦氏 比浊管悬液点种在琼脂表面。 孵育条件 ：35空气孵育时间 ：24小时结果： 1菌落=耐药 进行万古霉 素MIC测定 和动力
11、试验产生的色素来区别获得性耐药 （VanA,VanB） 和那些对万古霉素天然的中 水平耐药（VanC） 如敦鸡肠球菌、铅 肠球菌和黄肠球菌， 它们通常在万古霉素 筛选平板上生长。质控菌株：粪肠球菌ATCC29212-敏感；粪肠球菌ATCC51299-耐药,3.超广谱 内酰胺酶检测： 超广谱-内酰胺酶（ESBLs）是大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯氏菌等革兰氏阴性杆菌在抗生素选择压力下产生。它是质粒介导的对第一、二、三头孢菌素、氧亚氨基-内酰胺抗生素耐药，有时尽管体外试验是敏感的，是-内酰胺酶基因Tem-1,Tem-2,SHV-1突变而来。 ESBLs编码基因在质粒上，易在不同菌株间播散，表
12、现为多重耐药。目前将ESBLs分为TEM型、SHV型、OXA型、CTX-M型。共同特点是能被-内酰胺酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦所抑制。,(1)纸片初筛：培养基： Muller-Hinton琼脂药敏纸片浓度: 头孢泼肟 10 g 或头孢他啶30 g 或头孢噻肟 30 g 或头孢曲松 30 g （使用两个以上纸片做筛选试验可提高检出灵敏度）接种：按标准纸片扩散法孵育条件： 35大气环境孵育时间： 16-18小时结果： 头孢泊肟抑菌环 22mm， 头孢他啶抑菌环22mm，氨曲南抑菌环 27mm，头孢噻肟抑菌环27mm，头孢曲松抑菌环 25mm，=可能产生ESBL。建议质控方法: 大肠埃希菌
13、ATCC25922（参考NCCLS抑菌标准） 肺炎克雷伯菌 ATCC700603:头孢泼肟抑菌环 9-16mm,头孢他啶抑菌环 10-18mm,氨曲南抑菌环 9-17mm,头孢噻肟抑菌环 17-25mm,头孢 曲松抑菌环 16-24mm。,(2)纸片确证试验：培养基： Muller-Hinton琼脂药敏纸片浓度： 头孢噻肟 30 g 、 头孢噻肟/棒酸 30 g/10 g和头孢他啶/棒酸 30 g/10 g接种： 按标准纸片扩散法孵育条件 ： 35大气环境孵育时间 ： 16-18小时 结果：混合棒酸药物纸片的抑菌圈直径比无棒酸药物纸片的直径大5 mm 以上=ESBL建议质控方法：大肠埃希菌AT
14、CC25922单独药物和混合棒酸药物两种纸片的抑菌环直径相差不大于2mm。肺炎克雷伯菌 ATCC700603：头孢他啶单独药物和混合棒酸药物纸片抑菌环较头孢他啶单独药物纸片抑菌环直径增大5 mm以上，头孢噻肟单独药物和混合棒酸药物纸片抑菌环较头孢噻肟单独药物纸片抑菌环直径 增大3 mm以上。,(3)液体稀释法初筛:培养基： CAMHB（调节好阳离子的M-H肉汤）抗生素浓度：头孢泼肟 4g/ml 或 头孢他啶1 g/ml 或氨曲南 1 g/ml 或头孢噻肟 1 g/ml 或头孢曲松1 g/ml （使用1种以上药物做筛选试验可提高检出灵敏度）接种： 按标准肉汤稀释法的规定进行孵育条件：35；空气孵
15、育时间：16-18小时结果判读：生长=可疑有ESBLS的产生（即头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟、头孢曲松 MIC2 g/ml；头孢泼肟MIC8 g/ml ）质控建议：大肠埃希氏菌ATCC25922不长肺炎克雷伯氏菌ATCC700603，头孢泼肟MIC8 g/ml,(4)液体稀释法确证: 培养基:CAMHB药物浓度:头孢他啶0.25-128g/ml, 头孢他啶/克拉维酸0.25/4-128/4g/ml和头孢噻肟0.25-64g/ml,头孢噻肟/克拉维酸0.25/4-64/4g/ml。确证试验需要同时使用头孢他啶、头孢噻肟，单独和联合克拉维酸复合制剂。接种:按标准肉汤稀释法的规定进行孵育条件:35空气
16、孵育时间:16-20小时结果判读:对2个中任何一个药物的MIC，在加入克拉维酸后，MIC与不加克拉维酸的MIC值降低3个以上对倍稀释度，判定为ESBLs（如头孢他啶的MIC=8 g/ml，头孢他啶/克拉维酸的MIC为1 g/ml）。质控建议:肺炎克雷伯菌ATCC700603：联合克拉维酸的复合制剂的MIC与单药的MIC相比，应当降低3个以上对倍稀释度。,治疗原则是：1.碳青霉烯类抗生素，2. -内酰胺类/酶抑制剂,3.氨基糖苷类抗生素如阿米卡星，4.头霉烯抗生素如头孢西丁。在超广谱-内酰胺酶 检测条件不具备的地方，临床可以通过实验室报告的作推测治疗，若药敏报告提示三代头孢例如头孢泼肟、头孢他啶
17、、氨曲南、 头孢噻肟、头孢曲松有二者以上耐药极有可能是产超广谱-内酰胺酶 。,4、D试验-克林霉素诱导耐药试验 ： 葡萄球菌对大环内酯类抗生素耐药表现为：由msrA基因介导的主动外排机制，即M型耐药；抗生素作用靶位的改变，即由erm基因编码的RNA甲基化酶对细菌核糖体50S亚基23SrRNA进行特定核苷酸残基甲基化，使药物与靶位的结合能力下降，导致对具有相同靶位的大环内酯类、林可酰胺类、链阳菌素B三类药物同时耐药，临床称为MLS型耐药。体外药敏试验又可将MLS型分为结构型（cMLS型）和诱导型（iMLS型）；cMLS型为红霉素和克林霉素均耐药；iMLS型红霉素耐药、克林霉素敏感。,对大环内酯耐
18、药的葡萄球菌可能对克林霉素的耐药,通过erm 基因编码的23S rRNA 甲基化也称为MLSB（大环内酯、林可和B 型链阳霉素）耐药，或只对大环内酯类耐药（由msrA 基因编码的外排机制）。,M-H平板或血平板，纸片相邻试验，对于葡萄球菌，距红霉素纸片（15g/片）边缘1526mm 处放置克林霉素纸片(2g/片)来进行检测；对于-溶血链球菌，将克林霉素纸片(2g/片)和红霉素纸片（15g/片）贴在相邻的位置，纸片边缘相距12mm。,35空气，16-24h孵育后，克林霉素抑菌环不出现“截平”现象，应报告分离株对其敏感。邻近红霉素纸片侧克林霉素抑菌环出现“截平”现象（称为“D”抑菌环），提示存在可诱导的克林霉素耐药，应报告分离株对其耐药，在报告中应注明“通过诱导克林霉素耐药试验，推测此菌株对克林霉素耐药，克林霉素对某些病人可能仍有效”；若无“截平”现象，则应报告菌株对克林霉素敏感。,谢谢！,
