1、蛋白表达技术,蛋白表达技术,蛋白表达涵义,蛋白表达系统组成,原核表达,真核表达,无细胞表达,蛋白表达的涵义,蛋白表达是指用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术,在基因工程技术中占有核心地位。,一、原核表达系统,大肠杆菌是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。1977 年，Itakura 等成功地在 E. coli 中表达了一种哺乳动物的肽类激素 生长激素抑制素，从而首次实现了外源基因在原核细胞中的体外表达。这被认为是基因工程发展史上的一座里程碑。优越性：对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解；商品化的载体和菌株种
2、类非常齐全；表达效率高；易培养，成本低。,缺点：因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体；蛋白质不能糖基化；其内毒素很难除去。,Factors in E.coli protein expression,一个蛋白要成功的在E.coli系统表达，就是要根据表达目的在载体，菌株和培养条件三个主要因素之间找到一个理想的结合点。,表达载体,表达系统中最重要的元件是表达载体，表达载体应当具有表达量高、稳定性好、适用范围广等优点。表达载体主要包括启动子、表达阅读框、终止子、复制起 点 以 及 抗 性 筛 选 标 记 等 重 要元件,近年来的研究表明，在科研和工业上被广泛应用的大肠杆菌表达载体主要有 p
3、GE 系列、pQE 系和 pET 系列，其中目前被广泛应用的高效表达载体是 pET。,复制起始点：保证载体可以正确复制和增殖，决定质粒载体在宿主中的拷贝数。克隆载体常采用拷贝数低、严谨复制的复制子通常表达载体都会选用高拷贝的复制子 选择性基因-筛选标记：蓝白斑筛选（主要用于克隆）、营养缺陷性筛选、抗生素筛选（青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四环素抗性等）。,复制起始点：保证载体可以正确复制和增殖，决定质粒载体在宿主中的拷贝数。克隆载体常采用拷贝数低、严谨复制的复制子通常表达载体都会选用高拷贝的复制子 选择性基因-筛选标记：蓝白斑筛选（主要用于克隆）、营养缺陷性筛选、抗生素筛选（青霉素抗性
4、、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四环素抗性等）。多克隆位点：DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。,启动子：能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列转录形式：组成型、诱导型强弱：取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列。表达载体通常选用强启动子以提高表达量，但弱启动子也有其优点，如降低本底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。,T7启动子-最常用启动子基于 T7 RNA 聚合酶及其强启动子之间的特异性和转录的高效性建立的 pET 系统( No-vagen) 是最常用的 E. coli 表达系统。T7 N
5、AP 机制在诱导蛋白表达时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白，而且表达产物产量也特别高。,终止子：终止点前含有一段7-20bp的回文序列，可以保护mRNA在核外不被降解，显著延长mRNA的寿命，由此提高重组蛋白的表达量。融合标签：利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。标签位置的选择：-N端融合：易于构建。终止密码子来自载体基因，表达量高提前终止会干扰纯化二级翻译起始，不影响纯化- C端融合：构建时注意避免移码，基因不能自带终止密码子，提前终止不影响纯化，二级翻译起始会干扰纯化常用融合标签 HisTagpET系统 GSTT
6、agpGEX系统 MBPTagpMal系统,TrxHISHis6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。 优点：标签的分子量小，只有0.84KD，而GST和蛋白A分别为26KD和30KD，一般不影响目标蛋白的功能；His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下（纯化疏水性强的蛋白）或变性条件（纯化包涵体蛋白）下纯化，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性；His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋
7、白质、蛋白质-DNA相互作用研究；His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。可应用于多种表达系统，纯化的条件温和；可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。,Flag标签蛋白Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK），同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。 优点：FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋
8、白，并且纯化效率高。FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。融合在N端的FLAG，其可以被肠激酶切除（DDDK），从而得到特异的目的蛋白。因此现FLAG标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。,MBP（麦芽糖结合蛋白）MBP（麦芽糖结合蛋白）标签蛋白大小为40kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。优点：MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBP标签可通过免疫分析很方便地检测。有必要用位点专一的蛋白酶切割标签如果蛋白在细
9、菌中表达，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。 纯化：融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化。结合的融合蛋白可用10mM麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。结合亲和力在微摩尔范围。可用MBP抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。,GST(谷胱甘肽巯基转移酶)GST(谷胱甘肽巯基转移酶) 标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它的天然大小为26KD。可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和树脂进行纯化。优点：作为高度可溶的蛋白，可增加外源蛋白的可溶性；在大多数情况下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。可在大肠杆菌中大量表达，起到提高表达量的作用。标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋
10、白酶的降解并提高其稳定性。GST标签蛋白可在温和、非变性条件下洗脱，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力，因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂如：盐酸胍或尿素等。如果要去除GST融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。检测：可用GST抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。,常用表达载体系统,目的蛋白表达形式及在细胞中的定位,蛋白表达形式,分泌蛋白:采用信号肽序列可以将蛋白直接分泌到细菌的周质腔去。,可溶性蛋白:目的蛋白与一段融合标签序列 （FLAG、His Tag、GFP 等) 融合表达而形成,包涵体蛋白 :包涵体蛋白的形成是由于肽链折叠过程中，部分折叠中
11、间态发生特异性错误聚合，不能形成成熟的天然或完全解链的蛋白所致,宿主菌的选择,用于克隆的宿主菌 K12系列NovaBlue，JM109以及DH5 a。特点：recAendA型，转化效率很高，且质粒产量高，适合用于保存带有克隆目的基因的pET载体。用于表达的宿主菌所有 B 型菌株，B834，BL21，BLR，Origami B，Rosetta及Tuner特点：都缺乏纯化过程中降解蛋白的lon蛋白酶及 ompT 外膜蛋白酶。目的蛋白在这些菌株中的稳定性要高于带有这些蛋白酶的菌株，BL21(DE3)是用得最多的表达菌,E.coli宿主菌,表达条件优化,增加可溶性和折叠,选择大肠杆菌偏爱密码子,毒性基
12、因及质粒稳定性,合适载体与宿主菌组合,表达条件优化,毒基因：基因表达产物即目的蛋白，影响宿主生长（“毒性”）,例1:载体对表达的影响,pET32,BL21(DE3),表达的蛋白:Trx-His6-EK-IFN(MW35KD),pET43,BL21(DE3),表达的蛋白:Nus-His6-S Tag-EK-IFN(MW78KD),诱导后,破菌上清,破菌沉淀,诱导前,诱导前,诱导后,破菌沉淀,破菌上清,破菌上清,例2:宿主菌对表达的影响,Tissue plasminogen activator (tPA,9 disulfide bonds) was expressed in three diffe
13、rent hosts. 10 mg of soluble protein was spotted onto fibrin agarose plates and incubated for 24 h at 37C. Zone of clearing measures biological activity of tPA.,pET32,例3:表达条件对表达的影响,pET21,BL21(DE3)-RIL,表达的蛋白:His6-REIIBP(MW67KD),U:Uninduced crude extractI:Crude extract after inducedS:Lysis supertanant
14、P:Lysis precipitation,大肠杆菌表达系统的研究新进展近几年来，对大肠杆菌表达系统的研究，已经从最初的构建不同的表达载体建立新的表达系统转移为完善现有的表达系统，解决表达系统中的各种缺陷，包括: 采用 RosettaTM( No-vagen) 代替 BL21 菌株来增强含有 E. coli 稀有密码子的重组蛋白的表达水平; 采用 BL21( DE3) 、BL21 ( DE3) pLysS 以及BL21( DE3) pLysE ( Invitrogen) 弥补高浓度的胞内酶环境对具有生物活性的目的蛋白在 E. coli 中表达的抑制等。,最近几年来，研究人员逐步将研究重点放在通
15、过将一些具有活性的小蛋白与目的蛋白融合，进而促进目的蛋白在 E. coli中的表达，或者通过改造某种现有的表达载体，通过将各种促溶标签与载体融合，进而使得某些在 E. coli 中不表达的蛋白得以表达或使原本以包涵体形式表达的蛋白以可溶性形式表达。这些标签包括 FLAG、MBP、GST、thioredoxin 等。,其他原核表达式系统,乳酸乳球菌表达系统 乳酸菌是革兰氏阳性菌，膜单一，在大量膜蛋白的表达方而提供了革兰氏阴性菌无法比拟的优势，原因是革兰氏阴性菌具有内外膜并覆盖着厚厚的、刚性的肚聚糖层的内表而周质空间影响蛋白质的表达，而蛋白在乳酸乳球菌中的表达是通过融合Mistic到目标膜蛋白而加
16、以改善，提高其表达量。,芽袍杆菌表达系统 芽抱杆菌(Bacillus)也属于革兰氏阳性菌。桥石短芽抱杆菌和枯草芽抱杆菌表达系统由Takara, MoBiTec公司开发与提供。芽抱杆菌能过表达并且能分泌外源蛋白到培养基中，这适合分泌型蛋白的生产，如细胞因子或需要形成复杂二硫键的外源蛋白。,真核细胞表达系统,为了克服原核表达系统的不足，许多学者将原核基因调控系统引入到真核基因调控领域。基因工程常用的真核表达系统有: 酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞,酵母表达系统,酵母是一种低等的单细胞真核生物，它既具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作等特点，同时又具有真核生物蛋白质加工、折叠、翻译后饰
17、等的功能。目前工业生产中最重要的外源蛋白表达系统是酵母表达系统。优越性：蛋白可糖基化，有相对正确的天然结构，可很好的生产分泌型蛋白；表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中，实现高效率表达；表达载体都为E.coli/Pichia Pastoris的穿梭载体，可在获得克隆后采用E.coli细胞大量扩增。易培养，成本低,可高密度发酵。,缺点：糖基化与哺乳动物有所差别；培养上清多糖浓度高，不利于纯化。,酵母表达系统发展,第 39 页,酿酒酵母,甲基营养型酵母,粟酒裂殖酵母,长久以来被称为真核生物中的“大肠杆菌”，最早应用于酵母基因的克隆和表达。目前利用
18、酿酒酵母为宿主细胞表达了多种外源基因，如乙型肝炎疫苗、人胰岛素、人粒细胞集落刺激因子、人血管抑制素等。,1983 年，美国 Wegner 等人最先发展了以甲基营养型酵母 为代表的第二代酵母表达系统。甲基营养型酵母包括: 毕赤酵母、汉森酵母、假丝酵母。以 毕赤巴斯德酵母为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。,酵母细胞中生理特性最接近高等生物的一种，其染色体结构和功能，细胞循环的控制，RNA 剪接蛋白表达分泌机制及翻译后修饰等都与哺乳动物细胞很相似。近年来，有学者提出它可能也是潜在的能有效表达真核膜蛋白的表达系统.,甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统，以Pichi
19、a Pastoris应用最多。,毕赤酵母表达系统模式载体,甲醇氧化酶启动子A、目前已发现的、最强的真核启动子B、严谨调控型启动子 AOX1：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导 MOX：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导,甲醇酵母的表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中。甲醇酵母一般先在含甘油的培养基中生长，培养至高浓度。再以甲醇为碳源。诱导表达外源蛋白。这样可以大大提高表达产量。利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达克级。与酿酒酵母相比其翻译后的加工更接近哺乳动物细胞，不会发生超糖基化。,近年来，用该表达系统成功表达的蛋白达到了300多种，表达的蛋
20、白主要包括基因工程疫苗，如乙肝疫苗及一些来自动植物和细菌的各种酶、膜受体蛋白、抗原和抗体及一些用来研究晶体结构的蛋白等。同时，该系统作为一种基础研究的模型系统在分子生物学领域也发挥了越来越重要的作用，如用该系统进行过氧化物酶体的输入和组装及真核细胞的分泌途径和功能等方面的研究。目前国内也有多种蛋白在该系统中获得了高效表达，如人白蛋白、人胰岛素、干扰素、乙肝表面抗原、集落刺激因子等几十种蛋白质。,昆虫细胞表达系统是目前国内外很推崇的真核表达系统。依托杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子而构建的表达载体，有效甚至高水平地使很多真核目的基因得到表达。利用重组杆状病毒在昆虫细胞体系中表达外源蛋白是目
21、前较为流行的表达方式。优越性：重组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配；可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体；可进行分泌表达。,缺点：糖基化与哺乳动物有所差别；表达量有限；作为药物宿主细胞未被FDA认可； 培养成本高。,2.昆虫表达系统,杆状病毒基因组：闭环双链DNA，88-166kb表达系统杆状病毒表达系统（BEVS）家蚕核型多角体病毒-家蚕表达系统宿主：鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、脉翅目、毛翅目的600多种昆虫克隆基因方法：转移载体共转染同源重组空斑筛选纯化重组病毒,杆状病毒载体的构建发展,3. 哺乳动物细胞表达表达系统,当前，哺
22、乳动物细胞表达已成为生物药物生产的重要技术。哺乳动物细胞常用于表达高活性的人源重组蛋白。优越性：糖基化与人源蛋白一致；能表达天然结构的完整蛋白，活性很高；可进行分泌表达。,缺点：表达量低；培养成本很高，操作繁琐。,常用宿主细胞,表达栽体,哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。哺乳动物细胞表达载体必须包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等控制元件根据进入宿主细胞的方式，可将表达载体分为病毒载体与质粒载体。,病毒载体:是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。常用的病毒载体有SV40病毒、腺病毒、反转录病毒
23、、痘苗病毒杆状病毒载体应用于哺乳动物细胞的表达在近几年颇受重视，这是因为它与其它病毒载体相比有特有优势，如可通过昆虫细胞大量制备病毒颗粒；可感染多种哺乳动物细胞，但在细胞内无复制能力，生物安全度高；可插入高达38 kb的外源基因等。,质粒载体则是借助于物理或化学的作用导人细胞内。依据质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力，可将质粒载体分为整合型和附加体型载体两类。整合型载体无复制能力，需整合于宿主细胞染色体内方能稳定存在，如SV40病毒载体、反转录病毒载体和游离型如痘苗病毒、腺病毒载体。利用 Sindbis virus(SV)、Scmliki Forest virus(sFV) 和痘苗病毒载体感
24、染哺乳动物细胞表达的蛋白在结构与功能上与天然哺乳动物来源的蛋白更相似。Liljestrom等利用SFV病毒载体感染哺乳动物细胞获得的外源蛋白占细胞总蛋白的；,附加体型载体则是在细胞内以染色体外可自我复制的附加体形式存在。整合型载体一般是随机整合入染色体，其外源基因的表达受插入位点 的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长特性。相比之下，附加体型载体不存在这方面的 问题，但载体DNA在复制中容易发生突变或重排。,猴多瘤病毒DNA（SV40）,SV40属于乳多瘤病毒科多瘤病毒属，呈小型二十面体，由VP1、VP2、VP3三种衣壳蛋白包装而成，基因组为5224bp的双链环状DNASV40可以与所有哺乳动
25、物宿主细胞中的组蛋白H2、H3、H4结合，从而使其DNA形成类似核小体的微型染色体结构。 SV40感染猴细胞时呈裂解型，不致癌；但感染啮齿类动物后，便发生非同源整合而致癌。 SV40在裂解宿主细胞前的晚期状态时，每个宿主细胞含有105个病毒DNA拷贝，因此十分适合用于高效表达外源蛋白,SV40的生物学特性,SV40 DNA-质粒DNA杂合载体的构建,重组的SV40 DNA分子必须经过,包装后才具有感染能力，因此插入的,外源DNA片段不能太大。为了尽量提,高SV40的装载量，必须删除一些基因,片段，因此重组的SV40分子必须与野,生型病毒共感染受体细胞，才能形成,有感染力的重组病毒颗粒。,Apr
26、,ori,viral gene,gpt,SV40 ori,pV2-GPT,pBR322,pBR322,SV40,pV2-GPT是一种SV40 DNA与大肠杆菌质粒DNA杂合的载体，其,中gpt为细菌来源的谷氨酸-丙氨酸转氨酶基因，用于筛选重组子。该,载体曾被成功地用于在猴肾细胞中表达有生物活性的兔b-珠蛋白.,人乳多瘤病毒DNA（BKV）,人乳多瘤病毒（BKV）属于乳多瘤病毒科乳头瘤病毒属，其基因组为双链DNA，感染宿主细胞后基因不发生整合，独立于染色体而自主复制，每个宿主细胞最高可达500个拷贝,人乳多瘤病毒的生物学特性,人乳多瘤病毒表达载体的构建,BKV - E.coli 穿梭载体,BKV
27、 ori,BKV gene,DRE,MMTP,Ap r,E.coli ori,SV40 P,Neo r,删除编码病毒核心蛋白和外壳蛋白的,基因，并与大肠杆菌质粒拼接，构成,穿梭载体，它不能整合，同时也不能,形成成熟的病毒颗粒裂解受体细胞。,安装细胞色素P450 dioxin介导的增强,子DRE，控制小鼠乳腺癌启动子MMTP，由其带动外源基因的表达。,SV40来源的启动子控制Neor 标记基因，以G418筛选重组子。,以此载体在人细胞系中表达b1-干扰素和单纯疱疹病毒B蛋白获得成功。,利用SV40 DNA载体表达外源基因的程序,SV40 载体,病毒晚期基因启动子,筛选标记,ori,缺陷的SV40
28、 辅助病毒,去除细菌序列,插入外源基因,重组分子,分离病毒DNA,转化,筛选,增殖,感染,通过强化基因转录高效表达外源基因,在载体上安装病毒或细胞来源的强启,mRNA前体,AAAAAAAAA,mRNA,动子以及有效的翻译元件，是使外源基,因高效表达的一种手段，如：,细胞巨化病毒CMV的启动子,动物珠蛋白基因的内含子,SV40的终止子和polyA化信号序列,绝大多数哺乳动物细胞的表达型载体,上携带内含子结构，因为mRNA前体的剪,切能促进成熟mRNA向胞质的运输，有利,于翻译。有的还含有各种信号肽序列。,瞬时转染与稳定转染,哺乳动物细胞生产蛋白的方式有两种：瞬时转染和稳定转染。瞬时转染的特点是短
29、期快速表达，满足蛋白的小量制备。细胞瞬时转染表达能够快速灵活的制备重组蛋白，细胞在转染后1-4天内即可收获并进行分析。,稳定转染通过稳定细胞系能够满足蛋白的大量、长期生产。稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身基因组上，随着细胞的生长分裂外源基因可以稳定转染表达，同时经过抗生素加压筛选，最终得到能够稳定转染表达蛋白的细胞株。,发展历史,1987年FDA批准了基因泰克公司生产的组织型纤溶酶原激活剂（tPA）, 世界上第一个哺乳动物细胞制备的重组蛋白质药物标志着哺乳动物细胞制备重组蛋门时代的到来。经过20多年的发展，哺乳动物细胞制备重组蛋白技术发生了巨大的变化。主要表现在: (1) 细胞培养时间延长
30、，由过去的7天延长至21天； (2) 细胞密度增加， 过去：1-2X106细胞毫升， 现在：1-1.5X107细胞毫升；,(3) 产量增加， 过去：1020pg重组蛋白细胞天， 50一100mg重组蛋白升， 现在：50-90pg重组蛋白细胞天， 1-5g重组蛋白升。,迄今为止，已有大约300种重组蛋白药物正在进行临床试验，但在哺乳动物工程细胞中大规模生产的只有少数几种：,b 干扰素g 干扰素,凝血因子VIII凝血因子IX,促红细胞生成素（EPO）生长因子（hGH）,白介素 2（IL-2）乙型肝炎表面抗原,单克隆抗体 CD4受体,组织型纤溶酶原激活剂（tPA）,利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小
31、鼠抗体,大多数恶性淋巴瘤细胞表面上都有一种特异性的糖蛋白campath，用人源化的小鼠抗campath抗体治疗非霍金淋巴细胞瘤患者，效果良好。重组抗体采用DHFR-MTX系统表达。,Neor,鼠金属硫蛋白启动子,b 肌动蛋白启动子,抗体轻链cDNA,b 肌动蛋白终止子,pL,dhfr,SV40启动子,b 肌动蛋白启动子,抗体重链cDNA,b 肌动蛋白终止子,pH,利用哺乳动物工程细胞生产人组织纤溶酶原激活剂,第一个由重组哺乳动物,dhfr,启动子,人tPA cDNA,终止子,细胞规模化生产的医用蛋白,是治疗急性心肌梗塞的溶血,栓药物：人组织纤溶酶原激,活剂（tPA）。同样采用,DHFR-MTX
32、系统表达，受体,细胞选用CHO系统。目前，,用该工艺路线生产的重组人tPA已经商品化。,信号肽编码序列,此外，人tPA也可由重组大肠杆菌生产，但蛋白的重折叠效率低。,利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子VIII,凝血因子VIII编码基因的缺陷与血友病密切相关。多年来，血友病病人都是使用从人血中分离纯化的凝血因子VIII生物制品进行治疗，然而由于人的血源污染乙肝病毒或爱滋病病毒，数千名使用这种血液制品的血友病人惨遭感染，其中10%的病人最终死于爱滋病而非血友病。 早在上述情况发生之前，人凝血因子VIII的cDNA便已被克隆和鉴定，血源的污染则加速了利用基因工程技术生产该药物的进程。与tPA相似，人
33、凝血因子VIII也是一种结构复杂的大分子，必须通过重组哺乳动物细胞生产，但目前商品化了的重组人凝血因子VIII尚不能满足几代血友病人的大量需求。,转基因动物,以动物个体为基因受体的基因表达技术，并由于这种外源基因的导入而产生可以遗传的变异.这些遗传改变包括：外源DNA至少整合到一条染色体上由于外源DNA的插入使任一基因发生改变由于外源DNA的插入使染色体发生重排有意识的导入可以持久存在的遗传实体,在各种器官和细胞中，乳腺组织可以进行大规模的翻译后修饰，并具有良好的渗透屏障。近年来，转基因动物乳腺生物反应器的研究已经成为生物工程领域研究的热点，一般用来高效、高质量生产具有生物活性的蛋白。但多数研
34、究表明，乳腺特异性表达的成功率很低，蛋白在乳汁中的表达水平较低。,植物生物表达系统,外源基因可以使用带有分泌信号肽序列的植物体使重组蛋白分泌表达。利用植物做为生物反应器生产的重组蛋白在折叠和组装上与动物细胞更为相似，从而具有与高等动物细胞表达的产物基本一致的免疫原性和生物活性，并且不会存在被动物、病原体污染的可能性。,植物能够表达来自动物、细菌、病毒以及植物本身的蛋白质易于大规模培养和生产，且在基因表达与修饰及安全性方面有特别的优势，因此利用植物生产外源蛋白质的研究展现了极其诱人的前景。多种抗体、酶、激紊、血浆蛋白和疫苗等都已通过基因工程的手段在植物的叶、茎、根、果实、种子以及植物细胞和器官中
35、得到表达，然而提取与纯化始终是大规模利用植物生产重组蛋白的主要障碍。,Doloressa等据内质网和内质网信号肽在蛋白质合成中的作用，把3种重组蛋白，即嗜热细菌来源的木聚糖酶、水母的绿色荧光蛋白和人胎盘分泌的碱性磷酸酶(SEAP)定位到质外体中，通过根分泌和叶分泌途径获得表达，从而建立了两种新的重组蛋白表达系统-植物根分泌和叶分泌，简化了分离和纯化程序，为利用转基因植物大规模生产重组蛋白提供了潜在的途径。虽然利用植物表达、生产外源性蛋白起步较晚，但目前已经能够利用植物生产多种医用、食用以及工业用蛋白及酶制剂。,无细胞表达系统,无细胞蛋蛋白合成系统是一种以外源DNA或mRNA为模板，利用细胞抽提
36、物中的蛋白合成机器、蛋一折叠因子及其他相关酶系，通过添加氨基酸、T7聚合酶和能量物质等来实现蛋白质表达的体外系统。其不受细胞核（核酸DNA/RNA)、线粒体、细胞骨架等的干扰，能够在体外快速、大量表达蛋白。,1958年，Zamecnik首次证明，从细胞抽提物中获得的翻译机器可以介导体外的蛋白的合成；1961年，Nirenberg和Matthaei利用蛋白质的无细胞合成体系，以破译遗传密码子。,体外无细胞蛋白表达系统分为原核和真核两大类。原核系统以细菌裂解物为基础，如大肠杆菌系统；真核系统以真核细胞裂解物为基础，包括麦胚系统、昆虫系统、兔网织红细胞系统等。这一真正的“开放”系统，能够特异性表达目
37、的蛋白，产生的蛋白可用于蛋白质功能检测、结构分析等下游实验。该系统应用至今，已成功表达超过2 万种蛋白，其中包括13364 个人类的基因。,无细胞蛋白表达系统与传统表达系统特点比较,无细胞蛋白合成系统能够表达其他表达系统很难表达的蛋白，如毒性蛋白、膜整合蛋白、生物活性肽。而且能更好的生产需要二硫键形成的外源蛋白，因为裂解物的氧化还原条件可使用添加剂或改变还原剂/氧化剂的比例进行调节。,主流的无细胞(cell free CF)表达策略为分层、分批提供新鲜组分到混合物中，消除混合物中副产物。在分批处理时，mRNA编码的蛋白连续注入反应物中，这可以提高产量，特别是当反应时间长、反应规模大时，并且存在
38、裂解液中核糖核酸酶使靶标mRNA降解可能性增加。,CF表达系统适用于膜蛋白的生产，溶解的膜蛋白在含有洗涤剂的CF反应混合物中的表达可以重组到脂质双分子层中如脂质体、双层细胞和奈米圆盘。在这个过程中，在附带脂质清洁剂交换程序卜，自发的共转化和翻译后修饰方法被使用。,CF表达系统的易操作和高通量特性，能够用于膜蛋白最佳增溶条件的筛选，缺点是不适合大量蛋白质的生产，因为蛋白表达水平比活宿主细胞的低，成木昂贵。,小结获得具有大然结构和足够多的生物功能的蛋白质，以及发现新型蛋白分子对于实现药物发现新突破尤为重要。重组蛋白技术使蛋白分子功能得以改善，蛋白纯度有效提高。原核表达系统、真核表达系统、无细胞表达系统以及其他蛋白生产方法的应用，虽然尚存缺点，但其独有的优势应该加以利用。,目前重组蛋白的表达和纯化技术仍然需要克服困难并在研究过程中积累经验，及时汲取相关领域的研究进展，找出重组蛋白的制约因素，对症下药。随着基因工程技术以及蛋白质组学的发展，重组蛋白技术将会越来越成熟，作为药物分子的靶标蛋白将会有新的突破。,Thanks！,
