1、第十五章 甾体激素类药物的分析,4,6,16,基本结构,性 激 素,肾上腺皮质激素,雄性激素,孕激素,雌激素,分 类,蛋白同化激素,肾上腺皮质激素,43酮基,C17醇酮基,氢化可的松,肾上腺皮质激素,醋酸地塞米松,肾上腺皮质激素,曲安奈德,肾上腺皮质激素,地塞米松磷酸钠,雄性激素,雄性激素,丙酸睾酮,蛋白同化激素,苯丙酸诺龙,孕激素,C17-甲酮基,孕激素,醋酸甲地孕酮,雌性激素,雌性激素,此外,一、基本结构与分类,1. 肾上腺皮质激素,2.雄性激素及蛋白同化激素,3. 孕激素,4. 雌性激素,二、理化性质与鉴别试验,比旋度：不对称物质具有旋光性，当偏振光透过1 dm，样品浓度为1 g/ml的
2、溶液，在一定波长和温度下测得的旋光度称为比旋度。,（一）理化性质,吸收系数：在给定的波长、溶剂和温度等条件下，吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸光度。反映了药物的紫外吸收特征,（一）理化性质,（二）鉴别试验,薄层色谱法,制备衍生物测定熔点,高效液相色谱法,紫外分光光度法,红外分光光度法,化学鉴别法,鉴别试验,（一）化学鉴别法,1.与强酸的呈色反应,甾体激素类药物,呈色,H2SO4 H3PO4 HClO4 HCl,母核的一般鉴别试验,与硫酸显色反应,2.官能团的反应,肾上腺皮质激素药物,呈色,四氮唑盐OH,（1） C17 醇酮基,还原性,呈色反应,此外还有斐林试液、多伦试液,四氮唑比色法,甾
3、酮类激素药物,腙（黄色）,羰基试剂,（2） C3酮基和C20酮基,常用的羰基试剂：2,4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼,具有甲酮基或活泼亚甲基的甾体激素类药物,蓝紫色,亚硝基铁氰化钠间二硝基酚芳香醛,（3）甲酮基,黄体酮,蓝紫色,亚硝基铁 氰化钠,其他甾体,淡橙色或不显色,雌激素类药物,红色偶氮染料,重氮苯磺酸,（4） 酚羟基,含炔基的甾体激素,银盐沉淀,硝酸银,（5） 炔烃的沉淀反应,有机氟,F,有机破坏,有机氯,Cl,（6） 有机卤素,茜素氟蓝 硝酸亚铈,硝酸硝酸银,AgCl,呈蓝紫色,一般先进行水解，生成相应的羧酸，再根据羧酸的性质来进行鉴别。,（7） 酯的反应,-3-酮、苯环、其他共轭
4、结构,（二） UV 法,1. 结构依据,240nm左右,280nm左右,2. 示例,曲安息龙,丙酸倍氯米松,溶剂,甲醇,乙醇,20g/ml,浓度,20g/ml,结果判断,在238nm处有最大吸收,在239nm处有最大吸收，A为 0.570.60，在239nm与263nm 处的吸收度比值为2.252.45,结构特征：酚羟基、C17 OH C17 乙炔基,炔雌醇,（三） IR法,1505cm-1,3505cm-1,3300cm-1,1590cm-1,3610cm-1,酚羟基,醇羟基,1615cm-1,苯环的骨架振动,结构特征：-3-酮、C17-甲酮基,1700cm-1,C=O,20位酮基,1665
5、cm-1,3位酮基,1615cm-1,870cm-1,C-H,双键,（四） TLC法,主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别,方法：对照品法 要求供试品溶液所显主斑点的颜色和位置与对照品溶液的主斑点相同。,（五） HPLC法,主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别（如：醋酸曲安奈德软膏、醋酸氟轻松软膏）,方法：对照品法 要求在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的tR与对照品峰的tR一致。,硒的检查,有关物质的检查,残留溶剂的检查,游离磷酸盐的检查,三、 特殊杂质检查,（一）有关物质的检查,检查意义：其他甾体与甾体激素药物结 构相似，也有一定的药理作 用而又互不相同.,检查方法（具有一定分离能力） TLC
6、法（高低浓度对比法） HPLC法（类似高低浓度对比法）,（1）TLC法（高低浓度对比法）,判定方法： 规定杂质斑点数目 规定杂质斑点颜色,例：炔孕酮中有关物质的检查供试液：本品+氯仿-甲醇(3:1) 浓度：10mg/ml对照液：供试液（10mg/ml）+氯仿-甲醇(3:1) 浓度：50g/ml 层析：供试液 点样、展开、斑点检出。 对照液判断：供试液如显杂质斑点，其荧光强度与对照溶 液主斑点比较，不得更深。,（2）HPLC法（主成分自身对照法）,判定方法： 规定杂质峰数目规定杂质峰面积,药物,二氨基萘比色法测定,氧瓶燃烧,(二）硒的检查,有毒,来源 合成中用二氧化硒(SeO2)脱氢,（三）有机
7、溶剂残留量的检查,甲醇 0.3,丙酮 5.0% 内标法 + 校正因子,以地塞米松磷酸钠为例 GC法,对照液：同法 要求：供试品溶液吸光度不得大于对照溶液吸光度,（四）游离磷酸盐的检查,（对照液 0.0035%KH2PO4）,比色法,紫外分光光度法,含量测定,高效液相色谱法,四、含量测定,USP、BP、JP均采用,RPHPLC（大多内标法）,（甾体激素类药物常含有结构相似的其他甾体杂质，对利用结构特征设计的比色法有干扰）,测定对象：甾体激素类药物的原料和制剂,示例：地塞米松磷酸钠的含量测定色谱条件：固定相 ODS，流动相 三乙胺溶液-甲醇-乙腈（55:40:5）检测波长242nm系统适用性试验：
8、n7000，地塞米松磷酸钠峰和地塞米松峰分离度应大于4.4,离子对液相色谱,流动相,真空脱气机,四元泵,自动进样器,紫外检测器,荧光检测器,蒸发光散射检测器,液质联用仪,质谱检测器,流动相：对于以C18为固定相的反相色谱系统，常用甲醇-水，间或加以乙腈、缓冲液等为流动相，有机溶剂比例通常不低于5,四元泵,自动进样器,填充剂常用：十八烷基硅烷键合硅胶,检测器,（二）UV法,-3-酮 240nm（）,肾上腺皮质激素雄性激素和蛋白同化激素孕激素,苯环 280nm（）,雌激素,（三）比色法,肾上腺皮质激素类,C17-醇酮基,强还原性,（1）原理,1. 四氮唑比色法,三苯甲瓒深红,H,蓝四氮唑（BT）5
9、25 nm,（2）方法,对照品法,（3）讨论,A. 基团对反应速度的影响,C11= O C11OH,C21OH C21-酯,B. 溶剂、水分的影响,以无醛乙醇为溶剂，水含量大时，呈色减慢，不超过5对结果没有影响,C. O2与光线的影响,避光,隔绝空气、快速、充N2,D. 碱的种类及加入顺序,以氢氧化四甲基铵的结果最佳,加入顺序：,皮质激素,碱试液,四氮唑盐,E. 温度与时间,室温（25）反应4045 min,肾上腺皮质激素、 雄性激素和蛋白同化激素、孕激素,C3酮基,（1） 原理,异烟腙（黄）,酮基,异烟肼,-,3,C,HCl,（缩合）,420 nm,异烟腙（黄色）,（2）方法,对照品法,（3
10、）讨论,反应速度（反应专属性）,A.,C3=OC17= O 、C20= O C11= O 不反应,反应专属性 C3酮基,B. 溶剂的选择,异烟肼盐酸盐受溶解度的影响,无水甲醇无水乙醇,对试剂的稳定性好、呈色强度较无水乙醇中高、但对植物油的溶解度小,C.水分、温度、O2与光线的影响,含水量腙水解A%,O2与光线对反应的影响不大,t ,酸:异烟肼 = 2:1,最大吸收度,盐酸浓度0.0074mol/L异烟肼浓度0.00365mol/L,D. 酸的种类和浓度及异烟肼的浓度,(1) 原理,H2SO4-乙醇,加热,H2Omax=465,加热,雌激素,黄色,桃红,max=515,雌二醇-3-甲醚,max=
11、465nm,max=515nm,(NH4)2Fe(SO4)2 + H2SO4 + H2O2 + 苯酚,第五节 体内甾体激素类药物分析,3,违禁药物监测,方法的专属性强,此类分析的特点：,竞技运动员体内违禁甾体激素药物的分析,3 Saito K, Yagi K, Ishizaki A, Kataoka H. Determination of anabolic steroids in human urine by automated in-tube solid-phase microextraction coupled with liquid chromatographymass spectrom
12、etry. J of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2010, 52: 7277334 Konieczna L, Plenis A, Oledzka I, Kowalski P, BAczek T. Optimization of LC method for the determination of testosterone and pitestosterone in urine samples in view of iomedical studies and anti-doping esearch studies. Talanta, 2011
13、, 83: 804-814,加内标物，调节PH，加酶进行水解一段时间，离心，取上清液。,用上述制的的样品，进行SPME处理，分离纯化后经LC-MS分析,示例1：尿中违禁同化激素的SPME/LCMS检查,图：志愿受试者尿样中睾酮等七种违禁甾体激素药物的LC-MS测定,左炔诺孕酮血浆药代动力学和生物等效性研究,左炔诺孕酮是一种高效的孕激素，作为速效避孕药，广泛应用于临床和计划生育。有文献报道，建立LC-MS/MS法检测血浆中左炔诺孕酮的方法，研究左炔诺孕酮分散片在健康自愿受试者体内的药动学和相对生物利用度，并评价生物等效性，为临床用药提供依据5, 6。,5. Li-Zi Zh, Guo-Ping
14、Zh, Hui-Chang B, Liang D, Ying D, Su G, Xiao Ch, Zhi-ying H, Min H. Determination of levonorgestrel in human plasma by liquid chromatographytandem mass spectrometry method: application to a bioequivalence study of two formulations in healthy volunteers. Biomed Chromatogr, 2008, 22: 5195266. 李健和，徐平声，戴智勇，等. 左炔诺孕酮分散片在健康人体中药动学和生物等效性.中国现代应用药学杂志，2009, 28(8): 644-648,示例2：左炔诺孕酮分散片的人体药动学研究,对上述结果进行方法学考查,稳定性,专属性,线性与范围,提取回收率,准确度,精密度,内容,结果表明:,Thank You!,
