1、生物样品前处理,制作人：叶超,研究背景,生物样品种类,目录,生物样品储存,生物样品预处理,克服基质效应方法,生物样品中药物的分析测定是定量描述药物体内过程、获得药代参数的重要手段之一,药物浓度低（血液中药物浓度、一般处于ng-pg级水平）,干扰组分多（血液成分及其复杂，包括基质，内源性物质及其代谢产物，含有数百乃至几千种化合物）,药物在体内除原型还有代谢产物以及和内源性物质结合多种形式存在,体内生物样品分析特点,体内生物样品分析特点,生物样品种类,生物样品种类选取的原则,能够反应出药物浓度与药物效应之间的关系易于获取便于处理、适合分析根据不同目的要求进行选取,血液（全血、血浆、血清）尿液、唾液
2、、胆汁、乳汁、脑脊液、淋巴液、汗液等,非均匀生物样品,心、肝、肾、脾、肺、脑、胃、肠、子宫、肌肉、皮肤等组织、器官,全血,血浆,血清,选择血浆or 血清,选择血浆理由：1)一般血浆中药物浓度高于血清中药物浓度2)血清形成过程中，血块凝固时，往往易造成吸附损失3)血清需要采血放置一段时间才可制得，对不稳定的化合物影响较大4)血浆则可经采血后立刻离心，分离血浆低温保存,选择血清理由：1)血浆中蛋白稍微多，可能会在SPE中产生堵塞柱子情况2)血浆中含有抗凝物质（肝素或EDTA)可能会干扰化合物检测,生物样品的储存,一、冷藏或冷冻,采样后除了立即分析外，为防止药物发生变化，应：短期保存，可4冷藏长期保
3、存，可-20冷冻，不要反复冻融（大部分药物）-80，阿莫西林等抗生素,二、有时，还应考虑加入稳定剂,酶抑制剂：一些酯类药物，如普鲁卡因、阿糖胞苷，易受血浆酯酶作用而发生水解，而应在采样后立即加入酶抑制剂如氟化钠。抗氧化剂：一些易氧化的物质，可加入VC或其它氧化剂。如血浆中的儿茶酚类药物常规保存仅4周，若加入适量的VC，则能保存10周。,盐酸班布特罗（前药）,体内胆碱酯酶的作用下缓慢代谢,阻断水解,毒扁豆碱(胆碱酯酶抑制剂）,特布他林（代谢产物）,生物样品的储存和预处理(添加酶抑制剂),生物样品的储存和预处理(避光）,生物样品的储存和预处理(PH值和温度）,生物样品预处理目的,1,2,3,将药物
4、从缀合物（尿）或结合物中释放出来，以测定药物浓度,将微量药物从复杂介质中纯化、富集起来,防止分析仪器的污染，提高测定灵敏度和选择性,生物样品常用的处理方法,一,二,三,沉淀蛋白(PPT),液液萃取(LLE),固相萃取(SPE),主要考虑生物样品的种类、被测药物的性质和测定方法三个方面的问题：,沉淀蛋白,通过沉淀蛋白质可以使结合的药物释放出来，达到对待测组分的提纯和纯化,有机溶剂沉淀法,加入中性盐,有机酸,加入锌盐或铜盐沉淀剂,酶解法,有机溶剂沉淀法,原理,加入水溶性有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化,常用有机溶剂种类,乙腈、甲醇、丙酮、乙醇、四氢呋喃等,操作实例,50l 血浆+
5、150l甲醇 涡旋1min 3500rpm离心10min 取上清液进样分析,有机溶剂沉淀法实例,奥氮平,有机溶剂沉淀法,血浆或血清与有机溶剂的体积比为1:13，就可以将90%以上的蛋白质除去，采用低温低速3500r/min离心10min便可将析出的蛋白质完全沉淀。,经验总结,优点,操作简单，快速，精密度好，为方法开发中优先考虑使用的，特别在LC-MS方法中几乎使用于所有小分子化合物，无论其极性大小化合物回收率接近100%，几乎所有小分子化合物都被提取，尤其适用于代谢产物鉴定,缺点,只适用于样品中浓度较高的药物测定；样品处理后仍然存在很多干扰物质，对结果产生干扰；残余的杂质会堵塞色谱柱，污染仪器
6、,加入强酸,原理,当PH低于蛋白质等电点时，蛋白质以阳离子形式存在，加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀。,常用有机溶剂种类,10%三氯醋酸， 10%高氯酸等,经验总结,血清与强酸的比例为1:0.6混合，高速离心，就可除去蛋白质在酸性条件下分解的药物不宜本法除蛋白,头孢地尼,内标 头孢克洛,加入强酸实例,酶解法,原理,在测定酸不稳定及蛋白结合牢固的药物，需用酶解法，最常用的酶是蛋白水解酶的枯草菌溶素，,优点,可避免某些药物在酸、及高温条件下降解：对与蛋白质结合牢固的药物（保泰松、苯妥英钠)，可显著改善回收率,加入中性盐,原理,加入中性盐，使溶液的粒子强度发生变化。中性盐能将与蛋白质水合的
7、水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。,常用中性盐种类,饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐、枸橼酸盐,操作实例,血清和饱和硫酸铵的比例为1:2，混合，离心10000r/min 1-2min，即可除去90%以上蛋白质,生物样品常用的处理方法,一,二,三,沉淀蛋白(PPT),液液萃取(LLE),固相萃取(SPE),主要考虑生物样品的种类、被测药物的性质和测定方法三个方面的问题：,液-液提取方法（LLE）,可以根据药物分子与基质之间的极性差异，使用适当的有机溶剂提取药物，可一次性除去大部分杂质,LLE方法需是考虑的问题,一、溶剂的选择原则,相似相溶原理进行选用沸点低、易于挥散和浓集无毒、不易乳化具有较高
8、的化学稳定性和惰性和水不相溶,常用液-液萃取溶剂,正己烷叔丁基甲醚乙醚乙酸乙酯正丁醇,极性增加,二、有机溶剂和水相的体积比,有机溶剂相和水相的体积比1:1或2:1，由实际情况决定，文献中有10:1以上,三、水相的PH值,对于碱性药物，最佳PH要高于药物PKa1-2单位，对于酸性药物，最佳PH要低于PKa1-2单位，使药物分子以非电离的形式存在，从而更易溶于有机溶剂中,操作实例,LLE方法操作实例,萃取剂,LLE方法操作实例,待测药物：氯雷他定,内标：地西泮,LLE方法总结,优点,选择性高，可除去大部分杂质对有机溶剂蒸发后复溶，可以对样品进行浓缩样品较干净，对仪器污染小不同PH体系中与不同的萃取
9、剂组合，可控制回收率，并降低基质效应,缺点,操作繁琐，不能自动化易乳化一般提取回收率较低不适用于极性大或者易挥发的化合物的提取由于需要挥发有机溶剂，对于热不稳定的化合物也不太适合，容器吸附的化合物也有一定的困难对于极性相差较大的化合物同时提取困难,生物样品常用的处理方法,一,二,三,沉淀蛋白(PPT),液液萃取(LLE),固相萃取(SPE),主要考虑生物样品的种类、被测药物的性质和测定方法三个方面的问题：,固相萃取技术(SPE),固相萃取(Solid Phase Extraction，简称SPE)是从八十年代中期开始发展起来的一项样品前处理技术。由液固萃取和液相色谱技术相结合发展而来。主要通过
10、固相填料对样品组分的选择性吸咐及解吸过程，实现对样品的分离，纯化和富集。主要目的在于降低样品基质干扰，提高检测灵敏度,固相萃取技术基本原理和方法,基本原理,采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、纯化，是一种包括液相和固相的物理萃取过程；也可以将其近似地看作一种简单的色谱过程,较常用的方法是使液体样品通过一吸附剂，保留其中被测物质，再选用适当强度溶剂冲去杂质，然后用少量良溶剂洗脱被测物质，从而达到快速分离净化与浓缩的目的也可选择性吸附干扰杂质，而让被测物质流出,基本方法,固相萃取分离类型,反相固相萃取,硅胶上键合C18，C8，C2，苯基，腈基流动相极性大于固定相，适合分离中小极性
11、的化合物的萃取疏水性相互作用,正相固相萃取,无键合硅胶、或硅胶上键合氰基、NH2、二醇基流动相极性小于固定相，适合于极性的化合物的萃取亲水性相互作用,离子交换萃取,硅胶基质的离子交换官能团，季胺，氨基、二氨基、苯磺酸基、羧基带有电荷的化合物靠静电吸引到带有电荷的吸附剂表面,吸附型萃取,采用极性较强的硅胶、硅藻土和氧化铝等吸附剂,固相萃取和HPLC相比的特点,SPE也是一个柱色谱分离过程，分离机理、固定相和溶剂的选择等方面与高效液相色谱（HPLC）有许多相似之处。 但是SPE柱的填料粒径（40m）要比HPLC填料（310m）大。由于短的柱床和大的粒径，SPE柱效比HPLC色谱柱低得多。 因此，用
12、SPE只能分开保留性质有很大差别的化合物。与HPLC的另一个差别是SPE柱是一次性使用。,固相萃取操作一般有五步：活化甲醇/乙腈 润湿小柱，活化填料；平衡水或适当缓冲液冲洗平衡小柱；上样将样品转移上柱，抽去废液；淋洗水或缓冲液最大程度洗去干扰物；洗脱用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。,亲脂型键合硅胶SPE柱实验步骤,平衡,上样,淋洗,洗脱,基质,杂质,目标化合物,常见的固相萃取柱,普通C18固相萃取固相萃取材料耐受PH范围窄（2-7.5）硅胶键合吸附剂的表面存在未键合的硅羟基，对碱性化合物的保留较强，用硅胶键合吸附剂处理碱性化合物，回收率通常较低对极性化合物保留差,HLB(Hydroph
13、ilic-lipophilic Balance Copolymer)PH1-14范围内稳定无裸露的硅醇羟基亲水物质和亲脂物质具有均衡的保留能力，覆盖了非极性、弱极性、极性化合物,Oasis HLB柱（聚合物基质）,亲水亲脂柱的优点亲水基团（吡咯烷酮基团）和疏水基团（二乙烯基苯）,对极性化合物和非极性化合物均有较好的保留，具有亲水亲脂平衡的特性具有水可润湿性，填料经活化后，即使柱床干涸，吸附剂对目标物的保留也不会发生变化有机聚合物而非硅胶，在pH 0-14 的范围内表现稳定有机聚合物基质的吸附剂，不存在次级相互作用，用于碱性化合物能够得到满意的结果,Oasis HLB柱（聚合物基质）,Oasis
14、 HLB柱（聚合物基质）,离子交换与反相模式混合的固相萃取,强阳离子和反相双重保留基质常用于提取净化生物基质中的弱碱性化合物酸性环境中含氮碱性基团与磺酸基结合酸性药物呈分子状态发生反相结合作用,反相作用,离子交换,离子交换与反相模式混合的固相萃取,固相萃取法方法总结,SPE优点：1、不发生乳化；2、适应的极性范围较广；3、提取效率高；4、方便快速；5、溶剂用量少；6、易于自动化；7、室温下操作，尤其适于处理挥发性及对热不稳定的药物。 目前，商品化固相提取小柱（cartridge）的应用已比较普遍。,最大的缺点： 贵 20多元/支,三种方法的比较：,样本较干净基质效应低,操作迅速适合各种性质化合
15、物,基质效应及其影响,基质效应（martix effect）：定义：样品测试过程中，由于待测物以外的的其它物质存在，直接或间接影响待测物相应的现象如测定血液中的红霉素浓度为例，除了红霉素之外的蛋白、磷脂、及其它内源性物质为基质共流成分会改变待测化合物的离子化效率，引起对待测化合物监测信号的抑制或提高,基质效应评价方法,柱后灌注法提取后加入法（相对基质效应评价）,MF：基质效应因子MF=Set 2/Set 1IS-normalized MF :内标归一化基质效应因子,Set 2: 提取空白生物基质，浓缩复溶形成溶液，将待测物与内标加入此溶液中。Set 1: 将待测物和内标溶于非生物基质的空白溶液
16、， 如: 用甲醇、 乙腈等溶剂直接配制待测物或内标的溶液,基质效应的消除,（1）选择合适的样品预处理方法蛋白沉淀法 处理后的样品不是很干净、内源性物质较多，从而产生较强的基质效应液液提取法和固相萃取法处理后的样品较洁净，绝大多数内源性物质易被去除，但操作复杂，可能带来提取回收率低其它问题,基质效应的消除,（2）改变被测物的色谱分离条件优化色谱条件使得待测物与内源性杂质分离内源性杂质一般极性大，反相液相中保留时间短适当延长待测组分的保留时间，有利于减少基质效应对测定的影响,基质效应的消除,（3）采用性质相近或稳定同位素内标同位素标记物为最为理想的内标物与待测物的化学性质极为相似，基质效应、操作中的环境变化等对他们的影响也一致选择同系物作为内标,（4）改用不同的离子源用于定量的离子源：电喷雾离子源（ESI）和大气压化学离子源（APCI）ESI对于基质化合物的敏感程度要高于APCIESI离子源基质效应明显可以考虑换APCI离子源,基质效应的消除,基质效应的消除,（5）其它采用小进样量利用液相色谱电解质效应使用较低的流速,The End,
