1、哈尔滨医科大学神经生物教研室张彤帅,神经细胞的培养,2,主要内容,体外培养的基本概念细胞培养的基本概念细胞培养的基本条件神经元的原代培养混合胶质细胞的原代培养小结,3,一、体外培养的基本概念,细胞培养（Cell culture）,在体外条件下，模拟体内的生理环境，使用培养液维持细胞生长与增值的技术。,4,体外培养的基本概念,组织培养（Tissue culture）,把活体的一小片组织（0.51立方毫米）置于底物上孵育，细胞自其周围移出并生长。,5,体外培养的基本概念,器官培养（Organ culture）,将活体中整个器官或一部分器官取出，置于体外生存、生长并同时保持其一定的结构和功能特征。,
2、6,二、细胞培养的基本概念,是指从体内取出组织，分离细胞；或使用细胞系，在体外模拟体内生理环境，在无菌，适当温度和一定的营养条件下，使之生存和生长，并维持其结构和功能特性。,7,细胞培养的基本概念,原代培养（Primary culture）,概念：取体内新鲜组织，并置于体外条件下生长的细胞，在传代之前称为原代培养。优点：组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。,8,细胞培养的基本概念,传代培养（Secondary culture）,原代培养的细胞或细胞系，在生长、繁殖到一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大，导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要分开种到
3、新的培养器皿中扩大培养。,9,细胞培养的基本概念,传代培养注意事项,1.操作动作要准确敏捷，不能太快，以防止空气流动，增加污染机会。2.不能用手触及消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理 。3.瓶子开口后要尽量保持45斜位。4.吸溶液的吸管不能混用。 。,10,细胞培养的基本概念,传代培养注意事项,5.接种数量一般为5x1048x105个/ml。6.传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增殖前有较长的滞留期。7.培养液由于pH下降呈黄色，若无污染需要换液或传代。,11,细胞培养的基本概念,细胞系（Cell line）,原代培养物首次传代成功后即成细胞系。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，具有
4、不死性和异体接种致瘤性。分类: 有限细胞系（Finite cell line） 无限细胞系（infinite cell line）,12,细胞培养的基本概念,细胞株（Cell strain）,由具有某些特性与标志的细胞，经选择或克隆化而派生的亚系，这些特性或标志在后续的培养中一直保持下去的细胞群。再由原细胞株进一步分离培养出与原株形状不同的细胞群，称之为亚株。,13,细胞培养的基本概念,细胞系或细胞株的命名,供体患者的姓名命名：HeLa(来源于宫颈癌)。组织来源命名：BHK 幼地鼠肾细胞（baby hamster kidney cell）。临床疾病类型命名：BALL-1 来源于B淋巴细胞急性白
5、血病人白细胞。时间地点命名：CHO 中国仓鼠卵巢细胞。 宫-743 宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立。,14,三、细胞培养的基本条件,无菌条件细胞生长条件细胞检测条件细胞保存条件,15,细胞培养的基本条件,细胞培养的无菌环境,无菌间结构：更衣间，缓冲间和操作间。（使用前）紫外照射（1530min）。每周使用甲醛熏蒸和每月用消毒液擦拭地面一次进行消毒。,16,细胞培养的基本条件,17,细胞培养的基本条件,超净工作台,工作原理：利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化过的空气通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,18,细胞培养的基本条件,超净工作台的使用,使用前
6、： 开启柜内紫外灯照射1030min； 预工作23min，以除去臭氧和使工 作台面、空间呈净化状态。使用完毕后： 要用70%酒精将台面和台内擦拭干净。,19,细胞培养的基本条件,火焰消毒,在无菌环境下培养时，首先要点燃酒精灯，以后的一切操作，如打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼。注意事项：塑料和橡胶制品过火时要快速，不能长时间烧灼。,20,细胞培养的基本条件,培养器皿的灭菌处理,压力蒸汽消毒器：湿热灭菌，压力15磅，一般维持2030min。灭菌前常用的包装材料包括牛皮纸、硫酸纸和铝饭盒。电热干燥箱：干热灭菌，温度160180，维持2h左右，主要用于玻璃器皿的灭菌。,21,细胞培养的基本
7、条件,细胞培养的实验用品,细胞培养瓶：25cm2，75cm2，150cm2,22,细胞培养的基本条件,细胞培养板：6孔、12孔、24孔、48孔和96孔（包括平底、U型和V型）。,23,细胞培养的基本条件,细胞培养皿：35mm，60mm和100mm。,24,细胞培养的基本条件,冻存管：0.5ml，1.0ml，1.5ml和2.0ml,25,细胞培养的基本条件,离心管：10ml 15ml 50mlEP管： 200l 500l 1.5ml,26,细胞培养的基本条件,CO2培养箱设定条件温度37，5% CO2含量。注意问题：1.螺旋口培养瓶，需要将瓶盖微松，以保证通气。2.保证箱内干净。3.箱内水槽内定
8、期更换灭菌蒸馏水，保持箱内湿度。,CO2培养箱,27,细胞培养的基本条件,液氮罐,主要作用：冻存组织和细胞，保存冻存管。,28,细胞培养的基本条件,国外细胞库,ATCC细胞库（www.atcc.org） 美国菌种保存中心可提供以下物品： 细胞系3000种 细菌和噬菌体15000种 动植物病毒2500种 原生动物1200种欧洲动物细胞库（ECACC）日本细胞库（RCB）,29,细胞培养的基本条件,国内细胞库,中国科学院细胞库 中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。中国典型培养物保藏中心 也称武汉大学保藏中心 ，是国家知识产权指定的专利培养物/生物材料/菌种保藏机构。,30,细胞培养的基本条件
9、,细胞培养的常用液体,水(去离子水)平衡盐溶液pH调节液消化液抗生素溶液培养基,31,细胞培养的基本条件,胶原酶I:用于上皮，肺，脂肪和肾上腺组织细胞分离。胶原酶II:用于肝脏，骨，甲状腺，心脏和唾液腺组织细胞的分离。胶原酶III:消化组织中连接部分使其成为单个细胞。胶原酶IV:包含至少7中蛋白酶成分，能消化多种组织。胶原酶V：用于胰腺小岛组织的分离，将结缔组织分离成单细胞。,32,四、神经元的原代培养,组织来源,种属：大鼠、小鼠、家鸡等。年龄：一般为胚胎或新生动物组织。 神经胶质细胞：生后早期。 蒲肯野细胞：胚胎末期。 内皮细胞：生后两周以内。,33,神经元的原代培养,常用试剂,培养液：DM
10、EM/F12培养液。平衡盐溶液：细胞PBS溶液。包被剂：多聚赖氨酸，处理培养瓶（皿）（10mg/L）。0.25%胰蛋白酶。神经营养因子：成纤维生长因子（bFGF），脑源性神经营养因子（BDNF），神经细胞生长因子（B27）。,34,神经元的原代培养,实验操作步骤,1.包被 培养前晚上将培养瓶（皿）用多聚赖氨酸包被10min，吸除，使用细胞PBS溶液清洗，无菌操作台上自然晾干，置于培养箱中备用。,35,神经元的原代培养,2.取脑 选取新生24h的小鼠数只，雌雄不限，75%酒精全身消毒，断头处死，无菌条件下分层剪开头皮、颅骨，用弯镊拉开脑区视野，小心取出全脑，使用细胞PBS清洗数次。,实验操作步骤
11、,36,神经元的原代培养,实验操作步骤,3.分离 以脑中线为起点，小心拨开大脑颞叶皮层，暴露出新月状海马回，小心夹出海马组织，置于冰浴的PBS溶液中，仔细剔除微血管，并充分剪碎组织。,37,神经元的原代培养,实验操作步骤,4.消化 加入同体积0.125%的胰蛋白酶，瓶口用锡箔纸盖上，37培养箱内消化20min左右，期间轻摇数次。,38,神经元的原代培养,实验操作步骤,5.过滤 加入数滴胎盘牛血清终止消化，用尖头吸管轻轻吹打细胞数分钟，至液体成米糊状即可停止吹打，动作要轻柔，用150目网筛过滤，收集细胞悬液。,39,神经元的原代培养,实验操作步骤,6.接种 以1100rpm离心5min，倾倒去上
12、清，用DMEM/F12培养液重悬细胞，轻轻吹打，台盼蓝染色快速计数，根据计数结果，调整细胞终浓度为1x105/ml，加入终浓度为10%胎牛血清接种于培养瓶中，放于培养箱中，12h内禁止晃动。,40,神经元的原代培养,神经元纯化措施,消化前细心剔除微血管。过滤选择150-200目筛网，使培养的细胞呈单个或数个成团。接种24h时需全量换培养基，除去未贴壁的死细胞。接种48h时加一定浓度的阿糖胞苷，以抑制非神经元细胞的过度生长。,41,神经元的原代培养,神经元显微镜下观察,刚分离出的神经元呈圆形，接种一般在2-6小时可贴壁。,42,神经元的原代培养,神经元显微镜下观察,24h后可见细胞体积开始增大，
13、生长良好的细胞可见胞体周围明显光晕，突起以单、双突起为主。,43,神经元的原代培养,神经元显微镜下观察,培养至4d，神经元胞体明显增大，形态多样，有些已经具有分枝的突起。,44,神经元的原代培养,培养至7d后，神经元形态基本成熟，具有光滑的胞体，发育良好的突起。,神经元显微镜下观察,45,神经元的原代培养,神经元的鉴定,神经元的表面标记物一般选择MAP-2。,46,五、混合胶质细胞的原代培养,常用试剂,培养液：含10%FBS的DMEM培养液。平衡盐溶液：细胞PBS溶液。包被剂：多聚赖氨酸，处理培养瓶（皿）（10mg/L）。0.25%胰蛋白酶。,47,混合胶质细胞的原代培养,实验操作步骤,1.取
14、脑 取新生小鼠若干只（出生24h内），,1.包被 培养前晚上将培养瓶（皿）用多聚赖氨酸包被10min，吸除，使用细胞PBS溶液清洗，无菌操作台上自然晾干，置于培养箱中备用。,48,混合胶质细胞的原代培养,2.取脑 选取新生24h的小鼠数只，雌雄不限，75%酒精全身消毒，断头处死，无菌条件下分层剪开头皮、颅骨，用弯镊拉开脑区视野，小心取出全脑，使用细胞PBS清洗数次。,实验操作步骤,49,混合胶质细胞的原代培养,3.分离 把全脑移入另一个盛有PBS液的培养皿中，用小毛笔轻轻刷去脑表面的脑膜和血管，用PBS液冲洗后剪去脑干仅留大脑半球，并用剪刀剪碎脑组织。,实验操作步骤,50,4.消化 加入比组织
15、块总量多3050倍的0.05%胰酶，再移入50ml离心管，用吸管器反复吹打消化至肉眼观察无明显的脑组织团块。,混合胶质细胞的原代培养,实验操作步骤,51,混合胶质细胞的原代培养,5.过滤 加入数滴胎盘牛血清终止消化，用尖头吸管轻轻吹打细胞数分钟，至液体成米糊状即可停止吹打，动作要轻柔，用150目网筛过滤，收集细胞悬液。,实验操作步骤,52,6.接种 1000rpm/min，离心5min，弃上清，加定量完全培养液制成细胞悬液，根据实验要求接种于培养瓶（皿）中，置于培养箱培养，每3d换液一次。,混合胶质细胞的原代培养,实验操作步骤,53,混合胶质细胞的原代培养,温和胰酶消化法,目的：由于混合胶质细
16、胞中存在多种胶质细胞，并且分层生长，根据不同种类细胞对胰酶的敏感度不同，使用胰酶消化法分离和纯化混合胶质细胞中的星形胶质细胞和小胶质细胞。,54,混合胶质细胞的原代培养,实验操作步骤,混合胶质细胞培养1012d后，在倒置显微镜下可观察到细胞生长出现分层现象。,55,混合胶质细胞的原代培养,实验操作步骤,倒掉培养液，加入无血清DMEM培养液4:1稀释后的胰酶-EDTA溶液，在37下作用2540min。轻轻摇动培养瓶，上层细胞与下层细胞分离。,56,实验操作步骤,混合胶质细胞的原代培养,上层细胞：星形胶质细胞。下层细胞：小胶质细胞。,57,混合胶质细胞的原代培养,星形胶质细胞的鉴定,星形胶质细胞的
17、表面标记物一般选择GFAP,58,混合胶质细胞的原代培养,小胶质细胞的鉴定,小胶质细胞的表面标记物一般选择Iba-1,59,神经细胞原代培养的意义,提供体内生长过程在体外重现的机会。通过不同的技术手段直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能的变化。易于施行物理（如缺氧，缺血）、化学和生物因子的实验条件，观察条件变更对神经细胞直接和间接作用。便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制。,60,小结,了解体外培养的分类。 熟悉细胞培养的基础知识。 掌握神经元和神经胶质细胞的培养方法。,61,思考题,细胞培养中常用的液体。传代培养的注意事项。使用细胞计数板计数的公式和计数原则。冻存细胞的原则是什么？简述冻存细胞的程序,
