1、基因工程复习,一基因工程的概念,由于基因工程是在分子水平上进行操作,因此又叫做重组DNA技术。,生物体外,基因,分子水平,剪切连接导入表达,产生人类需要的基因产物,基因工程是指按照人们的愿望，将一种生物的基因在体外剪切，并与特殊的运载工具进行重新组合，然后转入另一种生物的体内进行扩增，并使之表达所需要蛋白质的技术。通过体外DNA重组和转基因技术，定向地改造生物的遗传性状。,二、基因工程的基本工具,（一）“分子手术刀”1来源：主要是从 中分离纯化出来的。2功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的 断开。3结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端
2、通常有两种形式： 。,限制性内切酶（简称限制酶）,原核生物,磷酸二酯键,黏性末端和平末端,（二）“分子针线”DNA连接酶1分类：根据酶的来源不同，可分为Ecoli DNA连接酶和T4DNA连接酶两类2功能：恢复被限制酶切开了两个DNA片段之间的磷酸二酯键。两种DNA连接酶(Ecoli DNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较：相同点：都缝合磷酸二酯键区别： Ecoli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接；T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。,DNA连接酶与DNA聚合酶的比较,注意：解旋酶：能使DNA两条链上碱基之间的氢键断开，形成两条单链。,（三）“分子运
3、输车”载体（1）作用：将目的基因转移到宿主细胞内，利用载体在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。（2）载体具备的条件： 有1多个限制酶切点 对受体细胞无害导入基因能在受体细胞中复制、表达有某些标记基因，便于筛选。（3）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。（4）其它载体：噬菌体衍生物、某些动植物病毒,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建（核心）,3、重组载体的导入和筛选,4、目的基因的表达与鉴定,三、基因工程的基本过程,三、基因工程的基本过程,第一步：目的基因的获得1.目的基因是指：编码蛋白质的外源基因。2.原核基因采
4、取直接分离法获得，真核基因是人工合成法。人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。,直接分离法（鸟枪法）：,供体细胞中的DNA,许多DNA片段,重组载体,限制酶,与载体连接,受体细胞,产生特定性状,导入,外源DNA扩增,目的基因,分离,反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，借助于反转录酶，反转录成互补的单链DNA，然后在聚合酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,单链DNA(cDNA),反转录酶,DNA聚合酶,双链DNA(目的基因),化学合成法 ：,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,目的基因的核苷酸序列,通过密码子推测,利用碱基互补配对原则
5、推测,目的基因,化学合成,补充：PCR技术,利用PCR技术扩增目的基因（选修74页）（1）PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。（2）目的：获取大量的目的基因（3）原理：DNA复制（4）过程：第一步：加热至95，碱基对之间的氢键断裂，DNA双链拆开形成两条单链高温变性；第二步：冷却到55 ，使一对引物分别与两条单链DNA结合低温复性；第三步：加热至7，在热稳定DNA聚合酶（Taq酶）的催化作用下，形成两条新的子链中温延伸。（5）特点：指数形式扩增,1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。,标记基因的作用：是为了鉴定
6、受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因。（人教P11页）,2、方法：同一种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接酶把两者连接。,第二步：重组载体的构建（核心）,注意：重组载体重组成功的物质基础是：目的基因和载体（质粒）的结构组成相同。,思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。,第三步：重组载体的导入和筛选,转化,显微注射法,用氯化钙（Ca2+）处理,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程
7、,受体细胞,稳定,表达,此方法的受体细胞多是受精卵,补充：感受态细胞：原核细胞经过氯化钙处理后，处于一种 能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。,受体细胞常选用原核生物为什么？,筛选出获得目的基因的受体细胞、培养受体细胞并诱导目的基因的表达1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。2.其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是采用DNARNA分子杂交技术。3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原抗体杂交技术。4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如抗虫或抗病的鉴定等。,第四步：目的基因的表达与鉴定,注意：、目的基因成功表达的标志是
8、：转基因生物合成了目的基因控制合成的蛋白质，并显示出目的基因控制的性状。2、目的基因能在受体细胞内成功表达是因为：所有生物共用一套密码子。3、目的基因能与受体细胞基因进行重组是因为：DNA的基本组成单位和空间结构相同。,与杂交育种和诱变育种相比，最突出的优点是：目的性强、育种周期短，克服了远缘杂交不亲和的障碍，可以培育出高产、优质或具有特殊用途的动植物品种。,四、基因工程育种的优点,五、基因工程的应用,1、植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。2、动物基因工程：提高动物生长速度来提高产品产量、改善产品品质，用转基因动物生产药物，用转基因动物作器官移植的供体等。,3
9、、基因诊断：是用放射性同位素（如32P）、荧光分子等标记的DNA分子做探针，利用DNA分子杂交原理，鉴定被检测标本上的遗传信息，从而达到检测疾病的目的。 。4、基因治疗：将正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞内，纠正基因缺陷而达到治疗疾病的目的。主要策略有基因置换、基因修复、基因增补、基因失活等。实例：基因如治疗镰刀型细胞贫血症。,六、蛋白质工程的概念、基本途径,1、概念：蛋白质工程是指根据蛋白质的精细结构和生物活性之间的关系，按照人类自身的需要，利用生物技术对蛋白质的编码序列或直接对蛋白质进行有目的的改造，从而创造出自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。由于蛋白质工程是在基
10、因工程的基础上发展起来的，在技术方面有许多和基因工程相似的地方，因此，蛋白质工程也被称为第二代基因工程。（而基因工程只能生产自然界已存在的蛋白质）2、蛋白质工程的实质：根据蛋白质的结构与功能之间的关系，通过改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的、具有优良特性的蛋白质。,3、蛋白质工程的基本途径预期蛋白质功能测定蛋白质三维空间结构推测应有的氨基酸序列推测对应的脱氧核苷酸序列合成基因通过转录、翻译合成具有预期功能的蛋白质。4、蛋白质的分子设计（1）小范围内改造：对已知结构的蛋白质进行少数氨基酸的替换。（2）对不同来源的蛋白质拼接组装，期望转移相应的功能。（3）蛋白质分子从头设计：就
11、是从氨基酸的排列顺序出发，设计制造出自然界不存在的全新蛋白质，使之具有特定的空间结构和预期功能。5、蛋白质工程的应用（1）通过改造酶的结构，提高蛋白质的稳定性T4溶菌酶（2）改变蛋白质的活性组织纤溶酶原激活物。（3）合成嵌合抗体小鼠单克隆抗体和人抗体的结合。,七、蛋白质工程与基因工程区别,例1 （08年全国卷理综1）已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指，如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现在多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切后，这些线性
12、DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是 A.3 B.4 C.9 D. 12,解题思路:如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段；从其中二个切点进行酶切，可得到不同于前面的片段种类有三种；只有一个切点，得到不同于前面的片段种类有二种。故最多能产生片段种类4+3+2=9种。,例2（07年北京卷）利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列选项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是 A棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因 B大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA C山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列 D酵母菌
13、细胞中提取到人干扰素蛋白,答案：D （主要考查基因表达的基本概念，要有蛋白质产品产生，属于性状的表现。）,3(高考试题：2007全国理综II)下列有关基因工程中限制内切酶的描术，错误的是A.一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B.限制性内切酶的活性受温度的影响C.限制性内切酶能别和切割RNAD、限制性内切酶可从原核生物中提取,4、【生物现代生物技术专题】为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的 处，DNA连接酶作用于 处。（填“a”或“b
14、”）,（2） 将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和 法。,（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术。该技术的核心是 。（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。,基因枪法（花粉管通道法）,植物组织培养,去分化和再分化,耐盐基因,一定浓度盐水浇灌（移栽到盐碱地中）,51979年，科学家将动物体内的能够合成胰岛素的基因与大肠杆菌的DNA分子重组，并且在大肠杆菌中表达成功。如右图，请据图回答问题。(1)此图表示的是采取_ _方法获取_基因的过程。,人工（反转录）,胰岛素目
15、的基因,(2)图中DNA是以_ _为模板，_形成单链DNA，在酶的作用下合成双链DNA，从而获得了所需要的基因。,胰岛素mRNA,逆转录,(3)图中代表的是_酶，在它的作用下将质粒切出理想的末端。(4)图中代表 DNA，含_基因。 (5)图中表示的过程是_ _。,限制酶,重组,胰岛素,将目的基因导入受体细胞,6(高考试题：2007山东理综) 继哺乳动物乳腺发生器研发成功后，膀胱生物发生器的研究也取得了一定进展。最近，科学家培养出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答：（1）将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，常用方法是_。（2）进行基因转移是，通常要将外源基因
16、转入_中，原因是_。（3）通常采用_ _ 技术检测外源基因是否插入了小鼠的基因组,显微注射,受精卵,受精卵具有全能性，可使外源基因在相应组织细胞表达,DNA分子杂交,7、豇豆对多种害虫具有抗虫能力，根本原因是豇豆体内具有胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI基因)。科学家将其转移到水稻体内后，却发现效果不理想，主要原因是CpTI蛋白质的积累量不足。经过在体外对CpTI基因进行了修饰后，CpTI蛋白质在水稻中的积累量就得到了提高。修饰和表达过程如下图所示：请根据以上材料，回答下列问题：,(1)CpTI基因是该基因工程中的 基因，“信号肽，序列及“内质网滞留信号”序列的基本组成单位是 。,四种脱氧核苷酸,目
17、的,在过程中，首先要用 酶切开，暴露出 ，再用 酶连接。(2)在该基因工程中，供体细胞是 ，受体细胞是 。(3)过程称为 。(4)检测修饰后的CpTI基因是否表达的最好方法是 。,黏性末端,限制性内切,水稻细胞,豇豆细胞,转录,让多种害虫吞食水稻叶片,（5）与杂交育种、诱变育种相比，通过基因工程来培育新品种的主要优点是 和 。（6）当前，转基因大豆，转基因棉花等已经进入了我们的生活。请你谈谈转基因农作物可能带来的利与弊。（各一条）,目的明确 培育周期短,利：可以让人类获得具有优良品质的作物，如蛋白质含量更高、抗逆性更强；打破传统育种界限，如植物表达微生物的抗虫性状。弊：转基因农作物也可能变异成为对人类或环境有害的物种，如抗逆性极强的“超级杂草”；造成基因污染；影响食品安全。,
