1、 1 不同炮制 工艺 山绿茶 药材 特征图谱 的 比较 研究 谢臻 1， 张龙 2，陈勇 *1， 郑锡任 1， 李耀华 1， 农莉 1，刘鼎 1，李怡萱 1 1 广西中医药大学 药学院，南宁 530001 2 柳州市人民医院，广西 柳州 545006 摘要 目的 ： 采用 HPLC研究不同炮制工艺山绿茶药材特征图谱的变化，为科学评价和控制其质量提供有效的方法。 方法 ： 以 70%乙醇为提取溶剂，采用加热回流的方法提取制备供试样品。以Phenomenon C18色谱柱为固定相， 流动相 乙腈 -0.1%磷酸水 梯度洗脱，检测波长 330 nm，柱温 25 ，进样量 10 L，流速 1.0 mL
2、 min-1，进行 HPLC特征图谱检测。以芦丁为对照品，检测不同炮制工艺 山绿茶 药材 中 芦丁含量变化。 结果 ： 不同炮制 工艺 药材中 共确定 9个主要共有特征峰。研究发现特征图谱中主要色谱峰发生了显著改变，与炮制前相比峰面积显著降低。表明山绿茶药材经炮制处理后，主要化学成分含量明显减少。 结论 ： 该 HPLC特征图谱检测方法 重 复 性、精密 度 良好 ，可用于山绿茶药材及其炮制品的质量控制。 关键词： 山绿茶；炮制工艺；芦丁；特征图谱 Comparative Study on the Characteristic Chromatogram of Different Process
3、ing Methods of Ilex hainanensis XIE Zhen1, ZHANG Long2, CHEN Yong1*, ZHENG Xi-ren1, LI Yao-hua1, NONG Li1, LIU Ding1, LI Yi-xuan1 1 Faculty of Pharmacy,Guangxi Traditional Chinese Medicine University, Nanning 530001， China； 2 The People s Hospital of Liuzhou Guang 545006, China ABSTRACT： Objective T
4、o establish a sensitive and specific HPLC method for quality control of Ilex hainanensis Merr. Methods HPLC method was applied for quality assessment of Ilex hainanensis Merr. HPLC analysis was performed on a HanbonC18 column (250mm4 6mm， 5 m) The mobile phase consisted of acetonitrile (solvent B) a
5、nd watercontaining0.1% (v/v) phosphoric acid (solvent A) at a constant flow rate of 1.0ml/min An increasing linear gradient (v/v) of solvent B was used. The injection volume was 10l. The column temperature was set at 25 . The chromatogram s were monitored at 330nm. Results In different varieties of
6、processing methods of Ilex hainanensis Merr. showing 9 characteristic peaks. It was established from its prepared samples of Ilex hainanensis Merr. Conclusion The characteristic chromatogram of Ilex hainanensis Merr. with high specificity can be used to control its quality as well as the consistency
7、 of processing products. Key words: Ilex hainanensis Merr.； Processed products； Rutin； Characteristic chromatogram 收稿日期 20140609（ 008） 基金项目 国家 自然科学基金地区科学基金项目（ 81060344） ； 广西自然科学基金创新研究团队项目（ 2011GXNSFF018006） 作者简介 谢臻，博士，副教授，硕士生导师，从事中药质量控制、复方配伍研究 ， E-mail: xie_ 通讯作者 *陈勇，教授，硕士生导师，从事中药质量分析教学与科研 工作， Tel:1
8、8978947922， E-mail: 山绿茶为冬青科植物海南冬青的干燥叶，主要分布于海南、广西、广东等地，为广西少数民族2 民间中草药， 使用历史悠久，已收载于广西中草药标准 (1990年版 )，具有清热解毒、平肝潜阳、活血化瘀的功效 1-2，主要用于防治高血压症、降血脂、降胆固醇、冠心 病、脑血管意外所致的偏瘫、风热感冒、口腔炎、慢性喉炎、妇科炎等 2-3。 目前对山绿茶的研究主要集中在化学成分的提取分离与鉴定， 以及药理作用研究等方面。有文献报道 4，山绿茶降 压片能明显减少小鼠自发活动，有协同阈下剂量戊巴比妥钠诱发小鼠睡眠的趋势，并有明显的降压及降血脂作用。山绿茶醇提物对四氧嘧啶所致的
9、糖尿病小鼠具有较好的降血糖作用 5。本文作者前期研究表明，山绿茶对实验性鹌鹑高脂血症的降血脂作用 6，对麻醉猫正常血压均有降压作用 7； 同时 测定了山绿茶 茎和叶中挥发油成分 及 不同炮制品中芦丁、绿原酸 、 总黄酮的含量 8-11。本实验对不同炮制品山绿茶药材特征图谱进行研究，为充分利用山绿茶药材资源，制定山绿茶 的 规范化 炮制品 ， 提高药材质量 提供了理论依据。 1材料 l.1 药材 山绿 茶药材采自广西上林县，经广西中医药大学陈勇教授鉴定，符合广西中药材标准（ 1990年版）山绿茶项下药材品种，确定为冬青科植物海南冬青 Ilex hainanensis Merr.的鲜叶。炮制工艺包
10、括 烘烤炮制、微波炮制、清炒炮制、传统炮制、阴干； 烘烤炮制 包括 180 烘烤 30 min、 200 烘烤 30 min、 220 烘烤 30 min、 200 烘烤 20 min、 200 烘烤 30 min、 200 烘烤 40 min； 微波炮制 包括 60 g药材微波 11 min、 80 g药材微波 11 min、 10 0g药材微波 11 min、 80 g药材微波 9 min、80 g药材微波 11 min、 80 g药材微波 13 min。 其中 传统炮制 方法为： 将采摘的山绿茶药材鲜叶尽快用热锅（ 260 280 ）翻炒，杀青，接着在揉搓台上用手揉搓，然后复炒 2 3
11、次，至叶色呈暗绿色，带有银灰绿色，略有光泽为度，取出，放置烘房中烘干，取出，放凉，即得山绿茶药材传统炮制品。 山绿茶对照药材由中国 食品药品 检定 研究院 提供（批号 1247-0301）。 芦丁对照品（批号 111231，供含量测定用 ， 纯度大于 98%，由上海融禾医药科技发展有限公司提供 ） 。 1.2 试剂 甲醇、乙腈为色谱纯（ Fisher公司）；其他试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。 1.3 仪器 1260系列 高效液相色谱仪 及 1260 series色谱工作站（美国安捷伦科技公司） ， BP211D型 电子分析天平（德国赛多利斯） ， AE100S型 电子分析天平（梅
12、特勒 -托利多仪器上海有限公司） ， 101A-3E型 电热鼓风干燥箱（上海实验仪器厂有限公司） ， LG16-WA 型 高速微量离心机（北京京立离心机有限公司） ， KQ5200B型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司） ， Millipore Simplicity-185型 超纯水器（美国密理博公司）。 2 方法与结果 3 2.1 色谱 条件 Phenomenon C18色谱柱 （ 4.6 mm150 mm， 5 m）；流动相 乙腈 （ A） - 0.1%磷酸 （ B） ，洗脱程序 （ 020 min， 9%15%A； 2050 min， 15%25%A； 5075 min， 25%40%A
13、）， 检测波长 330 nm， 流速 1 mLmin-1， 柱温 30 ， 进样量 10 L， 理论塔板数以芦丁 峰 计应不低于 10 000。 样品色谱图及对照品色谱图见 图 12。 图 1 山绿茶对照药材特征色谱 图 图 2 芦丁对照品色谱峰 2.2 供试品溶液的制备 取山绿茶对照药材干燥粉末（过 40目筛） 2.0 g，精密称定，置 100 mL锥形瓶中，精密加入 50%乙醇 40 mL，称 定质量 ，水浴加热，回流提取 30 min，放冷，用 50%乙醇补足减损的 质 量，滤过，取续滤液约 2 mL，离心 10 min（ 10 000 rmin-1），取上清液，即得供试品溶液。 2.3
14、 对照品溶液的制备 取芦丁对照品 5.0 mg，精密称定，置 10 mL量瓶中，加 50%乙醇，稀释至刻度，摇匀，即得浓对照品溶液，再取 5.0 mL该溶液， 置 10 mL量瓶中，加 50%乙醇至刻度，摇匀，即得 为 0.250 0 gL-1对照品溶液。 2.4 精密度试验 取阴干炮制山绿茶药材，按供试品溶液制备方法制备，在上述色谱条件下记录特征图谱。结果表明，各色谱峰的相对保留时间 RSD 在 0.04%1.34%，各峰相对峰面积 RSD 在0.17%1.68%，表明仪器的精密度良好。 2.5 重复性试验 精密称取阴干炮制山绿茶药材 6份，按供试品溶液制备方法制备，在上述色谱条件下测定 ,
15、 记录特征图谱 没 。结果表明， 6 份样品的 HPLC 特征图谱中各色谱峰的相对保留时间 RSD在 0.050.37%，各峰相对峰面积 RSD在 0.204.43%。 2.6 稳定性试验 取阴干炮制山绿茶药材，按供试品溶液制备方法制备，在上述色谱条件下，分别在0， 4， 8， 12， 16， 24 h检测特征图谱 , 结果表明，各色谱峰的相对保留时间 RSD在 0.09%0.88%，各峰相对峰面积 RSD在 0.39%2.30%。 2.7 不同炮制品种山绿茶药材特征图谱的采集 取 不同炮制工艺所得山绿茶药材 粉末 适量 （ 已扣除药材水分， 相当于新鲜药材 5.0 g） 各 1份 ， 精密称
16、定，共 17份，按 2.2项下供试品制备方法制备山绿茶药材供试品溶液，按 2.1项下的色谱条件下依次进行测定，记录 17批次山绿茶 HPLC色谱图，确定了 11 个共有特征色谱峰 ，其中 6号峰为对照品峰 。 各样品 色谱图见图 319。 m in0 10 20 30 40 50 60 70m A U 020406080100V W D 1 A , 波长 = 3 4 0 n m ( D : 山绿茶指纹图谱 山绿茶 山绿茶 2 0 0 8 0 2 2 7 2 0 0 8 0 2 2 7 0 0 0 0 0 9 . D )34.095m in0 10 20 30 40 50 60 70m A U0
17、100200300400500V W D 1 A , W a v e le n g th = 3 3 0 n m (E :山绿茶 实验数 .0 1 2 0 8 0 6 S L C 2 0 1 2 1 2 2 6 Z X R 0 2 0 1 2 -1 1 -0 7 0 9 -2 8 -1 9 S L C -Y IN G A N .D )1 2 3 4 5 6 11 10 9 8 7 m in0 10 20 30 40 50 60 70m A U0204060801001201401601 2 3 4 5 9 8 7 6 4 图 3 烘烤炮制药材色谱图 图 4 微波炮制药材色谱图 图 5 清炒炮制
18、药材色谱图 图 6 传统炮制药材色谱图 图 7 阴干炮制药材色谱图 图 8 180 烘烤 30min药材色谱图 图 9 200 烘烤 30min药材色谱图 图 10 200 烘烤 40min药材色谱图 图 11 220 烘烤 20min药材色谱图 m in0 10 20 30 40 50 60 70m A U0204060801001201401601 2 3 4 5 9 8 7 6 m in0 10 20 30 40 50 60 70m A U0100200300400500600V W D 1 A , W a v e le n g th = 3 3 0 n m (E :山绿茶 实验数 .2
19、 0 8 0 6 S L C 2 0 1 2 1 2 2 6 Z X R 0 2 0 1 2 -1 1 -0 7 0 9 -2 8 -1 9 S L C -Q IN G C H A O .D )1 2 3 4 5 9 8 7 6 m in0 10 20 30 40 50 60 70m A U0200400600800100012001400V W D 1 A , W a v e le n g th = 3 3 0 n m (E :山绿茶 实验数 .0 8 0 6 S L C 2 0 1 2 1 2 2 6 Z X R 0 2 0 1 2 -1 1 -0 7 0 9 -2 8 -1 9 S L
20、C -C H U A N T O N G .D )1 2 3 4 5 9 8 7 6 m in0 10 20 30 40 50 60 70m A U0100200300400500V W D 1 A , W a v e le n g th = 3 3 0 n m (E :山绿茶 实验数 .0 1 2 0 8 0 6 S L C 2 0 1 2 1 2 2 6 Z X R 0 2 0 1 2 -1 1 -0 7 0 9 -2 8 -1 9 S L C -Y IN G A N .D )1 2 3 4 5 9 8 7 6 m in0 10 20 30 40 50 60 70m A U02040608
21、0100120140V W D 1 A , W a v e le n g th = 3 3 0 n m (E :山绿茶 实验数 . 数据 -2 0 1 2 0 8 0 6 S L C 2 0 1 2 1 2 2 6 Z X R 2 0 1 2 -1 2 -1 8 1 2 -2 5 -2 4 H K 1 8 0 C .D )1 2 3 4 5 9 8 7 6 m in0 10 20 30 40 50 60 70m A U012345678V W D 1 A , W a v e le n g th = 3 3 0 n m (E :山绿茶 实验数 .1 2 0 8 0 6 S L C 2 0 1 2
22、 1 2 2 6 Z X R 0 2 0 1 2 -1 1 -0 7 0 9 -2 8 -1 9 S L C -H O N G K A O .D )1 2 3 4 5 9 8 7 6 m in0 10 20 30 40 50 60 70m A U010203040506070V W D 1 A , W a v e le n g th = 3 3 0 n m (E :山绿茶 实验数 . 数据 -2 0 1 2 0 8 0 6 S L C 2 0 1 2 1 2 2 6 Z X R 2 0 1 2 -1 2 -1 8 1 2 -2 5 -2 4 H K 2 2 0 C .D )1 2 3 4 5
23、9 8 7 6 m in0 10 20 30 40 50 60 70m A U010203040506070V W D 1 A , W a v e le n g th = 3 3 0 n m (E :山绿茶 实验数 . 数据 -2 0 1 2 0 8 0 6 S L C 2 0 1 2 1 2 2 6 Z X R 2 0 1 2 -1 2 -1 8 1 2 -2 5 -2 4 H K 2 2 0 C .D )1 3 3 4 5 9 8 7 6 m in0 10 20 30 40 50 60 70m A U012345678V W D 1 A , W a v e le n g th = 3 3
24、0 n m (E :山绿茶 实验数 .1 2 0 8 0 6 S L C 2 0 1 2 1 2 2 6 Z X R 0 2 0 1 2 -1 1 -0 7 0 9 -2 8 -1 9 S L C -H O N G K A O .D )1 2 3 4 5 9 8 7 6 5 图 12 220 烘烤 30min药材色谱图 图 13 220 烘烤 40min药材色谱图 图 14 60g药材微波 11min药材色谱图 图 15 80g药材微波 11min药材色谱图 图 16 100g药材微波 11min药材色谱图 图 17 80g药材微波 9min药材色谱图 图 18 80g药材微波 11min药材
25、色谱图 图 19 80g药材微波 13min药材色谱图 2.8 山绿茶药材 不同炮制品中芦丁含量 测定 精密吸取经稀释后不同浓度的混合对照品 溶液 10 L，共 6份，分别注入高效液相色谱仪测定，以对照品进样量 (g)为横坐标 ，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程 。 芦丁标准曲线 Y=1 258X-1.406(r=1.000 0)。不 同炮制品山绿茶药材 芦丁含量（ 已扣除药材水分）结果 见表 24。 表 2 不同炮制方法山绿茶药材芦丁含量 mgg-1 m in0 10 20 30 40 50 60 70m A U020406080100120V W D 1 A , W a v e
26、le n g th = 3 3 0 n m (E :山绿茶 实验数 . 数据 -2 0 1 2 0 8 0 6 S L C 2 0 1 2 1 2 2 6 Z X R 2 0 1 2 -1 2 -1 8 1 2 -2 5 -2 4 H K 4 0 M IN .D )1 2 3 4 5 9 8 7 6 m in0 10 20 30 40 50 60 70m A U0100200300400500V W D 1 A , W a v e le n g th = 3 3 0 n m (E :山绿茶 实验数 .0 数据 -2 0 1 2 0 8 0 6 S L C 2 0 1 2 1 2 2 6 Z X
27、 R 2 0 1 2 -1 2 -2 0 1 7 -4 7 -2 9 W B 6 0 G .D )1 2 3 4 9 8 7 6 5 m in0 10 20 30 40 50 60 70m A U0100200300400500600700V W D 1 A , W a v e le n g th = 3 3 0 n m (E :山绿茶 实验数 .0 数据 -2 0 1 2 0 8 0 6 S L C 2 0 1 2 1 2 2 6 Z X R 2 0 1 2 -1 2 -2 0 1 7 -4 7 -2 9 W B 8 0 G .D )1 2 3 4 9 8 7 6 5 m in0 10 20
28、 30 40 50 60 70m A U0100200300400V W D 1 A , W a v e le n g th = 3 3 0 n m (E :山绿茶 实验数 . 数据 -2 0 1 2 0 8 0 6 S L C 2 0 1 2 1 2 2 6 Z X R 2 0 1 2 -1 2 -2 0 1 7 -4 7 -2 9 W B 1 0 0 G .D )1 2 3 4 9 8 7 6 5 m in0 10 20 30 40 50 60 70m A U0100200300400500600700800V W D 1 A , W a v e le n g th = 3 3 0 n m
29、 (E :山绿茶 实验数 . 数据 -2 0 1 2 0 8 0 6 S L C 2 0 1 2 1 2 2 6 Z X R 2 0 1 2 -1 2 -2 0 1 7 -4 7 -2 9 W B 9 M IN .D )1 2 3 4 9 8 7 6 5 m in0 10 20 30 40 50 60 70m A U0100200300400500600700V W D 1 A , W a v e le n g th = 3 3 0 n m (E :山绿茶 实验数 .0 数据 -2 0 1 2 0 8 0 6 S L C 2 0 1 2 1 2 2 6 Z X R 2 0 1 2 -1 2 -
30、2 0 1 7 -4 7 -2 9 W B 8 0 G .D )1 2 3 4 9 8 7 6 5 m in0 10 20 30 40 50 60 70m A U0100200300400500600V W D 1 A , W a v e le n g th = 3 3 0 n m (E :山绿茶 实验数 .0 数据 -2 0 1 2 0 8 0 6 S L C 2 0 1 2 1 2 2 6 Z X R 2 0 1 2 -1 2 -2 0 1 7 -4 7 -2 9 W B 1 3 .D )1 2 3 4 9 8 7 6 5 6 炮制方法 芦丁 200 烘烤 30 min 0.92 80 g
31、药材微波 11 min 1.36 清炒 0.96 传统 4.49 阴干 1.53 表 3 不同烘烤 工艺 山绿茶药材芦丁含量 mgg-1 炮制方法 芦丁 180 烘烤 30 min 0.40 200 烘烤 30 min 0.92 220 烘烤 20 min 1.38 220 烘烤 30 min 0.87 220 烘烤 40 min 0.26 表 4 不同微波 工艺 山绿茶药材芦丁含量 mgg-1 炮制方法 芦丁 60 g药材微波 11 min 1.93 80 g药材微波 11 min 1.66 100 g药材微波 11 min 2.17 80 g药材微波 9 min 2.08 80 g药材微波
32、 11 min 1.65 80 g药材微波 13 min 1.78 3 讨论 3.1 提取方法的考察 考察了超声提取法、回流提取法、 浸渍法 3种不同提取方法、料液比以及提取时间的特征图谱情况，通过比较各项数据以及信号峰的多少，选定以回流提取为提取方法，得到的图谱最佳。 3.2 提取溶剂的选择 分别采用了甲醇、乙醇对山绿茶进行提取制备样品溶液然后对各样品进行HPLC分析，比较不同提取溶剂的特征图谱，结果表明以甲醇和乙醇为提取溶剂，对山绿茶主要成分的提取效果相似，分离效果均比较理想，但是乙醇比甲醇安全、经济，故选择乙醇为 提取溶剂，并考察了不同浓度的乙醇提取效果，结果表明，以 50%乙醇为为提取
33、溶剂，得到的图谱最佳，故选择 50%乙醇为本实验的提取溶剂。 7 3.3 不同炮制方法山绿茶药材 HPLC特征图谱比较 考察不同炮制方法山绿茶药材 HPLC特征图谱，共确定了 9个共有特征峰。通过比较，发现各组间，特征图谱差异较大，且各组间主要成分含量也存在加大差异。烘烤炮制药材和微波炮制药材中色谱峰数目较多；清炒炮制药材、传统炮制药材和阴干炮制药材色谱峰数目较少。说明药材经烘烤和微波炮制之后化学成分发生了变化。 3.4 不同烘烤工艺山绿茶药材 HPLC 特征图谱比 考察不同烘烤工艺山绿茶药材 HPLC特征图谱，共确定了 9个共有特征峰。通过比较，发现各组间，特征图谱差异很小，基本无变化，但各
34、组间主要成分含量存在较大差异。不同烘烤温度药材中，芦丁含量随温度变化呈抛物线变化；不同烘烤时间药材中，芦丁含量随时间增加而减少。所以表明，不同烘烤温度及时间对山绿茶药材主要成分影响较大。 3.5 不同微波工艺山绿茶药材 HPI C特征图谱比较 考察 不同微波工艺 山绿茶药材 HPI C特征图谱，共确定了 9 个共有特征峰。通过比较，发现各组间，特征图谱差异很小，基本无变化，但各组间 主要成分含量存在较大差异。 同一微波时间（ 11 min）不同微波 质 量药材中，芦丁含量随温度变化呈现先减后增的趋势；在同一微波 质 量（ 80 g）不同微波时间药材中，芦丁含量随时间增加先减少后趋于平稳。所以表
35、明，不同微波时间及微波药材重量对山绿茶药材主要成分影响较大 。 4结论 通过本实验研究，结果显示山绿茶药材经过不同炮制方法处理后，特征图谱发生了明显的变化，表明不同炮制工艺使山绿茶主要化学成分发生了显著改变，这些化学成分的变化可能就是山绿茶及其炮制品种发挥不同临床功效的物质基础和机制所在，此实验结果为山绿茶的 炮制及其临床应用提供了一定的理论依据。 参考文献 1 广西壮族自治区卫生厅 .广西中药材标准 S. 1990版 .南宁： 广西科学技术出版社 ,1992,20:137. 2 季宇彬 .中草药有效成分药理与应用 M.哈尔滨 :黑龙江科学技术出版社 ,1995:60. 3 郑学忠 .山绿茶的
36、原植物调查及生物鉴定 J.中草药 ,1984,15(4):27. 4 刘元 ,韦焕英 ,龙杰超 ,等 .山绿茶降压片治疗高血压药效学研究 J. 中国实验方剂学杂志 , 2010, 16(1):86. 5 李萍 ,彭百承 ,李上 球 ,等 .山绿茶醇提物对四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠的降血糖作用 J.中国实验方剂学杂志 ,2010,16(10):137. 6 李萍 ,谢金鲜 ,陈勇 .山绿茶不同炮制品对实验性高脂血症鹌鹑血脂的影响 J.中药材 ,2008,31(11):1627. 7 李萍 ,谢金鲜 ,陈勇 .山绿茶不同炮制品降压作用的实验研究 J.中药材 ,2008,31(9): 1309. 8 张龙 ,郑锡任 ,陈勇 ,等 .山 绿茶茎和叶中挥发油成分 GC-MS比较分析 J. 中国实验方剂学杂志 ， 2013,19(1):70. 8 9 陈勇 ,谢臻 ,刘婧 .HPLC法测定山绿茶不同炮制品中绿原酸和芦丁的含量 J.广西中医药 ,2007,30(5):58. 10 陈勇 ,谢臻 ,李艳苓 .山绿茶不同炮制品中总黄酮的含量测定 J.时珍国医国药 ,2006,17(11):2166. 11陈勇 ,谢臻 ,李立 ,等 .山绿茶药材质量标准的研究 .中华中医药杂志 ,2011,26(7): 1606. 责任编辑 顾雪竹
