1、外源基因在真核细胞中的表达,基因的体外重组和表达体系最早是利用大肠杆菌作为宿主，以后逐渐发展到真核生物细胞作为宿主，如酵母、植物细胞和动物细胞等。以植物细胞作为转化受体，不仅能把一些植物基因或DNA片段作为外源基因转化到受体植物，而且能把动物或微生物中存在的基因转化并整合到植物基因组中，使其在植物细胞中表达。,外源基因在真核生物细胞中的表达，对于分子生物学理论研究，对真核生物基因表达调控的探讨提供了其他试验方法难以达到的有力手段。 外源基因如何才能转入真核细胞？又如何能从数量庞大的细胞群体中筛选出遗传转化的细胞？又是如何对转化的真核生物进行鉴定？,一、选择标记基因和报告基因： 1. 基因转化的
2、选择标记 选择标记一般是一种基因，即选择标记基因，他在转化前与待转化外源基因相连接，当把已转化和未转化的细胞群体置于加有选择剂的（抗生素）的培养基上进行培养时，已转化的细胞群体或再生植株由于带有选择标记基因，该基因的产物-酶能分解培养基中加入的选择剂，因此，转化细胞对选择剂具有抵抗能力，不受选择剂毒害而正常地生长，发育。相反未转化细胞或再生植株受培养基中选择剂的毒害，而不能存活下来而被淘汰。,（1）新霉素磷酸转移酶（氨基葡萄糖苷磷酸转移酶，neomycin phosphotransferase , Npt） Npt 基因表达产生的酶可催化许多氨基葡萄糖苷类抗生素（如新霉素，庆大霉素，卡那霉素和
3、G-418）的O-磷酸化，使抗生素失去对细胞的毒性，这是由于磷酸化的抗生素不能与植物细胞叶绿体和线粒体中的核糖体30S亚基结合，进一步影响70S起始复合体合成，干扰线粒体和叶绿体的蛋白质生物合成，使植物细胞最终死亡，因此，与外源基因结合的Npt基因转化细胞后，就可在含有抗生素的培养基上存活下来。,（2）二氢叶酸还原酶基因（dihydrofolate reductase，Dhfr） 二氢叶酸还原酶为真核细胞核苷酸合成所必需，而氨甲喋呤（mathotrexate，MTX）作为竞争性抑制剂抑制Dhfr酶的活性，当培养基中存在MTX时，则由于植物细胞中不能合成四氢叶酸而抑制生长。 有一种Dhfr的突变
4、酶，它与氨甲喋呤的亲和力较正常酶降低260倍，突变酶不为MTX所抑制，抗MTX，将编码该酶的基因与CaMV35S启动子拼接后导入植物细胞，则转化植物细胞能在含有MTX的培养基上正常生长。相反，未转化植物细胞，其Dhfr对培养基中的MTX十分敏感，而不能存活。,（3）潮霉素磷酸转移酶（hpt） 潮霉素B作为一种抗生素对大多数植物均有毒性，但当潮霉素B被细菌中分离到的潮霉素磷酸转移酶催化而磷酸化时，其毒性丧失。利用这一特性，可以把hpt作为选择标记，即把htp基因和适合植物的强启动子构建成嵌合基因，转化受体植物，转化有htp基因的植物细胞能表达出潮霉素磷酸转移酶，使培养基中的潮霉素B磷酸化而失去毒
5、性，反之，未转化该基因的细胞则被潮霉素毒害致死。 除了以上3种常用的选择标记基因之外，还有庆大霉素抗性基因，链霉素抗性基因等抗生素类选择标记，此后，又发展出非抗生素选择标记，如抗草甘膦类除草剂基因等。,2. 报告基因 报告基因是指用于检测组装的嵌合基因在导入细胞后是否具有功能的一种指示基因，它通常是编码在离体条件下易于检测的酶。 具体是将报告基因连接在待研究的目的基因的启动子的下游，其后再连接真核生物的终止信号，然后将构建的融合基因转化受体细胞，组织，获得转基因植株。在转基因植株生长发育的不同阶段，不同器官和组织乃至细胞，分析其中的报告基因产物-酶活性，从而了解该目的基因在何时、何处表达。 作
6、为报告基因，其表达产物及产物的类似功能在未转化细胞中原本并不存在。,（1）-葡糖醛酸糖苷酶（-glucuronidase gene，Gus） Gus基因是编码-葡糖醛酸糖苷酶的基因，最初为细菌中分离的uid A基因，后被应用于植物细胞转化，Gus基因的广泛应用，一方面是其测定方法简单、灵敏、植物内源背景活性低。另一方面是由于它既可以通过荧光分光光度计进行定量分析，又可以进行组织化学染色定位。 荧光法测定-葡糖醛酸糖苷酶的活性，一般用于测定Gus基因在原生质体中的瞬间表达，或测定Gus基因在稳定完整细胞中的表达。测定时以4-甲基伞形酮葡萄糖苷酸（4-methylumbelliferyl-D-gl
7、ucuronide ）为底物，在Gus酶催化下，生成4-甲基伞形酮和-D-葡萄糖醛酸。当4-甲基伞形酮的羟基解离后可被365nm波长的光激发，从而产生455nm荧光，在荧光分光光度计上进行定量分析。,原位组织化学定位应用于对稳定转化植物进行Gus融合基因时空表达模式的精确分析，方法是用X-gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚-葡糖醛酸，5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-glucuronic acid）作为底物，把待检测材料浸泡在含有底物的缓冲液中保温，在组织、细胞、原生质体被Gus转化的部位，Gus酶切割葡萄糖醛酸部分，产生无色的吲哚氧基中间产物，随后经氧化二聚作用形成5
8、，5-二溴-4，4-二氯靛蓝的蓝色沉淀，经显微镜镜检，观察Gus活性部位，继而了解嵌合基因表达的组织化学定位。 该方法检测要注意排除假阳性存在的可能，有人对52中植物的内源Gus活性进行测定，发现在营养生长阶段没有内源Gus活性，而在繁殖器官如胚、胚乳、果实种子、种皮中均有明显的内源活性，而随着种子萌发又逐渐消失。,（2）氯霉素乙酰转移酶（ chloroamphenicol acetyltransferase，Cat） Cat基因来自细菌转座子Tn9，它编码氯霉素乙酰转移酶，以氯霉素为底物，使氯霉素乙酰化而先后生成3-乙酰氯霉素、1-乙酰氯霉素和1.3-二乙酰氯霉素。乙酰化的氯霉素不再对植物细
9、胞产生毒性，故可作为选择标记。乙酰化反应产物采用薄层层析法分离，放射自显影检测各种乙酰化产物在层析位置的放射强度。,（3）荧光素酶基因（luciferase gene） 多取自萤火虫和细菌细胞。反应底物为荧光素，在ATP和Mg2+存在下，酶促氧化脱羧，生成激活态氧化荧光素发射光子，产生荧光，荧光强弱可以通过荧光计测定，也可作X-光片直接检测。 荧光素+ATP+O2 氧化荧光素+AMP+PPi+CO2+光,（4）绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因 gfp基因是从维多利亚水母中分离纯化的一种可以发出绿色荧光的物质。GFP为238个氨基酸的小蛋白，发色团能
10、吸收可见光而发射荧光，用荧光显微镜可检测到GFP产生的绿色荧光。GFP检测不需要添加任何底物或辅助因子，不使用同位素，不需要测定酶的活性等优点，且在原核和真核生物中都能表达，表达产物对细胞无毒性。,二、植物基因转移技术 植物基因转移也称为遗传转化（genetic transformation），是指利用重组DNA技术，细胞培养技术或种质系统转移技术，将外源基因导入植物细胞或组织，获得转基因植物的技术。,将外源基因成功转入植物细胞中，需要考虑3个方面：如何使外源基因进入细胞？2. 进入植物细胞的基因是整合到基因组中，还是滞留在细胞之中？3. 用于转化的外植体是否能够再生？,植物遗传转化技术是在1
11、974年发现农杆菌Ti质粒的基础上形成的基因转移技术，1983年获得第一例转基因植物。1985年Horsch首创了叶盘法（leaf disc transformation），1987年，康乃尔大学研究者设计出基因枪；1987年，Jefferson等人提出GUS（葡糖苷酸酶）基因融合系统，作为报告基因。,目前已发展出多种遗传转化方法，包括物理方法、化学方法以及生物学方法。其中以农杆菌介导的遗传转化应用最广泛，占约80。 转化的目的基因包括各种抗病、抗虫、抗除草剂、延迟保鲜、改变花色花型、改良品质以及疫苗等基因。,转化方法可以划分为直接基因转移和间接基因转移。（一）直接基因转移： 采用物理或化学的
12、方法将外源目的基因转移到植物细胞，并整合到染色体DNA上的技术。包括电激法、基因枪法、超声波法、真空渗入法、PEG法、磷酸共沉淀法、微注射法、脂质体介导法等。,1、电激法：利用高压电脉冲把外源基因导入植物细胞实现转化的方法。 1985年由斯坦福大学Fromm M等最先将CAT基因通过电激法导入胡萝卜、烟草、玉米的原生质体，测得瞬间表达。随后康乃尔大学将外源基因导入原生质体实现稳定表达。 转化率随质粒DNA浓度、电脉冲强度以及持续时间增加而增加。,2、基因枪法（particle bombardment） ：是利用高速微弹粒将外源遗传物质导入细胞或组织中的方法，也称为微弹射击法、粒子轰击法等。 最
13、早由Klein TM在1987年创立，并将烟草花叶病毒RNA和CAT基因(Chloraphericol acetyltransferase氯霉素乙酰转移酶基因)导入洋葱表皮细胞。 系统将带有包裹有目的基因的金属颗粒（金粒或钨粒），以很高的速度轰击植物细胞，由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而实现稳定转化的目的。,基因枪由激发器、枪管、挡板和无菌小室等组成。将一定量的带有目的基因的质粒DNA，CaCl2、亚精胺与钨粒一起离心或振荡，可将目的基因吸附于钨粒，通过基因枪把钨粒以430米/秒的速度轰击目标，使目的基因穿过细胞壁和细胞膜进入受体细胞。,3、超声波法： 根据超声波
14、的空化作用，把外源基因导入受体细胞。1990年许宁等把GUS基因通过该方法导入了小麦幼穗愈伤组织。,4、聚乙二醇法（PEG）： PEG（polyethylene）具有细胞粘合作用和扰乱细胞膜的磷脂双分子层的作用。1980年由Darey最早利用该方法将外源基因转入原生质体。 1985年以后利用该方法将报告基因转入种植物原生质体，获得瞬间表达或稳定表达。 PEG法转化率低，一般在10-5-10-6。,5、脂质体转化法： 利用磷酸碱或磷酸丝氨酸等脂质构成的双层膜囊，可以包裹质粒，DNA大分子、病毒颗粒等，通过脂质体与原生质体融合将外源基因转入原生质体细胞，或通过注射法实现转化。6、真空渗入法： 利用
15、真空作用使外源基因进入植物体，细胞并实现DNA的整合。,7、显微注射法： 利用显微装置将质粒DNA注射入宿主细胞的方法。利用极细(1m)的玻璃毛细管装入待转移的外源DNA，然后在显微镜下直接将毛细管插入原生质体等细胞，并注射DNA。,（二）间接基因转移： 某些病原生物（农杆菌、病毒等）能够通过感染宿主细胞，将病原生物DNA整合到宿主细胞基因组中，因此改造病原DNA，利用其侵染能力，能将外源基因导入植物或动物细胞，产生转基因植物。 以农杆菌或病毒为载体的基因转移过程称为间接基因转移。,1、农杆菌介导的基因转移：（1）Ti质粒： 革兰氏阴性农杆菌（Agrobacterium Tumefaciens
16、）中存在的一种质粒DNA。具有一段TDNA能够将外源基因转入植物染色体DNA中并实现整合。,Ti质粒约200Kb，一半序列参与质粒复制、冠瘿碱代谢和接合作用；对致瘤不起作用，另一半序列包括TDNA区和毒性区（Vir region）。 TDNA：章鱼碱型农杆菌Ti质粒TDNA由两部分组成，一部分与致瘤有关，称为左转移DNA（TLDNA），另一部分与致瘤无关，称为右转移DNA（TRDNA）。 TLDNA含有编码合成激素类和冠瘿碱类的基因，由于激素基因在植物细胞内的表达，产生了过量的生长素和细胞分裂素，破坏了内源激素平衡，而导致植物细胞发生癌变。,Vir区：是TDNA以外涉及诱发肿瘤的区域，在Ti质
17、粒的物理图上位于TDNA左侧，长3040Kb，Vir区并不整合入植物基因，但却是TDNA转移所必需。TDNA边界序列：TDNA长约23Kb，但在其两端边界各有一个25bp的正向重复序列，高度保守，一般认为右端重复序列对TDNA转移起重要作用。,农杆菌转化植物细胞的机理：（1）农杆菌对植物伤口的附着； 植物伤口释放出信号分子。如乙酰丁香酮（AS）以及羟基乙酰丁香酮（OHAS）等。,（2）Vir区基因表达的诱导； VirA以及VirG基因在酚类物质的诱导下得到表达。（3）TDNA中间体和T链蛋白复合体的形成； VirD1和VirD2蛋白表达与TDNA边界重复序列结合解缠绕与切割，VirC1和Vir
18、C2参与下，形成TDNA转移中间体。并以DNA蛋白质复合体形式存在和转移。VirE1和VirE2参与该过程。,（4）T链蛋白复合体转移至植物细胞； T链蛋白复合体（T链、VirD2、VirE2）在VirB基因表达产物作用下，穿越细胞膜，VirB操纵子具有11个基因，产物定位于细胞膜上并形成一种膜结合T复合体运输器，其中VirD2和VirE2蛋白分别具有导航和核定位作用。VirD2、VirE2以及VirF蛋白进入植物细胞。（5）TDNA拷贝与植物基因组的整合。 T链蛋白复合体转移到细胞后，通过核膜上的小孔进入细胞核，与核DNA整合。整合机制尚不清楚。,Agrobacteria attach to
19、 plant cell surfaces at wound sites. The plant releases wound signal compounds, such as acetosyringone. The signal binds to virA on the Agrobacterium membrane. VirA with signal bound activates virG. Activated virG turns on other vir genes, including vir D and E. vir D cuts at a specific site in the
20、Ti plasmid (tumor-inducing), the left border. The left border and a similar sequence, the right border, delineate the T-DNA, the DNA that will be transferred from the bacterium to the plant cell Single stranded T-DNA is bound by vir E product as the DNA unwinds from the vir D cut site. Binding and u
21、nwinding stop at the right border. The T-DNA is transferred to the plant cell, where it integrates in nuclear DNA. T-DNA codes for proteins that produce hormones and opines. Hormones encourage growth of the transformed plant tissue. Opines feed bacteria a carbon and nitrogen source.,农杆菌Ti质粒载体系统： 组成重
22、组质粒，含有边界序列，能够在大肠杆菌和农杆菌中穿梭；含有完整的Vir基因。（1）共整合载体系统：Ti质粒上编码致瘤基因的序列被一段pBR322DNA所取代，带有外源基因的pBR322衍生中间载体由大肠杆菌转入农杆菌后，发生同源重组，外源基因整合到Ti质粒上。（2）二元载体系统：一个农杆菌株系中含有两个彼此分离的质粒，一个含有TDNA和外源重组基因的多功能克隆载体质粒。既能在农杆菌中复制，并能够从大肠杆菌迁移到农杆菌，另一个质粒含有Vir基因的Ti衍生质粒。,如何将以上构建的质粒转入农杆菌？1. 直接用纯化的小Ti质粒转化含有vir区质粒的根癌农杆菌感受态细胞；2. 采用三亲杂交的方法。把三种有
23、关菌株混合培养在一起进行的杂交称为三亲杂交。,（2）Ri质粒： 一种能够诱导植物细胞产生毛发状根的土壤杆菌（Agrobacterium rhizogenes），具有Ri质粒，能够将外源基因转入植物细胞中。 其TDNA包括TLDNA和TRDNA和中间大约15Kb的核心DNA，在TRDNA上具有两个非常重要的基因，tms1和tms2，指导IAA合成，TRDNA上还有编码农杆碱合成和甘露碱合成的基因。,2、病毒载体介导的基因转移：,病毒侵染细胞后把DNA导入寄主细胞，这些病毒能在寄主细胞借助寄主的遗传系统进行复制和表达，该过程与农杆菌Ti质粒类似，也是一种潜在的基因转化系统。 病毒作为基因转化载体，
24、已应用与微生物和动物转基因领域，然而在植物基因转移研究中仍处于初级阶段。主要原因是大多数植物病毒是以RNA为遗传物质，对于RNA操作并没有DNA不成熟。因此载体构建较困难。此外，未发现像动物细胞反转录病毒那样能够整合到宿主基因组中的植物病毒。因此，外源基因只能以游离拷贝的形式存在与细胞中，不能整合到植物染色体上进行稳定遗传和表达。 20世纪80年代，花椰菜花叶病毒(CaMV) 双链DNA基因组及其后RNA和单链DNA病毒基因组被用来构建植物基因工程载体。,植物病毒载体系统（1）单链RNA植物病毒载体系统 单链RNA反转录合成双链cDNA克隆到质粒上，把外源基因插入病毒的cDNA，通过体外转录，
25、带有外源基因的病毒DNA感染进入植物宿主细胞。（2）单链DNA植物表达载体系统 由单链DNA分子组成，存在成对的病毒颗粒，即双生病毒，可以把外源基因插入其中一种DNA。（3）双链DNA植物病毒载体系统 将病毒基因组中非必需的核苷酸序列去掉，换上一段外源DNA而不影响病毒基因组的包装，用这种病毒载体感染植物细胞实现外源基因的转移。如花椰菜花叶病毒（CaMV），番茄金花叶病毒（TGMV）。,病毒表达载体构建策略,植物病毒表达载体：（1）置换型载体：外源基因置换植物病毒基因组复制影响不大的基因（2）插入型载体：外源基因插入病毒基因组不重要的编码区（3）互补型载体：外源基因插入缺陷性病毒或置换某个基因
26、。（4）表位展示型载体：通过在外壳蛋白基因中选择性地插入外源基因，在不影响病毒组装，侵染和复制的前提下，使其在病毒颗粒表面呈现，成为抗原决定簇（外源蛋白）植物病毒表达载体应用存在的问题：（1）外源基因在转化植物中的稳定性差：不能整合（2）病毒的致病性；诱发病毒病症状（3）植物病毒载体携带的外源基因和病毒载体本身的不稳定。外源基因易丢失，病毒基因组易突变。,（三）农杆菌转化基本程序： 1.农杆菌的培养、纯化保存及工程菌液的制备；28培养至对数期 2. 外植体的选择；幼嫩叶片、子叶、下胚轴等 3. 外植体预培养、接种； 4. 农杆菌侵染；OD600为0.5-0.7 5. 农杆菌与外植体共培养； 共
27、培养时间在16h以上，1-3d，农杆菌增殖适度，加入AS等酚类物质。 6. 外植体脱菌及选择培养。 通过抗生素杀死或抑制农杆菌后进行抗生素选择。,叶圆片法： 利用打孔器取得叶圆片或用刀切割叶片小块，造成伤口，然后在伤口处侵入农杆菌，去除多余菌液，置于适合的培养基表面培养一段时间（2-3d），再转移至含有抗生素的选择培养基上进行选择并杀菌，转化的细胞逐渐形成愈伤组织，再分化出不定芽，进一步形成完整转化植株。（1）植物材料与农杆菌的培养；（2）共培养；（3）筛选转化植株；抗生素筛选（4）转化植株的分子杂交鉴定；PCR扩增，South杂交，North杂交，Western杂交，酶活性分析等。（5）性状
28、鉴定：抗逆性，生长发育特征整株感染 活体接种或受伤部位侵染，然后切下培养和筛选。原生质体与农杆菌共培养 处于再生壁阶段的原生质体与农杆菌共培养36-48h，离心洗涤后培养在含抗生素的培养基上筛选。,番茄遗传转化操作过程,番茄遗传转化操作过程,四、转基因植株的鉴定分子检测（1）Southern杂交，PCR检测：在DNA水平进行检测（2）Northern杂交与RT-PCR检测：RNA水平进行检测， 还可以通过实时荧光定量PCR（real time quantitative fluorescent PCR）进行检测。（3）Western杂交：蛋白质水平进行检测。通过抗原抗体的特异反应检测基因表达产物
29、。（4）生物芯片技术检测：将不同被检样品的mRNA分别用不同荧光物质标记，各种探针等量混合与同一阵列杂交，分析杂交信号，即可明确外源基因表达强弱差异。,2. 转基因植株的目的性状检测 （1）生理生化指标检测转基因植株的目标性状； 抗逆相关基因转移可以检测抗氧化酶等活性。 （2）生物学鉴定法：通过表型进行鉴定，如形态特征及抗逆表现等。3. 转基因植株的遗传稳定性分析 外源基因在当代可以检测到，还需要再下一代，甚至几代能够检测到，才具有遗传稳定性。通常转化二代中具有有1/4比例的纯合体。,五、外源基因转化在基因表达调控中的应用 1、植物基因启动子研究 启动子对基因表达十分关键，是决定性的，不同的基
30、因均需要在5上游区具有相应的启动子才能表达。 启动子分为3类：（1）组成型启动子：这类启动子调控的下游基因始终维持在一定水平。（2）组织特异性或器官特异性启动子：调控下游基因在特定的组织、器官或特殊发育阶段表达。（3）诱导性启动子：受环境条件刺激，而促进下游基因的表达。光诱导启动子，热激蛋白启动子等。,为分析启动子序列或基因表达而进行的基因构建,2、目的基因的瞬间表达（transient expression）和稳定表达（stable expression） 瞬间表达是指导入外源基因后在短时间内就能检测到表达产物，但几天后表达水平逐渐减低，直至消失的外源基因表达方式。主要是由于外源基因未整合到
31、染色体上，而以游离转存在。可以用于研究启动子、增强子等在基因表达中的功能等。 稳定表达是指转基因植物能够稳定表达外源基因活性并能传递给后代。农杆菌Ti质粒转化容易获得稳定表达的转化植株。,3、反义RNA及其在基因表达调控中的作用； 在转基因研究中，除了试图获得外源基因表达外，有时转化外源基因的目的是阻遏转基因植物中特殊基因的表达，通过逆向遗传学途径确定基因的功能。 通过基因导入，去除一些产生毒物的基因，一些蛋白质及控制生长发育等。 使单个基因失活可以采用不同方法，如将外源基因插入其转录序列或启动子序列，类似于转座子插入失活一样。原核生物中存在一种天然的RNA，能够和mRNA互补，抑制mRNA的功能。称为反义RNA。首次启发，通过人工导入反义RNA来调控某些基因的表达。 通过人工导入反义RNA，定向控制某些生物性状的方法，成为反义技术。 如PG（多聚半乳糖醛酸酶）基因，反义查尔酮合成酶基因（CHS），ACC合成酶等。,正义和反义RNA构建,反义查尔酮合成酶基因导入矮牵牛,20141119,
