1、 白花蛇舌草中总三萜酸的提取纯化工艺 蒙瑞波 1，汤庆发 1，曾永长 2， 郭阳 1，傅钧庭 1，范昊宁 1， 罗佳波 * （ 1. 南方医科大学中药新药实验室 广东省中药制剂重点实验室 ，广州 510515； 2.扬子江药业集团广州海瑞药业 ， 广州 510633） 摘要 目的 : 优选白花蛇舌草中总三萜酸的提取纯化工艺 .方法 :以总三萜酸提取率为指标 ,利用正交实验法考察最佳提取工艺；以静态吸附和解析 实验筛选树脂型号，考察动态吸附与解析最佳条件 .结果 :最佳提取工艺为 : 70%乙醇 10倍量 回 1流提取 1.5 h。 AB-8 型大孔树脂 最佳 纯化 工艺为上样流速 2 BV h
2、-1，上样液 pH 值 5，上样浓度 0.25 mg mL-1，洗脱剂 pH值 7， 洗脱 乙醇浓度 80 ， 洗脱速度 2BV h-1。 结论：该工艺操作简单、稳定可行，重复性好， 适合 白花蛇舌草 总 三萜酸的提取 纯化。 关键词 白花蛇舌草；三萜酸；正交设计；提取纯化 The extraction and purification process of total triterpene acids in Hedyotis Diffusa Willd MENG Rui-bo1,TANG Qing-fa1,ZENG Yong-chang2 ,GUO Yang1,FU Jun-ting1, F
3、AN Hao-ning1,LUO Jia-bo* （ 1. Southen university key Lab of TCM and new drug ； Guangdong provincial key Lab of TCM， Guangzhou 510515； 2. Yangtze River Pharmaceutical Group Guangzhou Harris pharmaceutical CO.LTD， Guangzhou 510633) Abstract Objective: To optimize of extraction and purification process
4、 of triterpene acids in Hedyotis Diffusa Willd.Methods: To investigate the optimum extraction process by Triterpenoid acid extraction rate ; Screening resin model by static adsorption and parsing experiments,To investigate the optimal elution conditions by dynamic adsorption and resolution experimen
5、ts.Results: The optimum extraction process was reflux extraction with 10- fold 70 % alcohol for 1.5h. The optimum purification process of AB-8 macroporous resin was sampling flow rate 2BVh-1,pH=5, concentration 0.25 mg.mL-1,and the concentration of elution was 80 alcohol,eluting velocity2 BVh-1， wit
6、h pH =7.Conclusion: The technology is simple,stable with good reproduciblity,which is suitable for extraction and purification of total HD triterpene acid. Keywords Hedyotis Diffusa Willd; Triterpenes acid; Orthogonal experiment； Extraction and purification 白花蛇舌草为茜草科耳草属植物白花蛇舌草 (Hedyotis diffusa Will
7、d ， HD.)的全草，具有清热解毒、第一作者 蒙瑞波，中药师，南方医科大学在读硕士研究生，主要从事中药新制剂开发研究，联系电话： 15521285030，邮箱： 通讯作者 罗佳波，教授，博士生导师，国家杰出贡献中青年专家，主要从事中药复方与新制剂开发研究。联系电话： 020-61648266，邮箱： 利尿消肿、活血止痛之功。现代研究表明白花蛇舌草具有增强非特异性免疫及抗氧化作用 ,临床用于治疗各种癌症及炎症 1,2，且对多种耐药肿瘤细胞有效 3。本课题组对 HD提取物抗肿瘤有效部位筛选研究 并进行成分分析 ，结合文献总结 4， 认为 有机酸 类成分 是 HD抗肿瘤 活性 成分 之一。而关于
8、HD 中有机酸的提取纯化研究至今未见报道。 本文利用正交实验和大孔树脂对 HD中三萜酸的提取纯化条件进行初步考察，为下一步研究提供参考 。 1 仪器与材料 UV-HP8453紫外 -可见光分度仪（美国惠普）， CP2250 微量电子天平；回流提取装置；移液管；水浴锅(上海精宏实验仪器有限公司，型号 DK-S26)；白花蛇舌草（ HD）（购自广东省药材公司，批号： 20110101），经南方医科大学中药鉴定室张宏伟教授鉴定为 茜草科耳草属植物白花蛇舌草 (Hedyotis diffusa Willd)；齐墩果酸对照品（购自中国药品生物制品检定所，批号： 110709-200505）；香草醛（ 上
9、海易利生物科技有限公司，批号 20070403）；大孔树脂 HPD-862、 AB-8、 D101 均由广州东巨试剂公司提供；乙醇、氢氧化钠、盐酸、石油醚、乙酸乙酯、冰醋酸、高氯酸等均为分析纯。 2 方法和结果 2.1 总三萜酸含量测定方法的建立 5 采用 香草醛 -冰乙酸 -高氯酸比色法，紫外 -可见光分度计中检测 550 nm处有最大吸收，计算三萜类有机酸含量。 2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的齐墩果酸对照品适量 ,置 10 mL 容量瓶中 ,加甲醇溶解并定容 ,得 浓度为 0.2360 mg.mL-1的齐墩果酸溶液 作为对照品溶液。 2.1.2 供试品溶液的制备 6 取
10、 HD 粗粉 20 g，加入规定量规定浓度的乙醇，回流提取规定时间，趁热滤过，滤液浓缩至无醇味，放冷，用氢氧化钠溶液调 pH 至 1213，石油醚萃取至醚层近无色，取水层，用盐酸溶液调 pH 至 23，用乙酸乙酯萃取至乙酸乙酯层无色，取乙酸乙酯层，水浴蒸干，放冷后用无水甲醇溶解并定容于 100 mL容量瓶中，作为供 试品溶液。 2.1.3 标准曲线的制备 精密吸取对照品溶液 0.0、 0.1、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0 mL,分别置 10 mL 容量瓶中 ,70 水浴蒸干，精密加入 5%的香草醛 冰醋酸溶液 0.2 ml，高氯酸 0.8 mL,置 70水浴中反应 15 m
11、in，取出，置冰水中冷却 5 min，后加冰醋酸 5 mL， 摇匀，静置 5 min,置紫外分光光度计中全波长扫描 ,在 550 nm 处均有最大吸收。以 550 nm 处得的吸光度 A 对齐墩果酸含量 m（ g）回归 ,以吸光度为横坐标、含量为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方 程为 m=37.77A 0.818（ r=0.9998）。 在 3.6875 g 36.875 g的范围内，吸光度与齐墩果酸含量有良好的线性关系。 表 1 标准曲线制备数据 含 量（ g） 3.6875 7.375 22.125 29.5 36.875 吸光度（ A） 0.11314 0.22565 0.59997 0
12、.81198 0.99365 2.2 正交实验设计 分别单因素考察了醇浓度，醇用量 ，回流时间，提取次数对提取率的影响，结果发现提取次数对提取率影响不大，故选择醇浓度，醇用量及回流时间作为考察因素。按 L9（ 34）正交表安排试验，以醇浓度（ A） ,醇用量（ B），提取时间（ D）为三个因素，每个因素取三个水平。见表 2。 表 2 实验因素水平表 因素 水平 醇浓度（ %） （ A） 醇用量（倍） （ B） 空白项 （ C） 提取时间（ h） （ D） 1 55 10 1 2 75 12 1.5 3 85 14 2 2.2.1 实验方法与结果 精密称取 HD粗粉 9份各 20 g，按正交表安
13、排实验，提取液经 2.1.2法处理后，按 2.1.3 法进行含量测定。实验安排及测定结果如表 3。 表 3 正交实验设计与结果 试验号 A B C D 提取率（ mg.g-1） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 K2 K3 R 1 1 1 1 1.1576 1 2 2 2 1.2761 1 3 3 3 1.5493 2 1 3 2 2.4986 2 3 2 1 2.1766 2 2 1 3 2.2033 3 1 2 3 2.1576 3 2 3 1 1.7657 3 3 1 2 2.4429 3.983 5.8138 5.9038 5.0999 6.8785 5.2451 5.6103
14、 6.2176 6.4662 6.2688 5.8136 5.9102 2.8955 1.0237 0.2935 1.1177 表 4 正交实验方差分析 方差来源 离均差平方和 自由度 均方 F 值 P 值 A B D 误差 C 1.592 0.145 0.222 0.009 2 2 2 2 0.796 0.072 0.111 0.004 181.643 16.517 25.363 0.005 0.057 0.038 由表 3分析可知 ,RARDRB,各因素对三萜酸提取率影响的主次程度为醇浓度 提取时间 醇用量 ,最佳提取工艺为 A2D2B3。由表 4方差分析可知，醇浓度和提取时间对提取率的影
15、响具有显著性，而醇用量对提取率的影响没有显著 性。考察了工艺 A2D2B3与 A2D2B1的三萜类有机酸提取率，前者为 2.5892 mg.g-1，后者为 2.5388 mg.g-1，两种工艺的提取率差异较小。 从生产成本的考虑将 B3改为 B1， 由此确定 最佳工艺为 A2D2B1，即 药材加 10倍量 70%乙醇回流提取 1.5 h. 为考察上述优选提取工艺的稳定性，按上述优选提取条件进行验证实验 ， 测定三萜酸含量 (见表 5)。结果表明： 该工艺具有良好的可行性及稳定性。 表 5 验证实验结果 编号 有机酸提取率（ mg.g-1） RSD(%) 1 2 3 2.5268 2.5255
16、2.6236 2.2168 2.3 大孔树脂纯化条件优选 2.3.1 上样液的制备 同 2.1.2 2.3.2 大孔吸附树脂的预处理 将 HPD-826, AB-8， D101三种树脂依次用 4倍体积 5 NaOH水溶液浸泡 24 h，去离子水洗至中性， 4倍体积 5盐酸液浸泡 24 h，去离子水冲洗至中性，乙醇浸泡 24 h，用 95乙醇洗脱，至流出乙醇液与水混合不产生白色浑浊为止，用足量去离子水洗至无醇味，备用。 2.3.3 大孔树脂的筛选 静态吸附 准确称量 3种处理好的树脂适量（相 当于 1g干树脂），置戴塞锥形瓶中，加入已知浓度的 HD粗提液 50 mL，摇床振摇 24 h，过滤并测
17、定滤液中三萜酸总量，计算各树脂对 HD三萜酸的吸附率。 静态解吸附 取静态吸附后的树脂，加 95乙醇 100 mL，置摇床上震摇 24 h后，过滤并测定滤液中三萜酸总量，计算各树脂对 HD三萜酸的解吸率。 计算公式： （ 1）每克吸附量 =(C0*V0-C1*V1) /W （ 2）吸附率 =(C0*V0-C1*V1)/ C0*V0 100% （ 3）解吸率 P=C2*V2/(C0*V0-C1*V1) 100% 式中 C0：上样质量 浓度 (mg.mL-1)； C1：吸附后剩余液的浓度 (mg.mL-1)； C2为解吸液的浓度； V0：上样的体积(mL)； V1：吸附后剩余溶液体积 (mL)；
18、V2为解吸液体积 (mL)； W：树脂质量（ g）。 2.3.4 大孔树脂静态吸附曲线绘制 通过静态吸附与解吸附试验筛选出效能最好的树脂作为纯化 HD三萜酸的树脂。准确称取经过预处理的该树脂 (湿 )5.0 g，置于 100 mL三角瓶中，加样品液 40 mL，摇床震摇，以药液与树脂接触时间为 0 h，分别于 0,1,2,3,4,5 h取样，测定各时间点药液中三萜酸含量，以三 萜酸浓度为纵坐标，时间为横坐标，绘制静态吸附动力学曲线。 2.3.5 大孔树脂柱层析纯化三萜酸的工艺参数考察 通过筛选实验，确定分离 HD三萜酸的树脂，准确称取等份经过预处理的理想树脂 ,每份 (湿 )5.0 g，分别湿
19、法装入（ 1 cm 40 cm）具阀层析柱中，考察上样液流速 、浓度 、 pH值，洗脱剂体积分数，洗脱剂 pH值等参数对纯化 HD总三萜酸的影响，优化工艺。 2.3.6 纯度计算 纯度 ( )=C V M l00式中 C为纯化后三萜酸浓度 (mg.mL-1)， V 为三萜酸溶液体积(mL)， M为三萜酸物 质干重 (mg)。 2.4 结果与分析 2.4.1 大孔树脂的筛选 在筛选的树脂中， HPD-826为新型氢键吸附型树脂， AB-8、 D101为非极性树脂。由表 6可知， AB-8对 HD总三萜酸的分离较理想，故选择 AB-8对 HD总三萜酸进行分离纯化。 表 6 不同型号大孔树脂对 HD
20、总三萜酸吸附性性能的比较 2.4.2 AB-8静态吸附曲线绘制 AB-8对 HD三萜酸的吸附率和解析率均较高，因此，进一步考察 AB-8对 HD三萜酸静态吸附动力学行为。由图 1可知， AB-8树脂对 HD三萜酸的吸附在 3 h时基本达到平衡，表现出良好的静态吸附动力学特性 ,适用于 HD三萜酸的纯化。 图 1 AB-8树脂对 HD总三萜酸静态吸附曲线 2.4.3 上样浓度的优化 上样液的浓度对大孔树脂的吸附有一定影响，量取已知总三萜酸浓度的 HD提取液，分别用去离子水配置成不同浓度上样溶液，以相同的速度通过层析柱 (树脂体积 30 mL)进行动态吸附实验，测定吸附率。由图 2可知，上样浓度越
21、大，吸附率就越低，上样浓度为 0.24 mg.mL-1 时吸附率最高。 图 2 上样浓度对吸附率的影响 2.4.3 上样流速的优化 上样流速是影响吸附的一个重要因素，以 0.5 BV h-1， 1 BV h-1， 2 BV h-1， 3 BV h-1，4 BV h-1不同流速上样，测定吸附率，结果见图 3。流速越小吸附越充分，但上样周期延长。综合考虑时耗，树脂型号 吸附量（ mg.g-1） 吸附率（ %） 解析率（ %） D101 6.12 50.60 50.09 HPD-826 6.53 62.66 45.81 AB-8 7.45 77.23 70.07 吸附率，控制上样流速为 2 BV h
22、-1较适宜。 图 3 上样流速对吸附率的影响 2.4.4 上样液 pH值的优化 酸碱度可直接影响三萜酸的存在形式，进而影响吸附效果。将浓度相同的上样液调 pH值分别为 4， 5， 6， 7， 8，以 2 BV h-1流速上样，用相应 pH值的去离子水淋洗柱子 ，测定吸附率。结果见图 4：随 pH值减少，吸附率越大，当 pH为 4时，解吸液中三萜酸含量最高； pH值 7，吸附量急剧下降。这可能与被分离成份的酸碱度有关， HD提取物为弱酸性（ pH 6.0）。综合考虑酸液对化学成分、树脂使用寿命、吸附效率的影响，确定最佳吸附 pH值为 5。 图 4 上样液 PH对吸附率的影响 2.4.5 AB-8
23、树脂动态解吸附参数优化 2.4.5.1 洗脱乙醇 浓度优化 不同浓度乙醇对总三萜酸的洗脱能力不同，由图 5可知，当乙醇浓度小于 80%，随浓度加大，解吸率加大；浓度为 80%及以上时，解吸率最高且变化不大。综合考虑成本、解吸率等因素，乙醇浓度以 80%为宜。 图 5 洗脱乙醇浓度对洗脱率的影响 2.4.5.2 洗脱液酸碱度优化 根据 2.4.5.1优选的结果，以 80%乙醇为洗脱液，调 pH值为 5、 6、 7、 8、 9，测定解吸率。结果见图 6，解吸 附率随洗脱液 pH 值的增加而增加，当 pH 等于 7时，解吸率最大且，是最佳洗脱液 pH 值。 图 6 洗脱液 PH对洗脱率的影响 2.4
24、.5.3 洗脱流速的优化 将样品按优化了的吸附条件上柱吸附，淋洗，以 pH 为 7 的 80%乙醇分别以 1 BV h-1， 2 BV h-1， 3 BV h-1， 4 BV h-1， 5 BV h-1流速洗脱，每 1BV收集一次，以 氯仿 -浓硫酸反应（ Salkowski反应）判断终点， 计算洗脱液的用量，结果见图 7：洗脱流速越快所用洗脱液的量就 越大，当流速为 2 BV h-1，用 5 个柱体积即可洗脱完全，流速为 5 BV h-1时需 13 个柱体积。综合考虑解吸效率和成本等因素，洗脱速度以 2 BV h-1为宜。 图 7 洗脱流速与洗脱液用量的影响 2.5 工艺验证及放大实验 准确
25、称量干燥白花蛇舌草粗粉 500.0 g，以 10倍量 70%乙醇回流提取 1.5 h，过滤，滤液减压回收乙醇，按 2.3.1 法制备上样液，按照优化的工艺，通过 2000 g AB-8 大柱（ 6 cm 120 cm）进行纯化，按 2.1.3测 HD提取物纯化前后总三萜酸的吸光值。纯化前总三萜酸纯度 5.96，纯化后总三萜酸纯度达到 21.83（ n=3， RSD= 2.1%）。工艺稳定可行，纯化后总三萜酸纯度提高近 4倍。 3 讨论 关于 白花蛇舌草中三萜酸提取纯化工艺研究至今未见报道，本课题组进行了该方向的首次研究 。实验结果表明， HD中总三萜酸的最佳提取条件为：使用体积分数 70%乙醇
26、 10倍量 回流提取 1.5h；最佳 纯化条件为，以 AB-8大孔树脂配制上样液浓度 0.25mg.mL-1，调节 PH为 5以 2 BV h-1流 速上样， 80%乙醇调节 PH至7， 2 BV h-1 的洗脱速度洗脱。纯化后总三萜酸纯度可达约 22%，工艺稳定可行，为进一步研究提供参考。 研究发现白花蛇舌草中有机酸类含量较少，过柱前对 HD提取物进行酸碱萃取处理，可有效除掉大部分非酸性成分，使目标成分纯度升高近 3倍，但同时发现损失率维持在 30%-40%，而萃取过程使用石油醚及乙酸乙酯等有机试剂，速度缓慢，且萃取不完全，有无更合理有效的前处理方法，值得探讨。 实验过程发现上样液和洗脱剂的
27、 PH 值是影响吸附和解析的重要因素。以酸性 PH 上样，中性或碱性 洗脱剂洗脱，才能达到良好分离效果。推测可能与 PH 对三萜酸类存在状态影响较大有关，继而推测 AB-8 型大孔树脂对分子形式的化合物吸附作用强于离子形式，而洗脱能力正好相反。 实验过程尝试了强碱性阴离子交换树脂进行分离研究，结果发现离子交换树脂分离效果不理想，可能与白花蛇舌草中有机酸存在形式及酸性较弱有关。本实验结果表明，利用 AB-8型大孔树脂能有效纯化白花蛇舌草中三萜酸类成分，工艺操作简单，稳定可行，经济合理，可在工业生产中尝试应用。 参考文献 1 Qing FH,Xie SS,Zhang WR,et al.The en
28、hancing effect of Hedyotis diffusa Willd. On Immunological function of miceJ. Shanghai J Immun(上海免疫学杂 ),1990,10:321-323. 2 Yu X, Du Z J Chen YQ. Studies on antioxidation effect from Oldenlandia diffusa WilldJ.Food Ferment Indus(食品与发酵工业 ),2002,28(3):10. 3 于春艳 ,李薇 ,刘玉和 ,等白花蛇舌草体外对人肝癌多药耐药细胞 Bel-7402 抗肿瘤活性的研究 J北京大学学报（自然科学版）， 2004， 5（ 3）： 221-223 4 陈康永 .白花蛇舌草的化学成分研究进展 J.中国实验方剂学， 2011,17（ 17）： 290-293 5 张雁冰，王克让，刘宏民 .马桑叶中总三萜酸的含量测定 J.时珍国医国药， 2006,17（ 4）： 529 530 6 曾永长，梁少瑜，邢学峰，等 .白花蛇舌草总黄酮的大孔树脂纯化工艺 J.中国实验方剂学， 2010,16（ 18）： 26-29
