1、重要生物药物制造工艺,E-mail： Tel：3831677,发酵工程教研室 郭伟云,第 三 篇,1,2,3,本门课程由以下三大部分内容组成,4,生物药物的类别,（一）天然生物药物 1.微生物药物 microbial medicine 2.天然生化药物 Biochemical medicine 3. 海洋生物药物 marine medicine,（二）生物技术药物（新生物制品） 1.DNA重组药物（DNA recombinant medicine）基因工程与蛋白质工程药物 2. 基因药物,（三）合成或半合成生物药物,5,1.迅速被体内酶降解2.肾小球过滤清除3.抗原抗体反应4.溶解度差导致沉淀
2、,蛋白质药物在使用中出现的问题,体外聚乙二醇修饰（PEG化）,(1)增大药物分子量，避免被肾小球过滤(2)阻碍蛋白酶的降解作用(3)屏蔽药物的免疫位点(4)增加药物在体液中的溶解度(5)与药物间的化学键在体内随时间水解，缓慢释放药物,+,蛋白或多肽,偶联物,聚乙二醇,CH3(-O-CH-CH)n-OH,修饰粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）延长半衰期修饰人肿瘤坏死因子消除副作用修饰白介素I受体拮抗剂（rhIL-1Ra） 延长半衰期修饰牛胰核糖核酸酶（RNase）提高抗肿瘤活性修饰超氧化物歧化酶（SOD）提高半衰期修饰天冬酰氨酶（Aspartase） 克服免疫原性提高半衰期修饰人干扰素（IFN
3、）提高半衰期修饰血红蛋白（Hb）血液代用品修饰胰岛素提高半衰期,我国在PEG修饰蛋白质方面的一些工作,生化药物制造工艺,第 十 三 章,9,生化药物的定义、分类、特点,定义：具体运用生物化学研究方法，从生物体中经提取、分离、纯化等手段获得的天然存在的生化活性物质或将上述这些物质加以结构改造或人工合成创造出的自然界没有的新的活性物质，通称生化药物（Biochemical medicine）。,10,重点,分 类,11,维生素类药物,生化药物的特性,1药理学特性：,药理活性高，针对性强,毒副作用少，营养价值高,生理副作用常有发生免疫原反应，过敏反应,12,生化药物的特性,2理化特性：,13,3天然
4、生物药物是新型药物的先导物,通过合理的药物设计，可以创造出疗效更高，作用更专一，更易为机体接受，副作用与不良反应更小的新药。,14,有机溶剂分级分离、等电点沉淀等-粗提物。,离子交换层析、凝胶层析、超滤等技术-提高了产品的纯度和收率,多种层析技术、超速离心等-高纯度的生化药物,15,生化药物的资源,植 物,动 物,动物脏器血液、分泌物及其它代谢物,微 生 物,海 洋 生 物,16,主要从以下脏器中制取生化药物,17,毒蜥,Exendin-4是自毒蜥唾液中提取的一种多肽，研究发现该多肽与人体内的GLP-1在序列上有53的同源性，同GLP-1一样具有促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌及保护胰岛细胞
5、等作用。2005年经FDA批准用于二型糖尿病的治疗。Exenatide是Exendin-4的人工合成品。,Exenatide,18,麻省Transmolecular公司的科学家将放射性I131附着于自蝎子毒液中提取的一种多肽制成药物，研究发现该药物具有靶向性，对晚期神经胶质瘤有较好疗效，患者只需要从外部注射这种化合物，而无需再进行化疗或放射治疗。,蝎 毒 肽,19,生物药物的资源,植 物,动 物,动物脏器血液、分泌物及其它代谢物,微 生 物,海 洋 生 物,20,利用微生物作为工具,微生物的代谢物,微生物菌体,21,生物药物的资源,植 物,动 物,动物脏器血液、分泌物及其它代谢物,微 生 物,
6、海 洋 生 物,22,海藻类：已知的海藻有1万多种,海洋动物类：腔肠动物类、节肢 动物类、软体动物类、鱼类、爬行动 物类、海洋哺乳动物类,海洋微生物：,23,僧袍芋螺,齐考诺肽（ziconotide）最初由僧袍芋螺中提取，现已人工合成，是一种神经细胞钙通道阻断剂。作为一种非阿片类镇痛药物，用于治疗严重的慢性神经性疼痛，其鞘内注射剂经FDA批准于2005年上市。,齐考诺肽（ziconotide）,24,DidemninB是一种由7个氨基酸和2个羧酸组成的带有分枝的环缩肽，既能抑制蛋白质的合成,也能抑制DNA、RNA的合成，对黑色素瘤B16细胞周期作用的研究表明，它可杀伤各期细胞，尤以G1至S期细
7、胞敏感，它可快速完全介导HL-60细胞凋亡。目前Didemin B已能够人工全合成。,海鞘来源的抗癌肽 Didemnin B,25,海兔体内存在着多种结构独特、生理功能各异的次生代谢产物，如萜类、毒素、甾体、大环内酯及肽类等，其中肽类化合物尤为引人注目。其中Dolastatin15和Dolastatin 10主要用于小细胞肺癌、卵巢癌、黑色素瘤和前列腺癌等实体瘤的治疗。,海兔来源的抗癌作用肽,26,海藻类：已知的海藻有1万多种,海洋动物类：腔肠动物类、节肢 动物类、软体动物类、鱼类、爬行动 物类、海洋哺乳动物类,海洋微生物：,27,第一节 氨基酸类药物,28,本节内容,氨基酸的种类,氨基酸类药
8、物的制造方法,29,氨基酸输液,氨基酸的分类,蛋白质氨基酸：编码氨基酸,非蛋白氨基酸：D型氨基酸、-氨基酸、-氨基酸等,衍生氨基酸：5-羟色胺、硫酸甘氨酸、磷葡精氨酸等,必需氨基酸和非必需氨基酸：亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。,30,31,八种必需氨基酸：携一两本黄色书来,携-缬氨酸一-异亮氨酸两-亮氨酸本-苯丙氨酸黄-甲硫氨酸（硫为黄色）色-色氨酸书-苏氨酸来-赖氨酸,氨基酸记忆口诀,32,六伴穷光蛋：硫、半、光、蛋半胱、光、蛋（甲硫）氨酸含硫氨基酸 酸谷天出门：酸、谷、天谷氨酸、天门冬氨酸酸性氨基酸 死猪肝色脸：丝、组、甘、色氨酸一碳单位来源的氨基酸
9、 只携一两钱：支、缬、异亮、亮缬、异亮、亮氨酸支链氨基酸 一本落色书：异、苯、酪、色、苏异亮、苯丙、酪、色、苏氨酸生糖兼生酮 拣来精读之：碱、赖、精、组赖氨酸、精氨酸、组氨酸碱性氨基酸 芳香老本色：芳香、酪、苯、色酪、苯丙、色氨酸芳香族氨基酸 不抢甘肃来：脯、羟、甘、苏、赖脯、羟脯、甘、苏、赖氨酸不参与转氨基的氨基酸,所有氨基酸：六伴穷光蛋， 酸谷天出门， 死猪肝色脸， 只携一两钱。 一本落色书， 拣来精读之。 芳香老本色， 不抢甘肃来。,发酵法：苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、赖氨酸、亮氨酸等,酶法：丙氨酸、天冬氨酸、色氨酸等,氨基酸类药物的制造方法,重点,
10、33,基本原理：,以毛发等蛋白质为原料，通过酸、碱或酶水解成多种氨基酸混合物，经分离纯化获得各种药用氨基酸的方法称为水解法。,* 主要过程：水解、分离和结晶精制。,34,蛋白质水解法,品种：L-胱氨酸、L精氨酸、L亮氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸及L-丝氨酸等。,酸水解法：水解迅速而彻底，无消旋作用；色氨酸破坏，天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基，且产生大量废液污染环境。碱水解法：水解迅速而彻底，色氨酸不被破坏；含羟基或巯基的氨基酸全被破坏，且产生消旋，工业上多不采用。酶水解法：反应条件温和，无需特殊设备，氨基酸不被破坏，无消旋作用；水解不彻底，产物中除氨基酸外，尚含有多肽。工业上主要用于
11、生产水解蛋白及蛋白胨。,蛋白质水解法,重点,35,发酵的基本原理 借助微生物在有氧或无氧条件下进行生命活动制备微生物菌体或其代谢产物的过程。,发酵法,36,菌种诱变与选育,种子制备,发酵培养,产物分离纯化,发酵的基本过程,37,培养基配制与灭菌,缺点产物浓度低，设备投资大，生产周期长，成本高。,*绝大部分氨基酸可通过发酵法生产，有些由于得率低，未实现工业化生产。,38,基本原理：,又称酶工程技术，是在特定酶的作用下使某些有机物转化成相应氨基酸的技术。,* 主要过程,前体合成,菌体培养,转化反应,产品纯化与精制,酶转化法,39,微生物植物细胞动物细胞,化学合成，生物合成，天然存在,底 物 （AA
12、前体）,生物反应器,含L-AA反应液,L-AA,酶转化法生产L-AA流程,40,133.10,89.09,2.77,6.0,酸性氨基酸,中性氨基酸,溶于水和盐酸，不溶于乙醇和乙醚,在水中有一定溶解性，不溶于丙酮及乙醚,41,酶转化反应,工艺路线,42,工 艺 路 线,43,* 优点工艺简单，产物浓度高，转化率及生产效率较高，副产物少，固定化酶或细胞可进行连续操作，节省能源和劳务，并可反复使用。,* 缺点固定化细胞或固定化酶代价高。,44,以酸、醛、酯及某些氨基酸为原料，经氨解、水解、缩和、取代及氢化还原等化学反应合成-氨基酸的方法称为化学合成法。,化学合成法,45,* 特点理论上所有氨基酸均可
13、由化学合成法制造，但只有当采用其他方法生产很不经济时才采用化学合成法生产。,46,2005版中国药典收载的氨基酸原料药,氨基酸输液,47,氨基酸输液 多种结晶L-氨基酸依特定比例混合制成的静脉内输注液称为氨基酸输液。 当由于疾病等原因，不能经口摄取的时候，把纯度高的氨基酸混合液作为最合适的氮源，从静脉注入身体是比较合理的营养补给方法。,氨基酸输液的组方原理与配方模式,48,不同类型的AA输液，根据在临床上的用途不同可以分为以下几类：,49,思考题,氨基酸类药物的制造方法有哪些？简述其原理及其过程？蛋白质水解法有哪些？各有何优缺点？,50,第二节 多肽与蛋白质类药物,51,本节内容,多肽与蛋白质
14、类药物概述,多肽与蛋白质类药物的制造方法,52,重要的多肽与蛋白质类药物的制备,53,多肽类药物分类,54,多肽类药物分类,55,蛋白质类药物分类,56,蛋白质类药物分类,57,化学合成法,基因工程法,多肽与蛋白质类药物的制造方法,重点,58,原料选择,蛋白质药物Separation and Purification,59,重点,Protein-Separation,原料选择,提取,60,重点,清蛋白可溶于稀盐、稀酸、稀碱。可被饱和硫酸铵沉淀。eg:白蛋白，卵清蛋白,球蛋白不溶于水但溶于稀盐，可以被半饱和的硫酸铵沉淀。eg: IgG，肌球蛋白,谷蛋白不溶于水、醇和中性盐溶液，但溶于稀酸或稀碱。
15、eg:米谷蛋白,谷醇溶蛋白不溶于水及无水乙醇，但溶于70-80%乙醇中。非极性侧链多eg:小麦醇溶蛋白,组蛋白溶于水和稀酸，但可被稀氨水沉淀，分子中含His、Lys多。eg:小牛胸腺组蛋白,鱼精蛋白溶于水及稀酸，不溶于氨水，分子呈碱性。eg:鲑精蛋白,硬蛋白不溶于水、稀酸、稀碱、盐。有较强机械强度。eg:角蛋白，胶原,Protein-Purification,纯化 根据目的蛋白与杂质之间的差异进行纯化。1.根据蛋白质的pI的不同进行纯化，其方法有：1）pI沉淀法 2）pI沉淀法与盐析法相结合3）等电聚焦法 2.蛋白质分子形状和大小的不同进行纯化，其方法有 1）凝胶过滤 2）超滤法 3） 离心法
16、 4）透析法3.蛋白质的溶解度不同进行纯化，其方法有： a)盐溶与盐析法 b）结晶法 c）有机溶剂沉淀法4.蛋白质电离性质不同进行分离：离子交换法5.蛋白质功能专一性不同进行纯化：亲和层析法6.蛋白质在溶剂系统中分配不同进行纯化：萃取法7.蛋白质的选择性吸附的性质进行纯化：吸附法8.蛋白质的其他特殊性质进行纯化,62,重点,蛋白质两性解离性质和等电点,当蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点 （isoelectric point，pI）,等电聚焦电泳（Isoelectric focu
17、singIEF）,Isoelectric focusing,凝胶过滤层析Gel filtration chromatography,超滤（ultrafiltration）,原理:是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质留在半透膜上，以达到浓缩和脱盐的目的,透析（dialysis）,原理：利用蛋白质分子不能通过半透而将其与小分子物质分开 常用的半透膜为玻璃纸或纤维素材料,按照分子大小进行分离，分离取决于透析袋截留的分子量。,透析只用来除盐类和小分子杂质,盐析(salt precipitation),原理：将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及
18、水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。,盐溶,原理：分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中,有机溶剂分级沉淀,脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间相互作用。,阳离子交换树脂：平衡离子带正电荷 阴离子交换树脂：平衡离子带负电荷,阳离子交换层析过程,离子交换树脂,蛋白质,高离子强度洗脱液洗,高离子强度洗脱液洗,加样,平衡液洗,收集,离子交换层析（ Ion exchange ）,Affinity chromatography,分离纯化方法的选择,1.分离纯化早期使用方法的选择特点：提取液中的物质十分复杂，目的蛋白浓度较稀。方法选择原则：低分辨能力到高
19、分辨能力，而且负荷量较大为合适。,2.各种分离纯化方法的使用顺序原则：相同性质的纯化方法一般不重复使用。纯化方法顺序先后的安排上要考虑到有利于减少工序，提高效率。3.分离纯化后期的保护性措施4对每一步骤方法的优劣进行综合评价 每一个分离纯化步骤方法的好坏，除了从分辨本领和重现性二方面考虑外， 还注意方法本身的回收率的高低。,80,重点,纯化方法选择指南,81,多肽与蛋白质的化学合成概述,合成原理：是一个重复添加AA的过程，一般自C端向N端合成。,合成方法： （1）液相合成 （2）固相合成 （1963年R.B.Merrifield 创立，并因此获1984年 诺贝尔化学奖）,82,多肽合成的主要步
20、骤 氨基的保护和羧基的活化 羧基的保护和氨基的活化 接肽和去保护基氨基保护基 苄氧羰基强酸脱除 叔丁氧羰基（BOC）三氟乙酸（TFA）脱除 9-芴甲氧羰基（Fmoc）碱脱除,83,多肽的固相合成（Fmoc保护法）（1978年改进的方法，避免了强酸处理）,84,N,N-二环已基碳酰亚胺,9-芴甲氧羰基,胰岛素,胰腺是人体重要的消化器官，主要包括分泌消化酶为主的外分泌细胞和导管系统，及由多种内分泌细胞组成的胰岛。胰岛素是由胰岛中细胞分泌的肽类激素，分子结构为51个氨基酸组成有两个二硫键连接的2条肽链。,胰岛素单体,胰岛,胰腺,85,胰岛素的合成与分泌,细胞最初生成胰岛素原，后经分泌小泡运送到细胞膜
21、，由胞吐作用经细胞膜释放入血。释放过程中脱去一段C肽，形成A、B链结构的胰岛素。血液中内生胰岛素和C肽的比例是对等的。,胰岛素原,C肽,B链,86,胰岛素的结构,胰岛素的两个肽链分别为21个氨基酸组成的A链和30个氨基酸组成的B链。氨基酸排列有种属差异。猪胰岛素与人胰岛素仅在B链第30位氨基酸上有所不同，牛胰岛素在A链上还有两个氨基酸不同。,人胰岛素的一级结构,87,猪胰岛素牛胰岛素赖脯人胰岛素（礼来公司、速效Ins） 门冬胰岛素 （诺和诺德公司、速效Ins ） 甘精胰岛素 (安万特公司、长效Ins),人胰岛素（Insulin）,B30 A8 ;A10 ;B30 B28 ;B29B28 A21
22、 ;B31 ;B32,88,胰岛素,用X线衍射法测出猪胰岛素晶体的立体结构为(中国，1971)：六个胰岛素分子和两个锌离子的胰岛素六聚体。两个胰岛素分子形成二聚体，三个二聚体围绕着三重轴形成对称排列的六聚体。作为胰岛素的储存形式，在胰岛素制剂注射到人体内也需要经过由六聚体解离为二聚体，再分解为单体释放入血液被利用的过程。,89,3D Structure of Insulin,胰岛素二聚体（dimer）,胰岛素六聚体（hexamer ）,90,20世纪末人胰岛素类似物研制成功,胰岛素的蛋白质空间结构对维持其生物活性有很重要的意义，人工合成的胰岛素制剂受此影响在皮下注射后需有一定的解离时间才能发挥
23、效力，故治疗时需提前20-30分钟注射胰岛素。糖尿病人需要更接近生理状态、使用方便的胰岛素制剂。利用基因重组技术，修饰胰岛素的氨基酸组合。,91,目前临床使用的胰岛素来源,92,动物来源的胰岛素（28种）,93,半合成来源的胰岛素（5种）,94,基因重组来源的胰岛素（27种）,95,通化东宝 1998年12月研制出中国第一支基因重组胰岛素“甘舒霖” 甘舒霖 R- 常规重组人胰岛素注射液 甘舒霖 N- 低精蛋白重组人胰岛素注射液 甘舒霖 30R- 30/70混合重组人胰岛素注射液 （ 30%常规重组人胰岛素和70%低精蛋白重组人胰岛素）深圳科兴 苏泌啉- 常规重组人胰岛素注射液 苏泌啉恩- 低精
24、蛋白重组人胰岛素注射液 徐州万邦 万邦林- 常规重组人胰岛素注射液 万苏林猪胰岛素制剂,胰岛素国内主要生产厂家,其他（持有药品注册证） -南京新天生物化学制药有限公司、华西医科大学制药厂、上海第一生化制药厂、武汉生化制药厂 等。,96,临床用胰岛素分类,普通胰岛素：从动物胰脏中提取人胰岛素传统中长效胰岛素 长效人胰岛素类似物速效人胰岛素类似物非注射胰岛素,97,传统中长效胰岛素制剂 低精蛋白锌胰岛素：胰岛素、鱼精蛋白和锌的结晶。 例：礼来公司， Humulin N(rDNA、大肠杆菌) 诺和诺德， Novolin N (rDNA、酿酒酵母) 胰岛素锌混悬液：精蛋白锌胰岛素与常规胰岛素的混悬液
25、例：礼来公司， Humulin 30/70 (30%常规胰岛素，70%精蛋白锌胰岛素) Humulin 50/50 诺和诺德， Novolin 30/70 Novolin 50/50缺陷：作用时间少于24小时作用峰值明显，夜间低血糖危险性高吸收不稳定结霜现象，由于温度过冷或过热导致胰岛素在玻璃瓶壁沉淀，丧失活性,98,长效胰岛素-人胰岛素类似物,1. 甘精胰岛素（ glargine ）： 商品名Lantus-甘氨酸替代胰岛素A链21位门冬氨酸、并在B链末端增加两 个精氨酸。 使胰岛素结合更多带正电的氨基酸残基，改变等电点，使等电点由5.4上升至中性。这样，胰岛素类似物在酸性条件下可溶，在生理的
26、近中性条件下结晶。2. Insulin Detemir：商品名Levemir -胰岛素B链29位赖氨酸侧链通过酰基化连接一个N-16-烷基 酸的14碳游离脂肪酸该游离脂肪酸能与白蛋白结合，延缓与胰岛素受体结合，从而延长其半衰期。,99,Insulin Detemir（Levemir ）诺和诺德公司研制,glargine （Lantus）法国安万特公司研制,100,速效胰岛素,特点：起效快，皮下注射后15分钟起效。 达峰快，注射后15分钟起效，3060分钟达到药效高峰。药效维持时间短，大约在3小时左右（24小时）。,药代动力学特点与进餐后人体内源性胰岛素分泌十分相似，能够很好地控制当餐后血糖而且
27、不容易发生低血糖。,101,B26-30对于胰岛素结合于胰岛素受体的功能无关，但是对胰岛素形成二聚体有关的结构特点 。因此对此区段进行修饰将产生一些自聚合能力下降但是与胰岛素受体结合能力不变的新型速效胰岛素类似物 。,研制机理,已上市药物： Lispro 、 Aspart、Apidra,102,Lispro （赖脯胰岛素 ，Humalog ）是第一个用于临床的速效胰岛素类似物，由美国礼来公司研制生产，将人胰岛素的B28与B29位的氨基酸对换。,103,优泌乐赖脯胰岛素,Aspart（门冬胰岛素，Novolog ）由丹麦诺和诺德公司研制生产，结构与人胰岛素的区别在于用天冬氨酸取代了B链28位上的
28、脯氨酸。,104,诺和锐门冬胰岛素,诺和锐30特充,APIDRA （赖谷胰岛素，Apidra ）安万特公司研制，以赖氨酸和谷氨酸分别取代了人胰岛素B3位的天冬氨酸和B29位的赖氨酸。,105,胰岛素肺部吸入制剂-Exubera,美国辉瑞、Nektar公司以及法国万安特共同研发于2006.1.27被FDA批准一种作用快的胰岛素干粉吸入剂适用于餐前给药，其胰岛素吸收具有速效化的特征,106,非注射用胰岛素,正在研究中的其它非注射胰岛素给药途径包括: 口腔喷雾 鼻腔给药 直肠栓剂给药 均还在研究阶段 滴眼剂 透皮或口腔粘膜给药,107,胰岛素注射方式的改进,几十年来,胰岛素注射器已经有了很大的改进。
29、许多品牌厂商制造胰岛素专用注射器,针头经过特殊处理,因而注射时不感到疼痛,而且针眼很小。注射器针筒上直接标有胰岛素单位(IU)，注射几个单位胰岛素只要按标记抽取,不需换算。,一次性注射器,108,胰岛素注射方式的改进,一种利用高压将胰岛素“喷”入皮下的装置，无需针头，加之其经久耐用，常给惧怕针头的儿童使用。但此装置价格较贵，拆洗安装过程较繁琐，喷射时局部压力较大，尚未广泛推广使用。目前高压注射器多用于人群计划免疫和多人集中注射的情况。,高压无针注射仪,109,胰岛素注射方式的改进,胰岛素笔是一种形如钢笔的专用注射装置,将胰岛素液储存于笔中,使用前调好剂量旋钮,患者自己注射方便易行。胰岛素笔配有
30、专用笔盒,可随身携带,更方便于旅行出差时使用。笔上配有触感式剂量调整旋纽 ，也能适用于眼睛不方便的患者。,胰岛素笔,110,胰岛素注射方式的改进,胰岛素泵是目前最方便、最现代化的注射方式，可以自动定时定量地注射胰岛素，能较好模拟生理性胰岛素分泌，可以准确控制胰岛素的输入剂量，并能经导管连续不断按需要将胰岛素输入患者皮下。随着技术的发展，胰岛素泵越发小巧，功能亦不断完善，目前的胰岛素泵仅重约100克,如一台寻呼机大小，携带方便。,胰岛素泵,111,胰岛素制备工艺,重点,112,Ins的性质,113,Insulin crystas,酸醇提取法提取动物胰岛素,114,注意事项,115,酶促半合成人胰
31、岛素,116,重组DNA技术制造人胰岛素,AB链合成法：以人工合成的人胰岛素A链和B链基因分别与半乳糖苷酶基因连接，形成融合基因，分别在大肠杆菌中表达A链和B链，然后再通过化学氧化作用，通过二硫键连接起来。反转录酶法：通过胰岛素原的cDNA合成，表达产物是胰岛素原，经工具酶切开，除去C-肽得人胰岛素。,117,Ins A链,Ins B链,转化大肠杆菌,发酵,A链,B链,纯化,二硫键,活性胰岛素,AB链合成人胰岛素,118,反转录酶法合成人胰岛素,119,思考题,目前多肽和蛋白质类药物的制造方法有哪些？提取分离纯化法生产多肽和蛋白质类药物包括哪些过程？有哪些注意事项？目前胰岛素的制备方法有哪些？
32、,120,第三节 核酸类药物,Nucleic acid Medicine,121,本节内容,核酸类药物概述,核酸类物质的分离提取及其发酵生产,122,重要的核酸类药物的制备,核酸,核苷酸,磷酸,核苷,戊糖,碱基,DNA：AGCT,RNA：AGCU,RNA：D-核糖 DNA：D-脱氧核糖,123,一、核酸类药物概述,（一）依据化学结构和组成分类：分四类,124,125,抑制尿酸合成，解热镇痛抗炎,1、核酸碱基及其衍生物别嘌呤醇（Allopurinol）、巯嘌呤（Mercaptopurine）、磺硫嘌呤（Tisupurine）、氟尿嘧啶等2、核苷及其衍生物腺苷类：腺苷、腺苷甲硫氨酸（SAM）、阿糖
33、腺苷(Ara-A)等尿苷类：尿苷、呋喃氟尿嘧啶、氮杂尿苷（Azauridine）等胞苷类：阿糖胞苷（Ara-C）、环胞苷、氮杂胞苷等肌苷类：肌苷、肌苷二醛、异丙肌苷等脱氧核苷类：氮杂脱氧核苷、脱氧硫鸟苷等,126,3.核苷酸及其衍生物单核苷酸类：AMP、UMP、IMP、cAMP、CoA等核苷二磷酸类：尿二磷葡萄糖（UDPG）、胞二磷胆碱（CDP-Choline)等核苷三磷酸类：ATP、CTP、UTP、GTP等核苷酸类混合物：5核苷酸、2 核苷酸、3核苷酸等4.多核苷酸二核苷酸：Co、Co、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）多核苷酸类：RNA、DNA、poly I:C、poly A:U、转移因子（TF
34、）等,（二）依据结构特点及临床应用情况分类,1、具有天然结构的核酸类物质如：肌苷、ATP、GTP、CTP、UTP、Co I 等来源：提取或发酵特点：毒副作用小用途：有助于改善机体的物质代谢和能量平衡，加速受损组织的修复，临床已广泛应用于放射病、血小板减少症、白细胞减少症、慢性肝炎、心血管疾病等。,127,（二）依据结构特点及临床应用情况分类,2、自然结构碱基、核苷、核酸类结构的类似物如：巯嘌呤、阿糖胞苷、聚肌胞等来源：以核酸类物质为前体通过“化学法” 或“酶法”进行半合成特点：毒性较大用途：是当今人类治疗病毒、肿瘤、艾滋病等的重要手段，也是产生干扰素，免疫抑制的临床药物。,128,叠氮胸苷(A
35、ZT, azidothymidine)：又名齐多夫定，是胸苷的类似物，它能抑制HIV的复制，阻止病毒的增生。由英国首先开发，于1987年上市，为临床上第一个抗HIV的药物。,HIV-1,人的细胞,反转录,RNA,cDNA,整合入宿主DNA,新病毒,AZT在病毒RNADNA的阶段是反转录酶的底物，但在细胞中却不是DNA聚合酶的合适底物。这样AZT的作用是一种选择性的毒物，可以抑制病毒cDNA的产物，阻断新的病毒的合成。,129,反义药物,反义核酸是指天然存在的或人工合成的，能与靶DNA或RNA碱基互补，并能与之结合特异阻断其翻译的一段DNA或RNA。反义核酸技术是指利用反义核酸特异地抑制某些基因
36、的表达，使之低表达或不表达。,130,Reverse transcription,中心法则 (Central Dogma),Replication,131,反义药物优点： 1)高度特异性； 2)高生物活性、丰富的信息量； 3)高效性； 4)最优化的药物设计； 5)低毒、安全反义药物缺点：天然的寡核苷酸难以进入细胞内，而一旦进入又易被胞内核酸酶降解，很难直接用于治疗。,反义药物,132,133,二、核酸类物质的分离提取及其发酵生产,DNA和RNA在细胞中常与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在。 在浓NaCl（12mol/L）溶液中， DNA-核蛋白（DNP）的溶解度很大， RNA-核蛋白（RNP）的
37、溶解度很小，在稀NaCl （0.14 mol/L）溶液中，DNP的溶解度很小，RNP的溶解度很大。因此可利用不同浓度的NaCl溶液，将DNP和RNP分别抽提出来。,DNA与RNA的提取与制备,核酸的提取,DNA的提取：一般是利用DNA-核蛋白（DNP）易溶于1mol/L NaCl溶液而不溶于0.14mol/L NaCl溶液。RNA的提取：利用RNA-核蛋白（RNP）易溶于0.14mol/L NaCl溶液而不溶于1mol/L NaCl溶液的性质，先提取得到RNP。,134,重点,将抽提得的核蛋白用SDS处理，DNA或RNA即与蛋白质分开，可用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。
38、向溶液中加入适量乙醇，DNA即析出。为防止DNA或RNA酶解，提取时加入EDTA。,135,工业用RNA的提取,RNA制备,具有生物活性RNA的制备,RNA的生产,136,1、工业用RNA的提取,稀碱法,酵母等,1NaOH裂解细胞壁,溶液,HCL中和,加热破坏酶,冷却到10OC,离心,RNA溶液,调pH2-2.5（接近RNApI）,离心,RNA沉淀,浓盐法,酵母等,10NaCL,90OC提取,离心,上清液,调pH2-2.5,离心,RNA沉淀,137,2、具有生物活性RNA的制备,138,从核糖核蛋白中分离RNA,(1)乙醇沉淀法：,核糖核蛋白,溶于NaHCO3,水相,用含辛醇的氯仿去蛋白,乙醇
39、,RNA沉淀,(2)盐酸胍法：,核糖核蛋白,24盐酸胍38溶解,冷却至0,离心,RNA沉淀,139,DNA生产方法,1.工业用DNA的提取,140,141,核苷酸的制备,142,重点,（一）酶解法及碱水解法制备核苷酸,酶液,DNA液,保温,酶解液,加热，过滤,DNA降解液,离子交换吸附，洗脱,dAMP、dCMP、dGMP、dTMP,酶解法制备脱氧核苷酸,143,酶水解: DNA或RNA为原料制备5核苷酸,常用的酶：橘青霉产生的5磷酸二酯酶,橘青霉培养液,压滤,酶液,【酶解】,除菌体,DNA溶液,酶解液,加热、调pH9.0,过滤,DNA降解液,【离子交换】,吸附于氯型阴离子树脂,分部洗脱,脱氧核
40、苷酸,(dCMP、dAMP、dTMP、dGMP),RNA,降解,进一步分离,戊糖核苷酸,144,碱水解：可制备3和2核苷酸,145,（二）发酵法生产核苷酸,146,嘌呤核苷酸合成的中心,产氨短杆菌发酵生产肌苷酸（IMP）：腺嘌呤营养缺陷型嘌呤核苷酸生物合成途径和代谢调控,R5P,PRPP,PRPP转酰胺酶,PRA,IMP,分解,腺嘌呤阻遏,GMPAMPADPATP,反馈抑制,SAMP,AMP,ADP,ATP,XMP,GMP,GDP,GTP,鸟嘌呤,PP,GMPATP,PRPP,GTP,次黄嘌呤,鸟嘌呤GMP,147,保证IMP合成路线畅通： 保证关键酶PRPP转酰胺酶的活力-解除腺嘌呤及衍生物
41、的阻遏和反馈抑制阻断IMP的去路： 阻断SAMP合成 阻断IMP的分解筛选获得缺乏SAMP合成酶的腺嘌呤缺陷菌株，提供亚适量的腺嘌呤。使积累的IMP渗透到细胞外： 增大细胞膜通透性选育Mn2+不敏感的变异株,IMP积累的主要途径（前提）,148,肌苷酸的发酵生产,（一）直接发酵法：原料易得，效率较高，但有自身的反馈调节和存在降解肌苷酸的酶系。（二）二步发酵法（目前生成肌苷酸的主要方法）1、发酵法生产肌苷2、肌苷磷酸化：Inosine(肌苷)ATPIMPADP（三）半合成法生产肌苷酸 在发酵过程中添加前体物次黄嘌呤后，经由微生物产生的胞外酶转化成肌苷酸。但次黄嘌呤来源困难，至今未工业化生产。,1
42、49,重点,核苷的制备,150,发酵法生产核苷,151,枯草芽孢杆菌嘌呤核苷酸合成途径,SAMP,AMP,IMP,GMP,XMP,3,4,5,6,7,8,黄嘌呤缺陷型,（II）,鸟嘌呤缺陷型（经诱变缺失4号酶）,（III）,AICAR,SAICAR,PRA,PRPP,2,1,（一）,（一）,（一）,（一）,1：PRPP转酰胺酶2、7：SAMP裂解酶3：IMP脱氢酶4：XMP氨化酶5：GMP还原酶6：SAMP合成酶8：AMP脱氢酶,当培养基中提供限量腺嘌呤时 积累IMP 肌苷 积累IMP 肌苷 积累XMP 黄苷,枯草杆菌的磷酸单酯酶活力很强,ADP,（）,152,思考题,核酸提取的原理是什么？目
43、前核苷酸制备有哪些方法？肌苷酸的发酵生产方法有哪些？,153,第四节 酶类药物,154,本节内容,酶类药物的概述,酶类药物的提取与纯化,155,重要的酶类药物的制备,酶的分类,156,157,158,原料选择,生物材料的预处理,提取,浓缩,纯化,结晶,159,酶类药物的提取和纯化,原料选择,动植物组织,富含所需物质,生理状态及营养,提纯方便廉价,动物宰杀后立即取材,原 则,受限较多，产量有限,微生物发酵是发展方向,160,原料选择,生物材料的预处理,提取,浓缩,纯化,结晶,161,酶类药物的提取和纯化,1、动物材料的预处理：（1）机械法：有绞碎、刨碎、匀浆、研磨、超声波、挤压等方法，有些酶用机
44、械法处理后仍不能有效的提取，可结合其他处理法。（2）反复冻融：冷到-10左右，再缓慢溶解至室温，如此反复多次。由于细胞中冰晶的形成，及剩下液体中盐浓度的增高，能使细胞中颗粒及整个细胞破碎，使酶释放出来。（3）丙酮粉：组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可以减少 酶的变性，同时因细胞结构成分的破碎使蛋白质与脂质结合的某些化学键打开，促使某些结酶释放到溶液中。,生物材料的预处理,162,重点,163,原料选择,生物材料的预处理,提取,浓缩,纯化,结晶,164,酶类药物的提取和纯化,详细了解酶的性质，保持酶活性。,酶的浓缩,（1）工业上：超滤、离子交换浓缩、真空减压浓缩、薄膜浓缩、冷冻干燥浓缩,（2）实验室： 除上述方法外，对少量样品可用下列方法 1. 凝胶吸水法：用SephadexG-15或G-25吸水，再经离心或过滤 2. 用聚乙二醇浓缩,165,原料选择,生物材料的预处理,提取,浓缩,纯化,结晶,166,酶类药物的提取和纯化,注意两个问题：1.建立快速的测定酶活力的方法 2.建立活力回收表,酶的纯化：凡用于蛋白质的纯化手段均适用于酶的纯化。,从大肠杆菌中提取天冬酰胺酶活力回收表,167,原料选择,生物材料的预处理,提取,浓缩,纯化,结晶,168,酶类药物的提取和纯化,
