1、大肠杆菌 内毒素 (endotoxin)试剂 盒使用 方法 检测范围： 96T 0.03Eu/L 0.8Eu/L 使用目的： 本试剂盒用于测定 大肠杆菌 样本 中 内毒素 (endotoxin)含量 。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定 标本 中 大肠杆菌 内毒素 (endotoxin)水平。用纯化的 大肠杆菌 内毒素 (endotoxin)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入 内毒素 (endotoxin)， 再与 HRP 标记的 内毒素 (endotoxin)抗体结合，形成抗体 -抗原 -酶标抗体复合物 ，经过彻底洗涤后 加 底物 TMB 显色。 TMB 在 HR
2、P 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 内毒素 (endotoxin)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（ OD 值）， 通过标准曲线 计算样品 中 大肠杆菌 内毒素 (endotoxin)浓度。 试剂盒组成 1 30 倍浓缩洗涤液 20ml 1 瓶 7 终止液 6ml 1 瓶 2 酶 标试剂 6ml 1 瓶 8 标准 品（ 1.6Eu/L） 0.5ml 1 瓶 3 酶 标包被 板 12 孔 8 条 9 标准品 稀释液 1.5ml 1 瓶 4 样品 稀释液 6ml 1 瓶 10 说明书 1 份 5 显色剂 A 液 6ml 1 瓶 11 封板
3、膜 2 张 6 显色剂 B 液 6ml 1/瓶 12 密封袋 1 个 标本 要求 1标本采集后尽早进行 提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行 实验。 若不能马上进行试验，可 将标本放于 -20 保存，但 应 避免反复冻融 2不能检测含 NaN3 的样品 ，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（ HRP）活性。 操作步骤 1. 标准品的稀释： 本试剂盒提供原倍标准 品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。 0.8Eu/L 5 号标准品 150l 的原倍标准品加入 150l 标准品稀释液 0.4Eu/L 4 号标准品 150l 的 5 号标准品加入 150l 标准品稀释液 0.2Eu/L
4、 3 号标准品 150l 的 4 号标准品加入 150l 标准品稀释液 0.1Eu/L 2 号标准品 150l 的 3 号标准品加入 150l 标准品稀释液 0.05Eu/L 1 号标准品 150l 的 2 号标准品加入 150l 标准品稀释液 2. 加样：分别设空白孔 （空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同） 、 标准孔、待测样品孔 。 在酶标 包被板上 标准品准确加样 50l， 待测样品孔中 先加样品稀释液 40l，然后再加待测样品 10l（样品最终稀释度为 5 倍）。 加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁， 轻轻 晃动 混 匀 。 3. 温育：用封板膜封板后置 37 温育
5、 30 分钟 。 4. 配液： 将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用 5. 洗涤：小心揭掉封板膜， 弃去液体， 甩干 ，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。 6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50l，空白孔除外 。 7. 温育：操作同 3。 8. 洗涤：操作同 5。 9. 显色：每孔先加入显色剂 A50l，再加入显色剂 B50l，轻轻震荡混匀， 37 避光显色15 分钟 . 10. 终止： 每孔加终止 液 50l， 终止反应 （此时蓝色立转黄色） 。 11. 测定：以空白空调零， 450nm 波长依序测量各孔的 吸光 度（ OD 值） 。 测定应 在加终止液
6、后 15 分钟以内进行 。 操作程序总结： 计算 以标准物的浓度为横坐标， OD 值为纵坐标，在 坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以 稀释倍数 ；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代 入方程式，计算出样品浓度，再乘以 稀释倍数 ，即为样品的实际浓度。 注意事项 1 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2 浓洗涤液 可能 会有 结晶 析出，稀释时可在水 浴中加温助溶 ，洗涤时不影响结果。 3 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，
7、以避免试验误差。一次加样时间最好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高 （样本 OD 值大于标准品孔 第一孔的 OD 值 ） ，请先 用样 品 稀释 液稀释一定倍数（ n 倍） 后再测定，计算时请最后 乘以 总 稀释倍数 （ n 5） 。 5 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6底物请避光保存。 7 严格按照说明书的操作进行， 试验结果判定必须以酶标仪读数为准 . 8所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 9本试剂不同批号组分不得混用。 10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。 保存条件及有效期 1 试剂盒保存： ； 2-8 。 2有效期： 6 个月
