1、Beutler改良法 测定 组织 GSH操作规程 一、 原理及意义 原理： DTNB 能被 -SH 基团还原，产生等克分子的 2-硝基 -5-巯基苯甲酸，而苯甲酸阴离子 在一定 PH 值条件下 呈黄色，在 412 nm波长下 有吸收峰 。 意义： 还原型谷胱甘肽（ glutathione, GSH）是一种低分子自由基清除剂，它可清除 O2 、 H2O2、 LOOH。 GSH 是蛋氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的一种小分子肽，是组织中主要的非蛋白质的巯基化合物，并且是谷胱甘肽过氧化物酶（ GPX）和谷胱甘肽硫转移酶（ GST）两种酶类的底物，为这二种酶分解氢过氧化物 所必需，能稳定含巯基的酶和防止血
2、红蛋白及其它辅因子受氧化损伤，最近还证明 GSH 也参与使 Vit E 恢复到还原态的作用。 GSH 测定值的高低可间接反映机体发生氧化损伤的程度。 二、 器材 可见光 分光计 、 7 ml 离心 管 和管架、 加样器 和枪头 三、 试剂 1 mmol/L 的 GSH（标准品）； 1柠檬酸钠 ； 二硫双基苯甲酸（ dithio-bis-nitrobenzoicacid, DTNB）试剂：用 1柠檬酸钠配 成终浓度 0.04（ w/v） ； 20三氯醋酸 ； 0.3 mol/L 磷酸氢二钠（ Na2HPO4）缓冲 液 。 四、 步骤 1、样品处理及 试验步骤 （ 下面以肝脏组织为例 ） 称取一定
3、量的肝脏组织于 冰冷 0.85生理盐水中漂洗，滤纸吸干表面 水分，烧杯内剪碎 制备 20%组织匀浆液（须用 0.85生理盐水或三蒸水） 4000 g 离心 10 min 后取上清液 按上清液 :20三氯醋酸（体积比）为 2:1 混合（ 加 TCA 前 留 取 20 l 上清液用 于 Lowry 法测蛋白） 混匀， 4000 g 离心 10 min（此步离心要充分，可适当提高离心力） 收集上清液按表 2 测定。 2、按下表 1绘制标准曲线（ 单位： ml） 表 1 GSH 标准曲线的测定 GSH（ mol/L） 0 10 20 30 40 50 1 mmol/L的 GSH 0 0.05 0.1
4、0.15 0.2 0.25 三蒸水 0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 磷酸盐缓冲液 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 DTNB 试剂 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 混匀， 5 min 内于 412nm 比色，以三蒸水调零，以标准 GSH 浓度为 X 轴，相应吸光值为 Y 轴，绘制标准曲线，并求回归方程。 3、按下表 2操作测 定样品 GSH（单位： ml） 表 2 Beutler 改良法样品测定操作 试 剂 测定管 空白管 待测样品液 0.1 0 磷酸盐缓冲液 4.4 4.4 DTNB 试剂 0.5 0.5 三蒸水 0 0.1 测得的吸光值代
5、入回归方程，可计算出样品液的 GSH 浓度。 五、 实验结果 1、标准曲线结果 GSH 浓度（ mol） 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 A 值 0.000 0.126 0.260 0.394 0.529 0.666 根据上数据测得标准曲线方程为： X(mol)=0.3744898 Y+0.0017227（其中 Y 为吸光值，标准曲线看Figure 1） y = 2 . 6 7 0 3 x - 0 . 0 0 4 6R2= 0 . 9 9 9 80. 0000. 1000. 2000. 3000. 4000. 5000. 6000. 7000. 8000 0. 05 0. 1 0. 15 0. 2 0. 25 0. 3G S H 量 ( m o l)吸光度(A)Figure 1 GSH标准曲线图 六、 注意事项 样品应冰上匀浆，所有步骤尽量保证低温下操作，否则结果偏低； 所有用水均需三蒸水，否则结果偏低； 未经蛋白变性处理的样品在 20 不宜存放； 反应管内最终 PH 值必须保证在 8.0 9.0 间，否则结果不稳定； 配好的 DTNB 应在有限期内使用（ 4 下可存 1 个月）； GSH 浓度低时显色快，消退也快；浓度高时显色慢，消退也慢，一般反应 1 5 min 后测定（最好不要超过 5 min）； 反应总体积可 调为 2.5 ml。
