1、微生物的利用,1大肠杆菌的培养和分离2分离以尿素为氮源的微生物,大肠杆菌的培养和分离,实验目的实验原理实验器具与材料实验步骤实验结果和结论知识拓展,实验目的,利用LB液体培养基进行大肠杆菌的扩增培养的操作利用LB固体平面培养基划线培养进行大肠杆菌的分离说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理,实验原理,培养基大肠杆菌LB液体培养基和LB固体培养基划线分离法菌种的低温保存无菌技术,培养基,一、培养基定义及营养成分1、定义 人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长繁殖的营养基质，称为培养基。2、营养成分 培养基中的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等,2、营养成分 碳源为微生物提
2、供碳元素的物质，可分为有机碳源和无机碳源。如 CO2、NaHCO3 等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源，异养微生物只能利用有机碳源；单质碳不能作为碳源。注意：碳源&能源的辨析,2、营养成分 氮源为微生物提供氮元素的物质，可分为有机氮源和无机氮源。有机氮源包括牛肉膏，蛋白胨等，无机氮源包括 N2、NH3、NH4+、NO3-等，只有固氮微生物才能利用 N2。,2、营养成分 生长因子通常指那些微生物生长所必需而且需要量很小，自身不能合成或合成量不足机体生长需要的有机化合物。一般可分为维生素、氨基酸、嘌呤与嘧啶这三类。,2、营养成分 无机盐无机盐是微生物生长、代谢必不可少的一类营养物质。无机盐
3、生理功能主要是：作为酶活性中心的组成部分；构成微生物细胞的各种组分；调节并维持细胞的渗透压平衡、调节pH和控制细胞的氧化还原位；作为某些微生物生长的能源物质。常见种类：磷酸盐、硫酸盐、氯化物，以及含有钠、钾、钙、镁、铁等金属元素的化合物。,2、营养成分注意：这几类营养成分不一定都需要一一单独添加。不是所有培养基都必须同时含有碳源、氮源、水、无机盐、生长因子。,二、培养基的类型,1、按照物理性质划分液体培养基，固体培养基，半固体培养基2、按照成分划分天然培养基，合成培养基3、按照用途划分基础培养基，加富培养基，选择培养基，鉴别培养基,a.液体培养基：不加凝固剂，配置成液体状态。 应用：在用液体培
4、养基培养微生物时，通过振荡或搅拌可以 增加培养基的通气量，同时使营养物质分布均匀。液体培养基常用于大规模工业生产，以及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究。,b.固体培养基：加入较多凝固剂，配置成固体状态,主要用于 获取单菌落，并对微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏等。 常用的凝固剂有琼脂、明胶、和硅胶。 绝大多数微生物而言，琼脂是最理想的凝固剂，由藻类( 海产石花菜)中提取的一种复杂多糖；明胶是由胶原蛋白制备得到的产物，是最早用来作为凝固剂的物质；硅胶是由无机的硅酸钠等制成的胶体。,c.半固体培养基：加入较少凝固剂，培养基中琼脂含量一般为 0.20.7%。 应用：可用于观察微生物
5、的运动特征、分类鉴定等。 1、按照物理性质划分 考点：注意固体&液体培养基的判断 关键字：液体培养基：振荡、大规模工业生产等 固体培养基：凝固剂、平板、单菌落等,天然培养基：这类培养基含有化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物，也称非化学限定培养基。 （因为天然有机物成分是十分混杂不稳定的。）牛肉膏蛋白胨培养基和麦芽汁培养基就属于此类。基因克隆技术中常 用的LB(LuriaBertani)培养基也是一种天然培养基。 常用的天然有机营养物质包括牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏、豆芽汁 、玉米粉、土壤浸液、麸皮、牛奶、血清、稻草浸汁、羽毛浸汁、胡萝卜汁、椰 子汁等，嗜粪微生物可以利用粪水作为营养物
6、质。 应用：天然培养基成本较低，除在实验室经常使用外，也适于用来进行工业上大规模的微生物发酵生产。,合成培养基：是由化学成分完全了解的物质配制而成的培养基，也称 化学限定培养基。高氏I号培养基和查氏培养基就属于此种类型。 应用：配制合成培养基时重复性强，但与天然培养基相比其成本较高 ，微生物在其中生长速度较慢，一般适于在实验室用来进行有关微生 物营养需求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌种选育及遗传分析等方面的研究工作。,基础培养基： 含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基，如牛肉膏蛋白胨培养基。 应用：基础培养基可以用来作为一些特殊培养基的基础成分。加富培养基：在基础培养基中加入某些
7、特殊营养物质制成 的一类营养丰富的培养基，用来培养营养要求比较苛刻的异养型微生物。 这些特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织 液等。 应用：加富培养基可以用来培养营养要求比较苛刻的异养型微生物，以及从环境中富集和分离某种微生物。,鉴别培养基： 是用于鉴别不同类型微生物的培养基。 在培养基中加入某种特殊化学物质，某种微生物在培养基中 生长后能产生某种代谢产物，而这种代谢产物可以与培养基 中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征性变化，根据这种特征性变化，可将该种微生物与其他微生物 区分开来。 应用：鉴别培养基主要用于微生物的快速分类鉴定，以及分离和筛选产生某种代谢产物的微生
8、物菌种。 常见例子：伊红-美蓝培养基，鉴别大肠杆菌，使其出现带金属光泽深紫色菌落。 刚果红培养基，鉴别能分解纤维素的微生物，在这里微生物周围形成透明圈。,选择培养基： 用来将某种或者某类微生物，从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。 根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质 ，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。常见类型： a.依据某些微生物的特殊营养需求设计 如：利用以纤维素或石蜡油作为唯一碳源的选择培养基，可以从混杂的微生物群体中分离出能分解纤维素或石蜡油的微生物 ; 利用以蛋白质作为唯一氮源的选择培养基，可以分
9、离产胞外蛋白酶的微生物 ; 缺乏氮源的选择培养基可用来分离固氮微生物。,b.在培养基中加入某种化学物质 , 这种化学物质没有营养作用 , 对所需分离的微生物无害 , 但可以抑制或杀死其他微生物 。 如 ：在培养基中加入青霉素、 四环素或链霉素 , 可以抑制细菌 和放线菌生长 , 而将酵母菌和霉菌分离出来。 现代基因克隆技 术中也常用选择培养基 , 筛选含有重组质粒的基因工程菌株。 在培养基中加入高浓度的NaCl可得到金黄色葡萄球菌。注意：有的培养基可以同时是选择+鉴别培养基 当要分离金黄色葡萄球菌时 , 在培养基中加入 7.5%NaCl 、甘露糖醇和酸碱指示剂 。 金黄色葡萄球菌可耐高浓度 N
10、aCl, 且能利用甘露糖醇产酸。因此 ，能在上述培养基生长，而且菌落周围培养基颜色发生变化，则该菌落有可能是金黄色葡萄球菌 , 再通过进一步鉴定加以确定。,除上述四种主要类型外，培养基按用途划分还有很多种，比如：分析培养基 常用来分析某些化学物质 ( 抗生素、维生素 ) 的浓度，还可用来分析微生物的营养需求；还原性培养基 专门用来培养厌氧型微生物；组织培养物培养基含有动、植物细胞 , 用来培养病毒、 衣原体 、立克次 氏体等专性活细胞寄生的微生物。 尽管如此 , 有些病毒和立克次氏体目前还不能利用人工培养基来培 养 , 需要接种在动植物体内、 动植物组织中才能增殖。常用的培养病毒与立克次氏体的
11、动物有小白鼠、家鼠和豚鼠 , 鸡胚也是培养某些病毒与立克次氏体的良好营养基质 。,第一题,大肠杆菌是革兰氏阴性兼性厌氧的肠道杆菌，原核生物，以二分裂方式繁殖。,细菌是单细胞的原核生物。细菌细胞的结构有细胞壁、细胞膜、细胞质等。细菌无成型的细胞核，细胞壁由肽聚糖组成。由于细菌细胞壁结构不同，细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。革兰氏阳性菌细胞壁厚，无荚膜，多产生外毒素；革兰氏阴性菌细胞壁薄，有荚膜，多产生内毒素。革兰氏阳性菌对青霉素更为敏感。 大肠杆菌是革兰氏阴性、异养兼性厌氧型肠道杆菌。在肠道中一般对人无害，但任何大肠杆菌进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。大肠杆菌在基因工程技术中被广
12、泛的应用，它的质粒是最常用的运载体，它也是基因工程中常用的受体细胞。,LB液体培养基 扩大培养大肠杆菌LB固体平面培养基 划线分离培养大肠杆菌,划线分离法,通过接种环在琼脂固体培养基表面，连续划线，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面，形成单菌落，单菌落的分离是消除污染杂菌的通用方法，也是筛选高表达量的最简便方法之一,无菌技术,1、定义指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。目的：防止外来杂菌入侵，获得纯净的培养物。,2、实现无菌的常用方法 消毒 灭菌 消毒：采用相对较为温和物理或化学方法，杀死物体表面或内部部分的微生物（不包括芽孢和孢子）。常见的消
13、毒方法：煮沸消毒法、紫外线消毒法、巴氏消毒法以及利用化学药品消毒等, 灭菌： 指用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物（包括芽孢和 孢子）。 常见的灭菌方法：灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌等,3、主要内容 主要包括三个方面： 无菌环境设施、无菌实验器材、无菌操作方法 无菌环境设施： 无菌环境只是相对而言，指人们利用物理的方法或化学的方法，在某一可控制空间内使微生物数量降低至最低限度，接近于无菌的一种空间。 主要方法：无菌室 无菌柜 超净工作台, 无菌实验器材： 凡是实验中使用的器材，能灭菌处理的必须灭菌。如玻璃器皿 （包括注射器、吸管、滴管、三角瓶、试管等）、培养基、无菌衣 、口罩等，无法
14、灭菌处理的，使用前必须经消毒处理，例如无菌室内的凳、试管架、天平等，这些虽然无法灭菌，但是可以消毒，可用化学药品熏蒸、喷洒或擦拭。, 无菌操作方法： a.对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒; b.将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌; c.为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行; 注意：通常，可在酒精灯旁进行实验；小规模的操作可以使用无菌箱或超净工作台，工作量大的使用无菌室，要求严格的可在无菌室内再结合使用超净工作台。d. 实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触； e. 使用过的培养基及培养物等必须经过灭菌处理后才能丢弃
15、，以防止培养物的扩散；,培养基的配制,培养基的配制原则 选择适宜的营养物质 总体而言，所有微生物生长繁殖均需要培养基含有碳源、氮 源、无机盐、生长因子、水及能源，但由于微生物营养类型复 杂，不同微生物对营养物质的需求是不一样的，因此首先要根 据不同微生物的营养需求配制针对性强的培养基。 营养物质浓度及配比合适 培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好，营养物质浓度过低时不能满足微生物正常生长所需，浓度过高时则 可能对微生物生长起抑制作用。, 控制pH条件 各类微生物生长繁殖或产生代谢产物的最适pH条件各不相 同，一般来讲，细菌与放线菌适于在pH77.5范围内生长，酵母菌和霉菌通常在pH4.
16、56范围内生长。 值得注意的是，在微生物生长繁殖和代谢过程中，由于营养物质被分解利用和代谢产物的形成与积累，会导致培养基pH发生变化，若不对培养基pH条件进行控制，往往导致微生物生长速度下降或(和)代谢产物产量下降。因此，为了维持培养基pH 的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，常用的缓冲剂是 一氢和二氢磷酸盐(如KH2PO4 和K2HPO4)组成的混合物。 灭菌处理,培养基的配制流程以牛肉膏蛋白胨固体培养基为例： 计算称量溶(熔)化调pH灭菌倒平板 计算：根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的比例，计算制作 100mL 的培 养基时，各种成分的用量。 称量：准确地称取各种成分。 溶化：将称好的牛肉
17、膏连同称量纸一同放入烧杯，加入少量的水， 加热。当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。往烧杯中加入称量好的蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌，使其溶解。加入 琼脂加热使其熔化。在此过程中不断用玻璃棒搅拌，防止琼脂糊底而 导致烧杯破裂。当琼脂完全熔化后，补加蒸馏水至 100mL。, 调 pH：培养霉菌时需将 pH 调至酸性，培养细菌时需将 pH 调至中性。 灭菌： 将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，放入高压灭菌锅，在压力为 100kPa，温度为 121的条件下，灭菌 1530min。 灭菌： 注意事项： a.灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此高压锅内冷空气必须完全排尽后
18、，才能关上排气阀，维持所需压力; b.灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力 表的压力降至“0”时，打开排气阀，打开盖子，取出灭菌物品。, 倒平板： 待培养基冷却至 50左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。 倒平板操作： a.将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形 瓶，左手拔出棉塞； b.右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰； c.用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培 养基（约 1020mL）导入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖； d.等待平板冷却凝固后，将平板倒置过来放置，使皿盖朝下，皿底在上。,有关倒平板的操作错误的是（ ）A 将灭过菌
19、的培养皿放在火焰旁的桌面上 B 使打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰 C 将培养皿打开，培养皿盖倒放在桌子上 D 等待平板冷却凝固后需要倒过来放置A、将过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，防止培养皿被污染，A正确；B、使打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰，对锥形瓶的口径处进行灼烧灭菌，防止空气中的杂菌污染，B正确；C、倒平板时不能把培养皿盖完全打开并放到桌面上，这样会污染培养皿中的培养基，C错误；D、倒平板后冷却需要倒过来放置，防止皿盖上的水珠滴落到培养基上，D正确故选：C,（为什么要倒平板）,下列操作属于灭菌方法的是（ ） A接种前用酒精棉球擦拭双手和工作台面B接种中试管口等易被污染的部位通过火焰 C牛奶在
20、 80下煮 15min 以杀死其中的微生物 D氯化汞溶液浸泡外植体 12min 后无菌水冲洗B巴氏消毒化学药剂消毒,关于灭菌和消毒的不正确理解是（ ） A 灭菌是指杀灭环境中的一切微生物包括芽孢和孢子 B 消毒和灭菌实质上是相同的，都能杀死一切微生物 C 接种环用灼烧法灭菌 D 常用消毒、灭菌方法有加热法、过滤法、紫外线法、化学药物法B、消毒是指消除或杀灭外环境中的病原体，使其无害化，灭菌则是要将所有的微生物和病毒全部杀灭，以达到无菌的目的，灭菌一定可以达到消毒的目的，但消毒不一定能达到灭菌的效果，B错误；C、接种工具常用灼烧法灭菌，C正确；D、常用的消毒方法有煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或
21、化学药物消毒法等，灭菌可以采用高温蒸汽灭菌法，D正确故选：B,消毒和灭菌是两个不同的概念，灭菌是指彻底杀灭微生物使其永远 丧失生长繁殖的能力消毒仅指杀死一部分对人体有害的病原菌而 对被消毒的物体基本无害下列哪些事物适用于消毒处理（ ） 皮肤 饮用水 牛奶 注射器 培养皿 接种环 培养基 果汁 酱油 手术刀 A B C D 以上全部,消毒指用比较温和的方法杀死微生物的营养细胞，适用于那些不耐高温的液体如牛奶、果汁、酱油，这样可以使其中的营养成分不被破坏另外对要求不是很严格的皮肤、饮用水也用消毒的方法处理而对于严格要求的注射器、培养皿、接种环、培养基、手术刀等必须进行灭菌处理所以，应该用消毒的方法
22、处理故选：A,（1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑 _ 、 _ 和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型 容易选择、 _ 、 _ 等优 点，因此常作为遗传学研究的实验材料。 （2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培 养器皿进行_(消毒、灭菌)；操作者的双手需进行清洗和_； 静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性 ，还能 _ 。（3）若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的_。（3）通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小，颜色等菌落特
23、 征对细菌进行初步的 _ 。 （4）培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于 固体培养基应采用的检测方法是 _ 。 （5） 若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及培养物必须经过 _ 处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。1 温度 酸碱度 易培养 生活周期短2 灭菌 消毒 损伤DNA结构3比例合适 3鉴定 和分类 4将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间观察培养基上是否有菌落产生。5灭菌,实验器具与材料,主要器具高压蒸汽灭菌锅，三角瓶，封口膜，培养皿，接种瓶，恒温培养箱，摇床，酒精灯，超净台，装有酒精棉球的广口瓶，镊子，试管，棉塞，主要材料LB液体培养基（蛋白胨+酵母提取物+氯
24、化钠+水）LB固体培养基（蛋白胨+酵母提取物+氯化钠+琼脂+水）空白斜面，大肠杆菌菌种斜面（保存在斜面培养基上的大肠杆菌）,实验步骤,1培养基的配置2大肠杆菌的扩大培养3大肠杆菌的划线分离培养4大肠杆菌的保存培养5实验结果与结论,1培养基的配置,1称量：准确称取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，加水50ml。配置LB固体培养基时还需加1g琼脂。 (培养基中添加凝固剂如琼脂，一般不能被微生物利用，只能起到凝固作用）2溶化：加热熔化，用蒸馏水定容到50mL。配置LB固体培养基时还需加琼脂，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。 3调pH：用1mol/
25、L NaOH溶液调节pH至偏碱性。,4灭菌：在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基，加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。 5倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至60左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是：将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。 倒过来放置的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。向培养皿中转移已灭菌
26、的培养基时，也不要把培养基沾在皿壁上。否则，空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。,灭菌和消毒,1无菌技术：对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰旁进行；避免已灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 2消毒方法：日常生活经常用到的是煮沸消毒法；对一些不耐高温的液体，则使用巴氏消毒法；对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒石炭酸或煤酚皂等溶液以增强消毒效果，然后使用紫外线进行物理消毒；实验操作者的双手使用酒精进行消毒。 3灭菌方法：接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；培养基、无菌水
27、等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅；表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。,比较消毒和灭菌：,注意事项：实验中用的棉花不能用脱脂棉，因脱脂棉易吸水，吸水后容易造成污染。灭菌后，通常在6080烘箱中除去灭菌时的水分；物品装入高压蒸汽灭菌锅灭菌后，要首先打开排气阀，煮沸并排除锅内冷空气，其目的是有利于锅内温度升高，随后关闭排气阀继续加热，加热结束切断热源后，要使温度自然降低，气压务必降至零时打开锅盖，其目的是防止容器中的液体暴沸；在用任何器皿转接时，瓶塞和封口膜只能夹在手上，不许放在台面上，接种时要在酒精灯火焰旁操作；培养基一定不能沾在三角瓶口、试管管口和培养皿壁上，
28、否则容易污染；接种时要胆大心细，动作快捷，这是减少污染的关键；接种后，培养皿必须倒放（盖在下方）在恒温培养箱中，如正放则水蒸气在盖上凝成水滴，滴到接种后的培养基表面，水流扩散会使菌落扩散，就很难形成单菌落了。,2大肠杆菌的扩大培养,将保存大肠杆菌斜面和有液体培养基的三角瓶放在左手中，靠近酒精灯火焰，右手拿着接种环，并用无名指和小指家住斜面的棉塞和三角瓶封口膜，将接种环在火焰上烧红，冷却后取斜面上的单菌落菌体放入三角瓶的液体培养集中，并用封口膜封口，在37度，每分钟200转的摇床上振荡培养12小时。,3 大肠杆菌的划线分离培养,1划线分离法：用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在
29、划线过程中菌液逐渐减少，细菌也逐渐减少。划线到最后，可使细菌间的距离加大。在培养1020h后，可由一个细菌产生单菌落，菌落不会重叠。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。,其操作步骤是：将培养皿底部用拇指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液，迅速送入培养皿内，在平板培养基的一边，作第1次平行划线 35条，转动培养皿约70角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平
30、行划线。划线时，接种针应与平板表面成30角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于恒温箱培养。,灼烧的目的取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者涂布分离法：先将培养的菌液稀释，通常稀释到105 107之间，然后取0.1ml不同稀释度的稀释菌液放在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。通常每个培养皿有20个
31、以内的单菌落最为适合。将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。细菌的两种分离法各有优点,都可采用。,4 大肠杆菌的保存培养,在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在空白斜面上，在37度下培养24小时，置于4度的冰箱中保存。菌种放在低温环境中保存的目的是为了降低微生物的新陈代谢速率，延缓菌种细胞的衰老。,5 实验结果,在37度恒温培养箱中培养12-24小时后，看到划线的开始，菌落连续，说明大肠杆菌在液体培养基里得到了大量扩增，看到划线的末端出现不连续的单个菌落，表明大肠杆菌已被分离。,五、菌落和菌种种类的辨认
32、,单个细菌用肉眼是看不见的，但是，当单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，便会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。不同种类的细菌所形成的菌落在大小、形状、颜色、光泽度、透明度等方面具有一定的特征。 细菌的菌落表面一般是光滑而湿润的，有黏稠性，多数透明或半透明，但也有细菌的菌落表面是干燥、有褶皱的；放线菌由于有纤细的菌丝并可产生孢子，所以菌落表面是紧密的绒状、坚实多皱，长孢子后就成粉末状，由于菌丝和孢子有多种色素，所以在菌落培养基底部和菌落表面都有不同的颜色，菌落不易用接种环挑动；酵母菌落类似于细菌菌落，表面光滑而湿润，有黏稠性但大多呈乳白色，少数呈红色。 如果菌落无法辨认，只有借助于显微镜观察。在显微镜下细菌一般为杆状、球状和弧状，直径都在1um左右；放线菌菌丝是没有横隔的分枝丝状体，气生菌丝顶端分裂成串状孢子，孢子丝有直线形、螺旋状、弯曲式或轮生等；酵母有卵圆型或丝状，但卵圆形细胞大于细菌，直径约57um。,
