生物实验室常用实验方法.DOC

1、苏州市莱顿科学仪器有限公司 TEL：0512-66325740第 1 页 共 54 页生物实验室常用实验方法1、 总 RNA 的提取（Trizol 法提取）2、 PCR3、 琼脂糖核酸电泳4、 胶回收纯化 DNA5、 大肠杆菌质粒 DNA 的提取（碱裂解法）6、 感受态细胞的制备7、 重组子的筛选和鉴定8、 转染细胞总 RNA 的提取（Trizol 法提取）在收集到生物材料之后，最好能即刻进行 RNA 制备工作。若需暂时储存， 则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80冷冻柜。在制备 RNA 时，将 储 存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解 冻，以避免 R

2、Nase 的作用。1. 提取组织 RNA 时，每 50100mg 组织用 1ml Trizol 试剂对组织进行裂解；提取细胞 RNA 时，先离心沉淀细胞，每 5-10 10 6 个细胞加 1ml Trizol 后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2. 将上述组织或细胞的 Trizol 裂解液转入 EP 管中,在室温 1530C 下放置 5 分钟；3. 在上述 EP 管中，按照每 1ml TRIZOL 加 0.2ml 氯仿的量加入氯仿，盖上 EP 管盖子，在手中用力震荡 15 秒，在室温下（15 30）放置 23 分钟后， 12000g（28）离心 15 分钟；4. 取上层水相置于新 EP 管

3、中 ,按照每 1ml TRIZOL 加 0.5ml 异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（1530）放置 10 分钟,12000g（28）离心 10 分钟；5. 弃上清，按照每 1ml TRIZOL 加 1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（28）离心 5 分钟，弃上清；6. 让沉淀的 RNA 在室温下自然干燥；7. 用 Rnase-free water 溶解 RNA 沉淀。 PCR 实验室常用 DNA 聚合酶有三种：TaKaRa TaqTM，TaKaRa EXTaqTM 和 PyrobestTM DNA Polymerase。TaKaRa TaqTM 是一般的 DNA 聚合酶，保真性较

4、差，但价 钱便宜，一般用于基因表达的检测等。TaKaRa EXTaqTM 是具有 Proof reading 活性的耐热性 DNA 聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的 PCR 产物 3端附有一个“A” 碱基，如果希望直接将产物克隆到 T-vector 可以用此酶。PyrobestTM DNA Polymerase 也是具有 Proof reading 活性的耐 热性 DNA 聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的 PCR 产物为平滑末端。如果 进行基因的扩 增请使用此酶。苏州市莱顿科学仪器有限公司 TEL：0512-66325740第 2 页 共 54 页1. 按下列组成在 PCR

5、 反应管中 调制反应液：TaKaRa TaqTM 或 TaKaRa EXTaqTM 的配方Reagent Quantity, for 50l of reaction mixture10X PCR buffer （Mg2+ free） 5 l如 TaKaRa TaqTM 加 3 l MgCl2（25mM）如 TaKaRa EXTaqTM 加 4 l2.5mM dNTP mix 4 l 10M Primer 上游 1 l10M Primer 下游 1 lTemplate DNA 1 lTaq 或 EXTaqDNA Polymerase 0.25 lSterile deionized water U

6、p to 50lTotal 50 l /SamplePyrobestTM DNA Polymerase 的配方Reagent Quantity, for 50l of reaction mixture10X Pyrobest buffer 5l2.5mM dNTP mix 4l 10M Primer 上游 1l10M Primer 下游 1lTemplate DNA 1lPyrobestTM DNA Polymerase 0.25lSterile deionized water Up to 50lTotal 50l /Sample 反应总体积根据实际情况进行调控，可以做 2050l 以节约试剂

7、；苏州市莱顿科学仪器有限公司 TEL：0512-66325740第 3 页 共 54 页 将上表各成分加入到 0.2ml 或 0.5ml 灭菌的 PCR 薄壁管中； 如果不用 PCR 仪的加热盖，在反应混合液的上层加 30 50l 的矿物油防止样品在 PCR 的过程中蒸发；2. 按以下程序进行 PCR 扩增。PCR 反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异，在实际操作中需根据具体的情况以及PCR 结果而进行优化。StepTemperature, C Time, min Number of cyclesNote起始变性 9495 1-3 1变性 9495 0.5-2退火 37-70 0.5

8、-2退火温度比理论退火温度大概低 5C，再根据反应结果优化延伸 70-75根据扩增产物的大小25-35每分钟延伸 1000bp最终延伸 70-75 10 1反应结束后，抽取扩增样品 5l，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用 DNA marker 判断扩增片段的大小或冷冻保存，以 备以后分析使用。RT-PCRProtocol: TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV) 1. 按下列组成在 PCR 反应管中 调制反应液ReagentQuantity, for 50lof reaction mixture苏州市莱顿科学仪器有限公司 TEL：0512-66325740第 4

9、 页 共 54 页10One Step RNA PCR Buffer 5l25 mM MgCl2 10l10 mM dNTP mix 5lRNase Inhibitor (40 U/l) 1lAMV-Optimized Taq 1lAMV RTase XL (5 U/l) 1l上游特异 Primer (20 M) 1l下游特异 Primer (20 M) 1l实验样品 RNA（1 g Total RNA） 1lRNase Free dH2O 24lTotal 50l /Sample1. 反应总体积根据实际情况进行调控，可以做 2050l 以节约试剂；2. 将上表各成分加入到 0.2ml 或 0

10、.5ml 灭菌的 PCR 薄壁管中；3. 如果不用 PCR 仪的加热盖，在反应混合液的上层加 30 50l 的矿物油防止样品在 PCR 的过程中蒸发；2 按以下条件进行反应Step Temperature, C Time, minNumber of cyclesNote逆转录 50 30 1逆转录酶失活 94 2 1变性 94 0.5退火 37-65 0.5退火温度比理论退火温度大概低 5C，再根据反应结果优化延伸 72根据扩增产物的大小25-35Taq 酶每分 钟延伸 1000bp苏州市莱顿科学仪器有限公司 TEL：0512-66325740第 5 页 共 54 页最终延伸 72 10

11、1反应结束后，抽取扩增样品 5l，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用 DNA marker 判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。琼脂糖核酸电泳1. 用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；2. 根据欲分离 DNA 片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入 电泳缓冲液（一般 2030 ml）；3. 放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；4. 室温下 3045 分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；5. 向电泳槽

12、中倒入电泳缓冲液，其量以没 过胶面 1mm 为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；6. 在 DNA 样品中加入 10体积的载样缓冲液（loading buffer），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；7. 接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记 DNA 样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)。一般 60100V 电压， 电泳 2040min 即可；8. 根据指示剂泳动的位置，判断是否 终止电泳；9. 电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准 Marker 比较被扩增产物的大小。 琼脂糖凝胶浓度与线形 DNA 的最佳分辨范围琼脂糖凝胶浓度

13、 线形 DNA 的最佳分辨范围（bp）0.5% 1,00030,0000.7% 80012,0001.0% 50010,0001.2% 4007,0001.5% 2003,0002.0% 502,000胶回收纯化 DNA1. 琼脂糖电泳，将特异电泳 带用刀切下放入到 EP 管中，称琼脂糖带的重量；2. 按照每 100mg 加 400l 的量加入 binding buffer，放入到 EP 管振荡器中， 4555温育振荡，苏州市莱顿科学仪器有限公司 TEL：0512-66325740第 6 页 共 54 页直到所有的琼脂糖都溶解（大概要 5 分钟）；3. 取出纯化柱，将上述溶解液 转移至柱中

14、，室温下放置 2 分钟，8,000rpm 离心 1 分钟，弃 EP 管中的液体，将纯化柱放回 EP 管中；4. 加 500l 的 wash buffer 至柱中，8,000rpm 离心 1 分钟。弃管中的溶液；5. 重复操作 4 步的操作 1 次，最后将 纯化柱放入 EP 管中 10,000rpm 离心 30 秒，除去痕量的 wash buffer；6. 将纯化柱放入一个新的 EP 管。加 3040l H2O 或者 elution buffer 至纯化柱膜的中央，在 37或50下放置 2 分钟，10,000rpm 离心 1 分钟洗脱 DNA，将 EP 管中的 DNA 溶液放在-20 保存。7.

15、 注：若想要不电泳而直接纯化 DNA 溶液，只需要在第 2 步中按 100l 液量加 400l 的 binding buffer,其余的步骤不变。大肠杆菌质粒 DNA 的提取（碱裂解法）此方法适用于小量质粒 DNA 的提取提取的质粒 DNA 可直接用于酶切 PCR 扩增。1. 取 1.5ml 细菌培养物于 EP 管中，4000rpm 离心 1 分钟，弃上清液，使细菌沉淀尽量干燥；2. 将细菌沉淀重悬于用冰预冷的 100 l 溶液 I (50 mmol/L 葡萄糖，10 mmol/L EDTA pH 8.0，25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 中， 剧烈振荡；3. 加入 200

16、 l 新配制的溶液 II(0.2 mol/L NaOH，1SDS（m/v）)，盖紧 EP 管口，快速颠倒离心管 5次，以混合混合物，确保离心管的整个内表面与溶液 II 接触，不要 涡旋，置于冰浴中；4. 加入 150 l 预冷溶液 III(每 100 ml 的溶液 III 中含 60 ml 5 mol/L 乙酸钾，11.5 ml 冰乙酸， 28.5 ml H2O)，盖紧 EP 管口，反复颠倒数次，使溶液 III 在粘稠的 细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上 35 分钟；5. 在最大转速下离心 5min，取上清液于另一新 EP 管；6. 用两倍体积的乙醇室温沉淀双链 DNA，振 荡混合于室温

17、放置 2 分钟，最大转速离心 5 分钟；7. 小心吸去上清液，将离心管倒置于滤纸上，以使所有液体都流出，在将附于管壁的液滴除尽；8. 加 1ml 70乙醇洗涤沉淀，振 荡混合，用 12,000g 离心 2 分钟，弃上清，将开口的 EP 管置于室温使乙醇挥发，直至 EP 管中内没有可见的液体存在（510 分钟），用适量的 ddH2O 溶解；9. 用 0.5l 的 RNase 37温育 510 分钟；10. 电泳鉴定。乙醇沉淀 DNA1. 加入 1/10 体积的乙酸钠 （3 molL，PH=5.2）于 DNA 溶液中充分混匀，使其最终浓度为 0.3 molL；2. 加入 2 倍体积用冰预冷的乙醇混

18、合后再次充分混匀置于-20中 1530 分钟；3. 12,000 g 离心 10 分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；4. 加入 1/2 离心管容量的 70乙醇， 12000g 离心 2 分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；苏州市莱顿科学仪器有限公司 TEL：0512-66325740第 7 页 共 54 页5. 于室温下将开盖的 EP 管的置于 实验桌上以使残留的液体挥发至干；6. 加适量的 ddH2O 溶解 DNA 沉淀。酶 切1. 酶切前确定待切样品的浓度, 并选择合适的限制性内切酶和配套 Buffer。2. 在离心管中加入如下成分：10Buffer 1l 待切样品

19、xl酶 0.5-1l 加水补足 10l3. 混匀样品并短暂离心使样品沉于管底。4. 将离心管置于 37中温育 1-3hr，若待切样品为 PCR 产物，则可将反应时间适当延长。5. 用未酶切的质粒作为对照， 琼脂糖电泳鉴定酶切结果。注：当酶切样品用于回收而不是鉴定时，可按比例适当加大反应体积。双 酶切可选用二者活性都较高的 Buffer 或者通用 Buffer，但要注意不能有星反应。 ）连 接1. 连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度。2. 在离心管中加入如下成分：10连接 Buffer 1l 待连接的样品（胶回收产物或 PCR 产物，载体与片段的 mol 比为 13-5 ）连接酶 0.5-1

20、l 加水补足 10l3. 混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。4. 将离心管置于连接酶要求的温度孵育适当的时间（根据不同公司的酶的要求而定，一般为 22 1-3hr 或 16连接过夜）。连接完的样品可直接用于转化，也可放 4冰箱短期保存。感受态细胞的制备1. 挑取适当菌株的 E.coli 单菌落接种于 2ml SOB 培养液中，37摇床过夜。2. 取 0.5-1ml 过夜培养的菌液转种到 50ml SOB 中，18剧烈震荡，直到 A600 达到 0.6。3. 将培养物转移到 50ml 离心管中，4 4,000rpm/min 离心 10min。同时在冰浴上配置 TB 溶液。4. 弃上清，将离心

21、管倒置于 滤纸上，使培养液被吸干。5. 取 1ml 刚配的 TB 溶液打散菌体沉淀，再加入 15ml TB（1/3 体积的起始培养液），冰浴 10-15min，4 4,000rpm/min 离心 10min。6. 弃上清，沉淀重悬于 4ml TB（1/12.5 体积的起始培养液），冰浴 10min。7. 加入 280l DMSO，缓缓滴入并轻轻摇晃，使其充分混合均匀，冰浴 10min。8. 将菌液分装于 EP 管中，-80 或液氮冻存。苏州市莱顿科学仪器有限公司 TEL：0512-66325740第 8 页 共 54 页9. 取两管感受态细胞分别加入 1l无菌 ddH2O（阴性对照）和 1

22、l纯质粒（阳性对照）进行转化（见后），以检测感受态的质量。阴性对 照平板上应该无菌落生长，阳性对照平板上菌落数目的多少显示感受态效率的高低。SOB 的配制：蛋白胨 20g酵母提取物 5gNaCl 0.58gKCl 0.186g100Mg+溶液 10ml溶解并加水定容至 1L，12120min 高压蒸汽灭菌100Mg+溶液： MgCl26H2OMgSO47H2O溶解并加水定容至 100ml，12120min 高压蒸汽灭菌TB 溶液的配制：1M KCl 5ml0.55M MnCl2 2ml0.5M CaCl2 0.6ml0.1M K-Pipes(pH 6.7) 2mlddH2O 10.4mlTot

23、al 20ml注：上述溶液均需高压蒸汽灭菌处理0.1M K-Pipes(pH=6.7)的配制： 称取 3.02g Pipes 粉末溶于 80ml dd H2O 中，此时粉末不能完全溶解，用 10N KOH 或 KOH 固体调节 PH 值，只有当 PH 接近 6.7 时粉末才能完全溶解， 此 时当小心少量地加入 KOH 直至达到所需PH 值。转 化1. 取 100l感受态细胞于冰浴上融化。2. 加入 1l纯质粒或连接产物， 轻轻吹打混匀，冰浴 30 min。3. 将菌液放入 42水浴中热激 90 秒，立即放入冰浴中 2 min。4. 加入 0.9ml SOC，于 37恒温摇床上 200rpm1h

24、r 温育。5. 将菌液 4000rpm/min 离心 3min，留 200l上 清 将菌体打散，均匀涂布于含适当抗生素的 琼脂平板表面，平板于 37倒置培养过夜。i. 注：新倒的平板可于 37培养箱中预先放置数小时至过夜干燥。ii. 当转化的是 TA 克隆连接产物时可在菌液中加入 8l 1M IPTG 和 40l 20mg/ml X-gal 以苏州市莱顿科学仪器有限公司 TEL：0512-66325740第 9 页 共 54 页进行蓝白斑筛选。重组子的筛选和鉴定重组子可通过酶切进行鉴定，也可以利用 扩增引物通过 PCR 进行鉴定，阳性重组子能切出所需要的片段或得到相应片段的 PCR 产物。

25、1. 用牙签挑取平板上的菌落接种于 2ml 含适当抗生素的 LB 培养基中，37摇床培养过夜。2. 次日取菌液 0.2-0.5ml，13,000rpm3min 离心，弃上清，加入 20l ddH2O 和 20l 酚/氯仿，震 荡混匀，13,000rpm5min 离心。3. 取上清进行琼脂糖电泳，加入 载体质粒 DNA 作为阴性对照，根据质粒大小初步筛选重组子，重组子的泳动速度应该慢于载体质粒。4. 用碱法小量制备可能是重组子的质粒 DNA。5. 选取适当的酶，对重组子 进行酶切分析， 酶切体积均为 10l 体系。酶切样品进行琼脂糖电泳鉴定是否有所需片段。6. 酶切分析正确的重组子分成两份，一份

26、 进行测序反应，另外一份保种。7. 若用 PCR 法鉴定，则在第 2 步时每个样本取 0.5-1.0l 菌液为模板进行 PCR 反应，每管反 应体系最低可少至 10l，PCR 产物电泳，能得到所需条带的样本进一步提取质粒酶切鉴定或送样品测序。真核细胞的转染该操作以 Invitrogen 公司的脂质体转染试剂 LipofectAMINE 为例，其它转染试剂可参照各自的使用说明书进行。1. 在 6 孔板中接种 1-3105细胞/孔，加入 2ml 完全培养基，置 CO2 孵箱中 37培养过夜。2. 待细胞长到 50-80%单层时，在无菌离心管中配制如下溶液：i. 溶液 A：将 1-2g待转染的超纯

27、DNA 稀释到 100l无血清培养基中ii. 溶液 B：将 2-25l LipofectAMINE 稀释到 100l无血清培养基中3. 混合溶液 A 和 B，轻轻混匀，室温放置 15-45min。4. 用 2ml 无血清培养基轻轻洗涤细胞，加入 0.8ml 无血清培养基/ 孔，将脂质体复合物滴加到孔中，轻轻摇晃混匀，置 CO2 孵箱中 37孵育 2-24hr。5. 用完全培养基替换转染液， 继续培养。6. 24-72hr 后检测蛋白质的表达或传代并加入选择性抗生素以 筛选稳定表达株。转染细胞的稳定筛选1确定抗生素作用的最佳浓度：不同的细胞株对各种抗生素有不同的敏感性，因此在筛选 前要做预试验，

28、确定抗生素 对所选择细胞的最低作用浓度。1) 提前 24 小时在 96 孔板或 24 孔板中接种细胞 8 孔，接种量以第二天长成 25%单层为宜，置CO2 孵箱中 37培养过夜。2) 将培养液换成含抗生素的培养基，抗生素浓度按梯度 递增（0, 50, 100, 200, 400, 600, 800 和苏州市莱顿科学仪器有限公司 TEL：0512-66325740第 10 页 共 54 页1000g/ml）。3) 培养 10-14 天以绝大部分 细胞死亡浓度为准,一般为 400-800g/ml,筛选稳定表达克隆时可比该浓度适当提高一个级别维持时使用筛选浓度的一半.2转染按前面的步骤进行。3转

29、染 72 小时后按 1:10 的比例将转染细胞在 6 孔板中传代，换为含预试验中确定的抗生素浓度的选择培养基。在 6 孔板内可见单 个细胞， 继续培养可见单个 细胞分裂繁殖形成单个抗性集落，此时可用两种方法挑选单克隆。1) 滤纸片法：用消毒的 5x5mm 滤纸片浸过胰酶,将滤纸片 贴在单细胞集落上 10-15 秒，取出粘附有细胞的滤纸片放于 24 孔板中继续加压培养。 细胞在 24 孔板中长满后转入 25cm2 培养瓶中,长满后再转入 75cm2 培养瓶中培养。2) 有限稀释法：将细胞消化下来后做连续的 10 倍稀释（10 -210-10），将每一稀 释度的细胞滴加到 96 孔板中培养，7-1

30、0 天后，选择单个克隆生长的孔再一次进行克隆。4. ELISA 或 Western blot 检测单克隆细胞中外源蛋白的表达情况由于不同克隆的表达水平存在差异因此可同时挑选多个克隆选择表达量最高的克隆传代并保种。 重组蛋白质的表达、纯化、复性和定量按 Qiagen 公司的操作手册进行，具体步骤如下。一、重组蛋白质的诱导表达1. 挑取转化有质粒的单菌落，接种于 3ml 选择性 LB 液体培养基中，37 oC，250 rpm/min 振摇培养过夜。2. 次日将培养过夜的菌液 500 l 再接种于 10 ml（1:20）选择性 LB 液体培养基中， 37 oC，250 rpm/min 振摇培养至光密

31、度（OD 600=0.6）时，取 1 ml 样本作为诱导前标本，10000g 离心 1 min 收集菌体沉淀，20 oC 冻存备用。3. 加入 1 mol/L IPTG 于菌液中，使 IPTG 终浓度为 1 mM，37 oC，250 rpm/min 振摇培养 45 小时。取 1 ml 样本作为诱导后标本，同上法收集菌体沉淀，20 oC 冻存备用。4. 将诱导前后菌体沉淀用 20 40 l PBS（pH= 8.0）重悬 ，加入等体 积的 2SDS 上样缓冲液，煮沸加热 5 min，SDS 聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离，考马斯亮蓝染色 3 小时后，脱色观察结果。5. 选取诱导成功的细菌克隆， 扩大诱导规模，收集菌体沉淀，于20 oC 保存，准备做下一步分析及纯化。二、重组蛋白质的分离纯化重组蛋白质的可溶性鉴定1. 将按上法诱导培养后收集的菌体重悬于裂解液 1 (Lysis buffer under native conditions )中，然后在80 oC 低温冰箱中放置 10 min。2. 冰中解冻。3. 在冰浴上用超声破碎仪破菌 6 次，每次 10 sec，间歇 10 sec，电压 200-300 V。