1、,第二章电离辐射的分子生物学效应,第一节 DNA的电离辐射效应,辐射所致DNA损伤的类型：,DNA链断裂、DNA 碱基损伤、DNA交联,一、DNA链断裂,单链断裂（single strand break，SSB)双链断裂（double strand break， DSB).,一、DNA损伤的种类,DNA链断裂单链断裂（SSB）,双链断裂（DSB）,DNA交联 DNA链交联,DNA-蛋白质交联,DNA二级和三级结构的变化,其中DSB是辐射所致生物学效应中最重要的原初损伤，而非重接性的DSB则被认为是细胞杀伤效应的最重要的损伤。,DNA链断裂（DNA strand break),单链断裂（sing
2、le strand break，SSB)：DNA双螺旋,结构中一条链断裂,双链断裂（double strand break，DSB)：DNA双螺,旋结构中两条互补链于同一对应处或相邻处同时断裂,单链断裂,双链断裂,1.DNA链断裂的分子机制,（1）脱氧戊糖和磷酸二酯键的破坏（直接）,三种自由基：eaq-，.OH，H.,DNA链断裂主要与.OH作用有关，从脱氧戊,糖抽氢，形成了5中不同的反应产物。,.OH从脱氧戊糖中抽氢，主要作用于C(3，5），C（3)上磷酸二酯键断裂多余C（5）端。,.OH攻击糖基C(1、2、4)形成碱不稳定性位点（alkali labile sites,ALS），这些位点在
3、碱处理后发生链断裂。,碱不稳定性位点（ ALS）,.OH对C（1）， C（2 ）， C,（3）， C（4）攻击后的产物，在与,六氢吡啶供热后都能导致DNA链的断裂。所以，在DNA链上含有损失后经碱处理后导致DNA链断裂的位点，这些位点称为碱,不稳定性位点（ ALS）,（2）碱基损伤 (base damage),1、充氧溶液中碱基损伤,嘧啶碱：羟自由基攻击5、6位,腺嘌呤：羟自由基攻击8位,鸟嘌呤：羟自由基攻击4、5、8位,2、细胞中碱基损伤,进展不大，用电子自旋共振仪,酶敏感位点(enzyme sensitive sites，,ESS）：碱基损伤可引起DNA双螺旋的局部变性，特异的核酸内切酶能
4、识别和切除这种损伤，并通过酶的作用，产生链断裂。这种特异性酶敏感位点称为ESS。,无嘌呤或无嘧啶位点,（apurinic/apyrimidinic sites ， APS）：DNA链上损伤的碱基可被特异的DNA糖基化酶除去或由于N糖基键的化学水解而丢失，形成,APS。形成APS在内切酶的作用下形成链断裂。,2.DNA链断裂的主要特点,1)单链断裂与双链断裂的比值,DSB约为SSB的1/101/20,SSB由一个自由基攻击引起。,DSB必须由两个以上自由基引起。,一定能量的射线所产生的SSB和DSB有一个大致的比值，但比值不是恒定的。,2）LET对链断裂的影响,各种射线对链断裂效应的顺序：,中子
5、射线、紫外线,SSB与DSB的比值与LET的高低有关。随着LET的升高，SSB减少，DSB增多。,3）氧效应对链断裂的影响,氧效应可增加链断裂的程度：,主要原因是氧效应可增加羟自由基的产生。,4）DNA链发生的部位,剂量不同，DNA碱基发生断裂的概率亦不同。当剂量10Gy照射时，碱基断裂顺序GATC。,当剂量 4080Gy照射时，碱基断裂顺序TGAC。,5）DNA链断裂与细胞辐射敏感性,DNA的断裂程度与辐射敏感性有关。,不同哺乳动物细胞对辐射的敏感性有很大差异，平均致死剂量（D0）亦不同。,DNA自然断裂的发生,通常情况下DNA断裂的本底水平可达总DNA的百分之几。一般方法难以测量，常引入凝
6、胶模块的方法来解决。,DNA交联（DNA cross-linking),交联种类,1、链间交联：DNA双螺旋结构中，一条链上的碱,基与其互补链上的碱基以共价键结合。,2、链内交联：DNA分子同一条链上的两个碱基相,互以共价键结合,3、DNA蛋白质交联（DNA-protein cross-linking ，DPC）：DNA与蛋白质以共价键结合,1.DNA-Protein cross-linking（DPC),1DPC存在的证据,小牛胸腺脱氧核糖核蛋白(DNP)在UV或射线照射后，其中DNA的不能被提取的部分随着照射剂量的增加而增多，但如果用胰蛋白酶处理，则观察到这部分DNA 。这是因为UV和射线
7、照射导致了DNA与核蛋白的交联，影响了DNP中DNA的提出，胰蛋白酶能够裂解DNA与蛋白质之间的共价键，消化DNP中的蛋白质部分所以全部DNA都能被提取出来。,2、DPC形成的分子机制,羟自由基有关（OH),DNA与蛋白质之间形成共价键的分子机制,1）辐射后蛋白质中的含硫氨基酸形成了自,由基。,2）蛋白质中的芳香族氨基酸形成酚型或酚氧型自由基，这类自由基在DPC中起着主要作用。,3、影响DPC形成的因素,氧效应：如：紫外线O2DPC,射线O2DPC,温度： 孵育（45）照射DPC,特别是肿瘤细胞，已用于临床,染色质的状态：染色质结构愈紧，愈容易交联。,细胞的不同周期，DPC不同。S期交联,最多
8、，G1,G2期很少,4、体内DPC形成时DNA和蛋白质的选择性,DNA的选择性：具有转录活性的DNA。此处易发生SSB,单修复也快。,蛋白质的选择性：组蛋白、非组蛋白、调节蛋白、拓扑异构酶以及与复制转录有关的核基质蛋白。,组蛋白中H3H4H2AH2B,2.DNA-DNA链间交联,在放射生物学中研究DNA-DNA链间的交联的报道较少。,在干燥及含25%水的DNA中链间断裂占优势；随着水分子的增加DNA链断裂生成率上升，而链间断裂下降。,DAN 链间交联多见于化学损伤，如氮芥、硫芥等；放射损伤时较少见到。,放射损伤时，DNA链间交联与链断裂相互竞争。,3.DNA链内交联,多见于紫外线照射，电离辐射
9、较少,二聚体形成是紫外线照射后胸腺嘧啶自由基加合而成；是紫外线照射引起DNA的特征性改变。在DNA接近其最大吸收波长260nm,相邻的嘧啶碱基共价交联形成环丁烷四元环嘧啶二聚体,此反应是可逆的。,分布是非随机性的，相邻的两个T、或两个C、或C与T间都连成二聚体，其中最容易形成的是TT二聚体,DNA 二级和三级结构的变化,DNA变性：DNA双螺旋结构解开，氢键断裂，克原子磷消光系数显著升高，出现了增色效应，比旋光性和粘度降低，浮力密度升高，酸碱滴定曲线改变，同时失去生物活性。,1.增色效应和Tm值,Tm ：将DNA克原子磷消光系数（P）值达到,最高值1/2时的温度称之为熔解温度（Tm),增色效应
10、：随DNA变性程度的增加，其克原子,磷消光系数值增大，这种现象称增色效应。,r射线照射后的特点：,1、Tm值,2、增色效应有限，与链间交联有关,2.旋光色散（optical rotatorydispersion,ORD)和圆二色性：,DNA的ORD光谱在228和229nm波段有高峰，在257nm有低谷。,照射后，228和257nm发生与剂量呈线性的变化粘度：随剂量的增加，粘度降低。,3. 粘度,DNA溶液粘度的改变可反映出DNA结构的改变。,二、DNA损伤的修复,亚致死损伤修复（sublethal,damage,repair,SLDR）：将预定的照射剂量分次给予，生物效应明显减轻，表明在两次照
11、射间隔中细胞有所修复，这种修复称作SLDR。潜在致死性损伤修复（potentially lethaldamage repair, PLDR)：照射后改变细胞所处的状态和环境，如延长接种或给予不良的营养和环境条件，均能提高存活率。,不同类型DNA损伤的修复,1、DNA单链断裂的修复,绝大多数正常细胞都能修复单链断裂DNA修复与时间呈指数关系，修复速率依赖于温度与SLDR有关,2、DNA双链断裂的修复,断裂后即刻，细胞内酶修复系统启动。修复速率的快慢与水平的高低直接决定损伤的残留以及细胞的转归。（部分修复：早期修复快，随后修复的慢）与PLDR有关,3、碱基损伤的修复,种类多，分析较困难, 以嘧啶二
12、聚体为模型，能修复但只,能部分修复。,4、DNA修复合成,DNA期外合成或程序外DNA合成,（unscheduled DNA,synthesis,UDS）：DNA合成适于损,伤后即刻，随时间延长而增加，但与细胞周期没有关系，是一种修复合成。,DNA的损伤修复机制,1、回复修复,细胞对DNA的某些损伤可以用很简单的方式加以修复在单一基因产物的催化下，一步反应就可以完成。这种修复方式叫回复。,1）酶学光复活,光复活酶或DNA光解酶,它的作用分成三个步骤：酶与DNA中的二聚体部位相结合；吸收波长为260380 nm的近紫外光，酶被激活，使二聚体解聚；酶从DNA链上释放，DNA恢复正常结构。,2）DN
13、A单链断裂重接,DNA单链断裂中有一部分是通过简单的重接而修复的，只需要一种酶DNA连接酶(ligase)参加，因此也属于直接回复。,DNA连接酶能催化DNA双螺旋结构中一条链缺口处的5磷酸根与相邻的一个3羟基形成磷酸二酯健。连接所需的能量ATP(如动物细胞)。,3）嘌呤的直接插入,嘌呤插入酶,受损嘌呤APS 插入嘌呤（糖苷键）,K+,糖基化酶 嘌呤插入酶,2、切除修复将损伤的部位（或连同其附近的一定部位）切除，然后用正确配对的、完好的碱基替代修复。有多种酶和基因参与过程：识别（损伤位点 切除修复（补）连接,DNA连接酶,酶和蛋白质 DNA聚合酶,两个特点:准确、正确修复。,1)碱基切除：,特
14、点是切除受损伤的碱基。主要过程是水解受损伤的碱基与脱氧核糖磷酸链之间的N糖苷键。反应由一类糖基化酶催化。,也即：糖基化酶APS内、外切酶去除残基。,整个修复过程可分以下几步。,2）核甘酸切成（一段寡核苷酸）,首先由一个酶系统识别损伤；,然后在损伤两侧各水解一个磷酸二酯键；释放出一段寡核苷酸；填补缺损区,连接酶重新完成连接。,3、多聚ADP-核糖的作用,ADP核糖基多聚物的形成与存在是提高连接酶活性的重要因素，在DNA损伤修复,过程中起着重要作用。,4、损伤的“耐受”,DNA分子的损伤有时不能立即修复。特别是在复制已经开始，而损伤又在复制叉附近时，细胞会通过另一些机制，使复制能进行下去，待复制完
15、成后，再通过某种机制修复残留的损伤。复制时损伤并未消除，故称,“耐受”。,包括重组修复（复制后修复）、SOS修复,1）、重组修复,当DNA双链发生严重损伤时需要另一种机理来完成正确的修复。一种情况是两条链同时受到损伤；另一种情况是单链损伤尚未修复时发生了复制，造成对应于损伤位置的新链缺乏正确模板；此时需要重组酶系将另一段未受损伤的双链DNA移到损伤位置附近，提供正确的模板，进行重组。这便是重组修复。,2）SOS修复,细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制，产生一种调控信号，解除对许多基因的抑制，这些基因的产物参与修复过程。,SOS修复过程是在损伤信号诱导下发生的，又称可诱导的DNA修复。,修复过
16、程容易发生错误，故又称易错修复。,4、错配修复,错配修复是生物维持生命、保持物种稳定的种重要功能。从细菌、酵母直至哺乳动物都普遍具有此修复机理。,在修复、重组的过程中或外界损伤因子的作用下都有可能发生错配。在修复过程中首先要识别错配碱基对。,然后需要分辨错配的哪一侧属于母链，哪一侧属于新合成的错误链。最后修复。,错配纠正过程是很复杂的，至少需要10种活性因子参加。,基因组修复的不均一性,特点,1）转录活性DNA修复优于静止的基因2）转录链优于非转录链修复与转录偶联,1、重复序列中的DNA修复,灵长类细胞基因组中存在一种高度重复顺序，在非洲绿猴细胞中此顺序占总DNA的15一,20，碱基组成与总D
17、NA相近，长度为172bP，没有转录功能。,2、活性基因中的修复,活性基因片段中二聚体的清除非常活跃，如紫外线照射(20J2/M2)后8小时，已清除47%左右。,3、活性基因中转录链的修复,转录链优先修复，其机制以转录修复偶联因子的作用解释。,DNA修复基因,1、原核细胞的修复基因占基因组总量1。,2、酵母有三组RAD基因（radiation,sensitive 的前三个字母）,3、人类基因：1）XRCC （X-ray repaircross complementing）基因；2）ERCC,三、DNA损伤与修复的生物学意义,DNA结构的完整与稳定在生物学上有着特别重要的意义。,在射线作用下，D
18、NA碱基的损伤或脱落改变了密码，引起基因的突变。导致细胞的突变或转化。双链DNASSB能迅速修复，DSB经原位重接很少，重组修复则易发生染色体畸变。,DNA交联会影响核小体及更高层次的染色质结构，影响复制。,活性染色质的破坏影响基因的表达和调控。,与DNA损伤修复有密切关系的另一个因素是真核细胞的染色质结构。而染色质包括：DNA、组蛋白、非组蛋白及少量RNA。,1.染色质2.核小体,常染色质:异染色质:,活性染色质非活性染色质(染色体),四、染色质损伤对DNA辐射效应的影响,一、染色质的辐射敏感性,染色质（chromatin)：真核细胞间期的核中DNA、组蛋白、非组蛋白以及少量RNA所组成的复
19、合体。,染色体（chromosome）：有丝分裂期，染色质的细纤丝高度压缩，浓集成为光学显微镜下能看到的深染的结构。,染色质和染色体是细胞周期中不同的时期的两种不同形态，化学本质是相同的。,1、染色质的结构与分类,染色质是由核小体的重复亚单位连接而成串珠,状结构。,核小体由直径为10nm5.5nm的组蛋白核心和盘绕于此核心之外的DNA构成,组蛋白H2A，H2B，H3，H4各两分子组成八聚体蛋,白，外绕DNA长约200个碱基对,140个碱基对形成超螺旋结构，60个为连接区。,H1在连接区连接两个核小体，起稳定作用,常染色质与异染色质（eu-chromatin &hetero-chromatin）
20、,常染色质纤丝折叠疏松，在细胞分裂间期着色微弱，其中含有单一和重复顺序的DNA，能进行转录。,异染色质纤丝折叠紧密、在细胞分裂间期着色深，也含有重复和非重复顺序的DNA，但都不能转录。,随体DNA(Satellite DNA）往往含有高度重复序,列，聚集于异染色质区，靠近着丝点。,常染色质和异染色质在化学性质上没有什么差别，而可能是由于DNA核苷酸顺序和折叠不同，导致染色质以两种不同状态存在。,活性染色质(active chromatin)：具有,转录活性的染色质,非活性染色质(inactive chromatin)：,不具有转录活性的染色质,2、核小体连接区的辐射效应,1、是合成RNA引物的
21、起始部位，前者是DNA复制,的起始步骤,2、连接区DNA是组蛋白H1的结合部位，组蛋白H1,的磷酸化与细胞分裂启动有关。此区受辐射作,用使H1的磷酸化受抑制，影响细胞分裂。,3、连接区DNA易受DNase的攻击。受照后更易。4、DNA修复合成从连接区开始,故连接区受到辐射后，意义更大！,3、染色质紧密程度对辐射敏感性的影响,4、活性染色质与非活性染色质的辐射敏,感性,二、染色质的辐射降解,1.机制,2.组织的辐射敏感性与复赛中降解程度3.蛋白酶在染色质降解中的作用,4.核酸酶在染色质自身消化中的作用,三、染色质蛋白的辐射效应,1.组蛋白的辐射效应,2.非组蛋白的辐射效应,第五节细胞通信和细胞信
22、号转导的电离辐射效应,第五,蛋白质和酶的辐射生物效应,一、辐射对蛋白质和酶的结构和功能的影响,1、蛋白质的一级结构（primary stucture),肽键,1、多肽链的氨基酸残基的排列顺序2、基因上遗传密码的排列顺序决定的3、通过肽键连接,即：每一种蛋白质分子都有自己特有,的氨基酸的组成和排列顺序即一级结构，由这种氨基酸排列顺序决定它的特定的空间结构，也就是蛋白质的一级结构决定了蛋白质的二级三级等高级结构，这就是荣获诺贝尔奖的著名的Anfinsen 原理。,蛋白质二级结构（secondary structure）,多肽链借助于氢键沿一维方向排列成具有周期性结构的构象，是多肽链局部的空间结构（
23、构象），主要有螺旋、折叠、转角等几种形式，它们是构成蛋白质高级结构的基本要素。,三级结构（tertiary structure）主要针对球状蛋白质而言是指整条多肽链由二级结构元件构建成的总三维,结构，包括一级结构中相距远的肽段之间的几何相互,关系,骨架和侧链在内的所有原子的空间排列。,球状蛋白质，侧链基团的定位是根据它们的极性,安排的,蛋白质特定的空间构象是由氢键、离子键、偶极,与偶极间的相互作用、疏水作用等作用力维持的，疏,水作用是主要的作用力。,有些蛋白质还涉及到二硫键。,四级结构（quaternary structure）,四级结构是指在亚基和亚基之间通过疏,水作用等次级键结合成为有序排
24、列的特定的,空间结构。,亚基通常由一条多肽链组成，有时含两条以上的多肽链，单独存在时一般没有生物活性。,1、辐射对蛋白质结构和功能的影响,一级结构主要是肽键断裂，其次巯基氧化、,二硫键还原、旁侧羟基被氧化等。,高级结构主要是肽键氢键、侧链氢键、,离子键和疏水键的改变。,一级结构的改变必然影响高级结构，导,致蛋白质的功能改变，酶活性改变。,二、辐射对蛋白质和酶生物合成的影响,DNAmRNAProtein,辐射对DNA复制和转录的影响均可不同程度的影响蛋白质合成，对其翻译过程产生效应。,抑制与激活并存,三、辐射对蛋白质分解代谢的影响,分解代谢增强：IR细胞溶酶体破坏组织蛋白酶释放Pr降解, 蛋白质代谢产物, 如：尿中肌酸、牛黄酸、尿素等,复习与思考,了解：2、4、5节熟悉：3和6节掌握：1节,名词解释：DNA链的断裂与交联，回复修复，重组修复，,SOS修复，原癌基因，肿瘤抑制基因,思考题,1、试述辐射引起DNA链断裂的特点及其分子机制。2、影响DNA蛋白质交联的因素有哪些？3、试述辐射引起DNA损伤的生物学意义。4、试述回复修复的种类及机理。,7、目前在辐射致癌的分子机制中，初步认识到的有哪几点？,
