1、1互助县温室大棚黄瓜白粉病病原菌分子鉴定及防治技术摘 要：为明确青海互助县温室大棚黄瓜白粉病病原菌的分类，随机调查种植黄瓜的日光温室，采集发病的植株组织，对白粉菌进行无性型扫描电镜观察和 DNA 提取。试验结果发现，互助县温室大棚内白粉菌为苍耳单囊白粉菌，生产中仍以化学防治为主，可结合高温闷棚灭菌。 关键词：黄瓜白粉病;分子鉴定;电镜扫描;防治技术 青海互助县位于青藏高原地区，海拔较高、降雨量少、昼夜温差大、日照时间长、气候冷凉1。由于近年来青海省城市化进程加快，日光温室大面积兴起，温室蔬菜的生产发展非常快，其中黄瓜因产量较高、采收期短、经济效益好，被菜农广泛种植。白粉病是黄瓜上常发生的一种病
2、害，也是一种世界性病害，一般在黄瓜生长后期发生严重，严重影响黄瓜的生物学产量及质量。目前关于瓜类白粉菌的分类一直存在争议，为明确黄瓜白粉菌的分类地位，为互助县黄瓜白粉病的防治及更深入的研究提供材料，对互助县温室大棚黄瓜白粉病病原菌进行分子鉴定。 1 材料与方法 1.1 黄瓜白粉菌标本的采集 对互助县种植黄瓜的日光温室进行随机调查，观察白粉菌在黄瓜植株上寄生的形态，并对白粉菌进行采集。 1.2 黄瓜白粉菌分子鉴定方法 2白粉菌无性型扫描电镜观察 根据 Cook 等 2的研究，对黄瓜白粉菌无性型进行固定，然后扫描电镜观察其分生孢子梗和分生孢子特征，以便进行分子鉴定。 a.固定。将被白粉菌侵染的植株
3、组织切成小块（4 mm4 mm）放入盛有戊二醛 （浓度 4%，pH 值 6.8）固定液的小瓶中，贴上标签，注明采集信息。 b.抽气。将上一步装样的小瓶置于真空干燥仪中抽干空气，至叶片组织完全沉到小瓶底部。 c.制样 （漂洗、脱水和干燥） 。首先用 pH 值 6.8、0.1 moL/L 的磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗，共进行 3 次，每次 20 min;然后用30%、50%、70%、90%、100%酒精进行梯度脱水，每次 20 min，其中 100%酒精中脱水 2 次;最后用 100%的乙酸异戊酯置换 2 次，每次 20 min。 将制备好的白粉菌无性型样品送至西北农林科技大学扫描电镜观察室观察、
4、摄像。 黄瓜白粉菌基因组 DNA 提取。a.将菌丝体刮下置于 1.5 mL 离心管，充分研磨，加 600 L CTAB 提取液混匀，于 6065水浴中温育 12 h。 b.加入等体积（600 L）的 Tris 饱和酚氯仿异戊醇（25241）振荡器离心管混匀，离心 10 min （12 000 r/min） 。 c.取上清液置于新离心管中，加等体积的氯仿异戊醇（241）于3振荡器混匀，然后离心 10 min （12 000 r/min） 。 d.取上清液，加入 2 倍体积的 CTAB 沉淀液，混匀，室温孵育 2030 min，室温离心 15 min（12 000 r/min） 。 f.弃上清液，
5、加 350 L 1.2 mol/L NaCl 溶液（即 DNA 溶解液）溶解沉淀，然后加入 350 L 氯仿，混匀 30 s。 g.离心 10 min（ 12 000 r/min） ，分层，将上清液移至一新的离心管中，加入 0.60.8 体积的异丙醇，混匀，室温静置 40 min。 h.室温离心 20 min（12 000 r/min） ，向沉淀加入 500 L，70%乙醇，混匀。 i.离心 5 min（12 000 r/min） ，小心仔细倒入上清液，弃之。 j.重复步骤 i，室温干燥后，将 DNA 溶于 40 L 去离子无菌水中，于 4保存备用。 PCR 扩增 PCR 扩增引物参考 Whi
6、te 等3的方法，送上海生物工程有限公司合成。 a.rDNA-ITS PCR 引物序列。ITS1：5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，ITS4：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 b.PCR 扩增体系。见表 1。 c.PCR 反应程序。95预变性 4 min，94变性 1 min，5460退火 1 min，72延伸 1 min，共 35 个循环;72再延伸 8 min;4保存。 测序分析 将 PCR 产物送至上海生工公司进行测序，测序结果在NCBI 上进行 BLAST 同源性对比，找出最相似的序列。利用软件 Mega 4.04构建系统发育树，并对序列结构及序列间亲缘关
7、系进行分析。 2 结果与分析 2.1 为害症状 白粉病主要为害黄瓜的叶片、叶柄及茎，一般不为害果实，成株及幼苗均可染病。发病叶片正面或背面产生白色近圆形的小粉斑，即稀疏的菌丝，然后菌丝不断生长，病部变黄，粉斑逐渐扩大成边缘不明显的大片白粉区，布满叶面，叶面褪绿、枯黄变脆，直至整个叶片枯死。茎部受害症状与叶片相似。粉层严重会影响光合作用，使植株正常新陈代谢受到干扰，造成早衰，产量受到损失。本次试验观察采集时只发现了白粉菌的无性型即只具有分生孢子，未发现病菌的有性型即闭囊壳。 2.2 分生孢子形态鉴定 粉孢属：菌丝体叶两面生，在叶面居多，形成白色无定形的斑片;在电镜下分生孢子串生，柱形、桶形， （
8、1830）m（917）m;分生孢子梗直， （3580）m（510）m。 2.3 rDNA 序列分析 黄瓜白粉菌的 rDNA-ITS 区段测序均测出，长度为 394462 bp，平均长度 429 bp，平均 GC 含量 53.2%。rDNA-ITS 序列共 544 个位点，其中保守位点 267 个、变异位点 194 个、简约信息位点 145 个、自裔位点48 个，变异位点和和信息位点分别占全序列的 45.2%和 33.8%。经 BLAST同源性比较，验证所测序列是否为目的序列。将所测出的目的序列和参比序列用 ClustalX（version l.8）进行序列对准，删除缺失位点、残缺位点、非编码序
9、列位点并用 BioEdit 人工调整后，利用 MEGA 4.0 对 rDNA5序列进行多重比对分析，去除过短序列或混杂序列。 采用了邻近结合法 （neighbor-joining，NJ）构建系统发育树，利用 MEGA 4.0 4软件选基于 Kimura-2-Parameter 双参数模型，并对所构建的系统发育树进行自举分析（bootstrap，重复 1 000 次） ，以估算分枝的支持率。rDNA-ITS 系统发育 NJ 树显示（图 2） ，本次试验采集的白粉菌与单囊白粉菌属下的各种一起聚集在单囊白粉菌属下，与苍耳单囊白粉菌 Podosphaera xanthii 的相似度极高，自展值为 99
10、，证明为同种。该研究最终证明分子系统发育与形态学鉴定分类结果相一致，也证实了国际白粉菌分类理论与方法的合理性58。 2.4 防治方法 白粉病病菌多以菌丝体、分生孢子在病株残体或杂草上越冬，分生孢子萌发适宜温度为 2025，若湿度大，温度为 1624时，此病最容易发生，病菌靠气流传播，条件适宜时，反复侵染，扩大为害。白粉病病菌在 30以上会失去活力，可根据此特点进行高温闷棚灭菌和药剂防治。在白粉病多发的棚室，于定植前每 100 m2 用 250 g 硫酸加 500 g锯末混匀，点燃熏一夜;也可于白粉病发生前及初发期用 45%百菌清烟剂熏棚;白粉病发生后可采用 50%硫磺悬浮剂 250300 倍液
11、、15%粉锈宁可湿性粉剂 1 500 倍液、 30%特富灵（氟菌唑）可湿性粉剂 1 5002 000倍液等杀菌剂防治;也可用高锰酸钾 600800 倍液，每隔一周喷施 1 次，连喷 4 次;另外也可叶面喷施磷酸盐和钾盐溶液。 3 结论 本试验利用分子手段明确了寄生于互助县温室的黄瓜白粉菌为苍耳6单囊白粉菌 Podosphaera xanthii。就目前而言，防治方法仍以化学防治为主，并结合高温闷棚等物理措施。 参考文献 1 蒋贵彦，刘峰贵，张海峰，等.青海省气候因素与人口分布的定量研究J.国土与自然资源研究，2006（3）：25-26. 2 Cook R T A， Inman A J， Bil
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