1、基因芯片技术在心血管研究中的应用,绿色包装与生物纳米技术实验室,第一节 基因芯片技术概论,一、基因芯片技术的产生和发展二、基因芯片技术概论三、基因芯片制备技术四、基因芯片的检测方法,一、基因芯片技术的产生和发展,1986 Dulbecco在Science撰文 “肿瘤研究的转折点:人类基因组的测序”，提出全面解读人类基因组序列。1990.10 美国国家卫生研究机构率先启动人类基因组计划 实验方法和技术的产生 2003.4 人类基因组计划完成 后基因组时代,传统的方法：效率太低，无法满足后基因组研究的要求高效研究成千上万基因的功能需要高效的方法和工具,生物芯片技术始于20世纪80年代后期，将八聚体
2、寡核苷酸探针固定在尼龙膜上进行杂交， 但由于核酸在尼龙膜上容易扩散，因此在单位面积上的点样密度受到限制。同时滤膜面积较大而需要较多的探针量，故检测灵敏度较低，为了提高点样密度和灵敏度，降低探针用量，人们逐渐发现以玻璃、硅片等材料比传统的膜载体有无法比拟的优点，因此以此为材料的DNA芯片技术应运而生。,基因芯片发展历史,1991年，美国Affymetrix公司在玻璃片上原位合成世界上第一张寡核苷酸基因芯片。1995年，Stanford大学的P.Brown实验室发明了第一块以玻璃为载体的世界上第一张直接点样法制备的cDNA芯片。,基因芯片发展历史,1996 Chee et al：DNA测序1996
3、 Cronin et al：突变检测1996 Sapolsley & Lipshutz：基因图克隆1996 Shalon et al：复杂DNA样本分析1996 Shoemaker et al：缺省突变定量表型分析目前扩展的方法，包括蛋白芯片、组织芯片等,乳腺癌诊断组织芯片,蛋白质芯片示意图,Southern & Northern Blot,Dot Blot,Macroarray,Microarray,二、基因芯片技术概论,（一）基因芯片的概念 通过微阵列技术将大量特定的基因片段或寡核苷酸片段作为探针有序地和高密度地排列固定于玻璃或硅等载体上，然后与待测的有荧光标记的样品核酸按碱基配对的原理进
4、行杂交，通过激光共聚焦系统检测杂交信号强度。经计算机分析处理数据资料，获取样品数量和序列信息，从而可对核酸序列进行大规模、高通量的研究技术。,基因芯片原型,（二）基因芯片的工作原理 基因芯片的工作原理是根据碱基互补配对的原理，标记的待测样本DNA与芯片上特定位置的探针杂交，通过分析处理芯片的杂交检测图像确定靶DNA序列，这样就可对细胞和组织中大量的基因信息进行分析。,三、基因芯片制备技术,（一）原位合成的芯片 基于组合化学的合成原理，它通过一组定位模板来决定基片表面上不同化学单体的偶联位点和次序。 在片合成法制备DNA芯片的关键是高空间分辨率的模板定位技术和固相合成化学技术的精巧结合。,原位合
5、成方法的工作原理,Affymetrix公司研究组首次报道和采用合成高密度基因芯片,（二）直接点样法 首先按常规方法制备cDNA（或寡核苷酸）探针库，然后通过特殊的针头和微喷头, 分别把不同的探针溶液，逐点分配在玻璃、尼龙或者其它固相基底表面上不同位点,并通过物理和化学的结合使探针被固定于芯片的相应位点。,1. 探针的准备 根据实验的目的，选择相应的探针及种类，基因芯片的探针主要有寡核苷酸或cDNA。 对于寡核苷酸探针，探针的设计是很关键的一个环节，需要根据研究目的设计相应的探针序列，如SNP分析芯片，必须考虑待检测位点的序列和位置，需要严格控制探针的Tm值。如果用于表达谱的研究，目的基因的寡核
6、苷酸探针设计原则是尽量使探针与其他基因之间没有同源性，即探针的特异性要好。,对于cDNA芯片，需要预先克隆到大量目的基因的cDNA克隆，并经过测序验证。用PCR进行探针的扩增，经过纯化后，即可用于点样。,2玻片的表面修饰 对于DNA芯片，点样法所用载体多为玻璃片 在点样前，一般先对载体表面进行化学修饰(如多聚赖氨酸或硅烷偶联剂等)，使其表面富含氨基并带正电。修饰后的固相载体表面可利用静电吸附带负电的DNA探针，或通过双功能偶联试剂(如戊二醛)辅助形成共价化学键而连接。,3点样 (1)点样系统：点样系统又叫点样仪或机械手。在直接点样法中，采用的机械手有一套计算机控制的三维移动装置，包括装点样针的
7、点样头、机械手臂、点样针清洗系统、芯片载片台及计算机控制系统。,点样方式包括接触式点样(针点)和非接触式点样(喷点)。 针点是指用针通过直接接触介质表面将DNA样品点到介质上。 喷点是通过非接触式方式将DNA样品点到介质表面，通常是用加压的方法传递探针 。,针点法,喷点法,2)点样与点样后处理： 通常情况下，点样后处理包括水合、紫外交联、洗脱和封闭4个步骤。 水合的目的是保证样品与基片表面在溶液状态下充分反应。 紫外交联的目的则是让样品与基片表面形成的化学键能够吸收紫外线而变得更加牢固。,洗脱的目的是为了洗掉那些没有牢固结合的样品，以消除其在杂交过程中的影响。 封闭则是为了消除基片表面活性基团
8、与杂交液中的探针分子之间的非专一性相互作用而产生背景。,四、基因芯片的检测方法,（一）实验设计1.确定研究目标RNA检测：基因表达水平的研究DNA检测：SNP或突变分析、基因拷贝数研 究及DNA甲基化研究,2. 样本选择和设计(1)待测样本的选择：可以是组织来源的或血液来源的，也可以是培养的细胞或病人的体外分泌物等。(2)对照样本的选择：组织表达谱芯片一般选用正常的相同组织与病例组织作为对照。,基因芯片技术流程,（二）检测原理1. 用于RNA水平的大规模基因表达谱的研究 由于基因芯片在固定介质和标记染料方面的优势，可以实现同一张芯片上多种荧光标记。利用双色荧光系统，可以在一张芯片上实现待测样本
9、和对照样本靶序列的同时检测。,基因芯片对基因表达谱的分析,2. 检测DNA的结构及组成 基因芯片可以从不同的方面对DNA进行检测，如DNA的测序和再测序、DNA的甲基化检测、基于芯片的比较基因组杂合(CGH)技术等,第二节 基因芯片在心血管疾病基因组 学研究中的应用,一、基因芯片技术与心血管疾病致病基因或遗传易感性研究(一) 遗传标记（genetic marker ） 是指可遗传的并可检测的DNA序列,第一代遗传标记：限制性片段长度多态(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。凡是可以
10、引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和 一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP的产生。,限制性片段长度多态性,第二代遗传标记：微卫星标记（microsatellite，MS) 又称为短串联重复序列(simple tandem repeats，STRs)或简单重复序列（simple sequence repeats） 是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由26个核苷酸的串联重复片段构成，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，因此微卫星标记的应用非常广泛。,微卫星标记,第三代遗传标志：单核苷酸多态性标（sing
11、le nucleotide polymorphism, SNP） 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。,42,1.ATCCTGTACCTACGTGTACAATAGTA.CTGATCATCTCTATGGG.2.ATCCTGTTCCTACGTGTACAATAGTA. CTGATCATCTCTATGGG.3.ATCCTGTACCTACGTGTACAATAGTA.CTGATCAGCTCTATGGG.,1,2,3,SNP1,SNP2,单核苷酸多态性（SNPs）,SNP作为遗传标记的优势（1）SNP数量多，分布广泛，人类30亿碱基中共有300万以上的SNPs 。（2）SNP适
12、于快速、规模化筛查。 SNP一般只有两种碱基组成，所以它是一种二态的标记。 （3）SNP直接影响或决定疾病的发生。 研究SNP可以预测个人患病可能性，以及疾病预后、对药物作用的有效性,（二）HaplotypeMap（ HapMap）计划 单体型是指相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代。位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点的集合。,2002年10月28日，HapMap计划正式启动。这一项目旨在构建整个人类基因组DNA序列中多态位点的常见模式，至少对100万个SNP进行全基因组规模的基因分型。,HapMap的构建分为三个步骤：（a）在多个个体的DNA样品中鉴定单核苷酸多态性
13、（SNPs）；（b）将群体中频率大于1%的那些共同遗传的相邻SNPs组合成单体型；（c）在单体型中找出用于识别这些单体型的标签SNPs。通过对标签SNPs进行基因分型，研究者可以确定每个个体拥有的单体型。,（三）致病基因的遗传易感性研究,1. 群体关联分析,2. 家系连锁分析,（四）基因芯片技术是遗传分析的主要手段2007年Samani 等应用Affymetrix 500K SNP芯片, 对德国人心肌梗死家庭研究(GerMI)中875例心肌梗死病例和1644名对照进行基因型检测,发现了除9p21区域的位点rs1333049外的6个与冠心病显著关联的位点。,aley等利用含8600个DNA/ES
14、T的微阵列，对肿瘤坏死因子刺激的人主动脉血管平滑肌细胞及粥样硬化的主动脉进行了检测。发现新的化学因子eotaxin及其受体CCR3的表达与动脉粥样硬化的关系极其密切 。,二、基因芯片技术与心血管疾病转录组学研究 对来源于不同个体、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同病变、不同刺激（包括不同诱导、不同治疗阶段）下的细胞内的mRNA或逆转录后产生的cDNA与表达谱基因芯片进行杂交，可以对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断，迅速将某个或几个基因与疾病联系起来，极大地加快这些基因功能的确立，同时进一步研究
15、基因与基因间相互作用的关系。,总体的研究思路:利用表达谱芯片技术鉴定出参与疾病发展过程中的关键的基因表达，然后通过基因功能的各种研究方法如基因敲除、中和抗体等技术来证明关键基因在疾病发生、发展中的功能。,Rysa等 以含4 000个CDNA/表达序列标签(EST)微阵列检测自发性高血压引起的进行性左心室肥大小鼠心室基因表达，证实了进行性左心室肥大与收缩蛋白和利钠肽基因的表达增高有关。并对20个月和12个月的自发性高血压小鼠心室基因表达进行了比较，发现了有92个已知基因和35个EST表达有差异，其中的上调基因主要编码细胞结构和信号蛋白，大多数的下调基因则编码与脂肪酸和能量代谢相关的蛋白质。,Li
16、tvin等通过下腔静脉造瘘造成小鼠因体积负荷而导致心肌肥大，用Afymetrix基因表达芯片检测心肌中PLF基因家族的表达水平，发现在心肌肥大的过程中其表达水平升高，而通过手术降低负荷后其表达水平则下降，表明心肌肥大的发展与PLF基因家族的表达水平有关，从而为心肌肥大的基因治疗提供了可能。,三、基因芯片技术与心血管疾病药物基因组学研究,（一）药理研究中的应用 推测药物作用机制及靶点（二）毒理研究中的应用,四、基因芯片技术与心血管疾病个性化用药研究,（一）高血压的药物个性化治疗1.AGT基因多态性与降压疗效：用血管紧张素转换酶抑制(ACEI)卡托普利、依那普利、赖诺普利和培垛普利研究的抗高血压药
17、物疗效，发现T/T、T/M基因型患者治疗后的血压下降比M/M基因型患者显著。2.ACE基因多态性与降压疗效: 福辛普利降低收缩压及舒张压的作用，在D/D基因型高血压患者较I/I型、I/D型患者更明显 。,3. ATR基因多态性与降压疗效：AT1 R基因多态性(A1166C)与ACEI类药物的降压疗效相关，且此相关性在老年患者和超体重患者中尤为明显。4.利尿药的疗效: ACE和-adducin的基因多态性对利尿药的降压效果有影响；同时携带ACE的I型等位基因及-adducin的Trp460等位基因的患者，氢氯噻嗪的疗效最好。而携带ACE的D/D等位基因及-adducin的Gly/Trp等位基因的
18、患者，治疗后血压下降最少。所以联合分析ACE和-adducin的两个基因多态性有助于预测利尿剂的疗效。,(二)脂质代谢异常的药物个性化治疗 1.影响药代动力学的基因变异 在药物代谢酶中,CYP2D6 及CYP2C9 的基因多态性对药物治疗的疗效及不良反应的影响受到广泛关注。如根据CYP2D6 基因的多态性将患者分为3种类型即弱代谢者、正常代谢者和超速代谢者。弱代谢者1d仅需给药1次就能维持药效,而且不用给予缓释制剂，而超速代谢者就必须缩短给药间隔。,2.脂类代谢等基因的变异 载脂蛋白E 的基因型能影响降血脂药苯扎贝特的降血脂作用，E4 基因型患者用苯扎贝特治疗时，降胆固醇和低密度脂蛋白作用明显小于E2 和E3基因型。,每个人都有他自己的SNP类型。,
