1、实验四 植物细胞微核技术检测,一、实验目的,1、了解细胞微核形成的机理及其形态特点；2、学习植物根尖细胞的微核检测技术。,二、实验原理,微核(micronucleus)简称MCN，是真核类生物细胞中的一 种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产 生的。在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核 之外，大小应在主核1/3以下。微核的折光率及细胞化学 反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。 一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断 片产生的，在有丝分裂后期不能向两极移动，所以游离 于细胞质中，在间期细胞核形成时，即可在它附近看到 一到几个很小的圆形结构，直径大约是细胞直径的1/
2、20 1/5，这就是微核。,微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈正 相关 ，因此，微核是常用的遗传毒理学指标之一， 指示染色体或纺锤体的损伤。微核测试已用于辐射 损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体 遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。,三、实验材料：,大蒜、大豆、蚕豆等。,四、实验仪器设备：,显微镜、恒温培养箱、恒温水浴锅、镊子、载玻片及盖玻片。,五、实验步骤：,1、浸种催芽：将实验用的蚕豆按所需要量放入盛有自来水的烧杯中，浸泡24h，此间至少换水两次。种子吸涨后，经3648h，大部分初生根长至12cm。2、处理根尖：阳性检测采用 1.02.5M CrO3，0.5 1.5M NaN
3、3，150250mM EMS，对照用自来水处理，处理时间24h。3、恢复培养：处理后的根尖用自来水浸洗3次，每次 2-3min，洗净后在水中恢复培养24h。,4、固定：用甲醛：冰醋酸（3：1）固定液固定24h后弃去 固定液，或换入70酒精中保存。5、酸解：弃去固定液，用清水漂洗2-3次，吸净水，加入 6M盐酸，于室温解离10min，弃去盐酸，漂洗根尖2-3 次，彻底洗净盐酸。6、染色：截下1-2mm长的根尖，滴加石炭酸品红染液，染 色10min，加盖玻片，压片观察。,固定是借助于物理方法或化学药剂的作用，迅速透 入组织和细胞将之杀死，并且使其结构和内含物如： 蛋白质，脂肪，糖类以及核物质与细胞
4、器等，在形 态结构上尽可能保持生活时的完整和真实状态，同 时更易于染色，可以较清楚的显现细胞在生活时不 易看清的结构。,酸解的作用是去除未固定的蛋白质, 同时使胞间层的 果胶类物质解体，细胞分散而易于观察。,六、实验结果,1、首先在低倍镜中找到分生组织区细胞分散均匀，分裂相较多的部位，再转高倍镜观察，找到微核。2、微核识别标准：（1）在主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。（2）小核着色与主核相当或稍浅。（3）小核形态为圆形、椭圆形或不规则型。3、每一处理观察3个根尖，每个根尖计数100个细胞，统计其中含微核的细胞数，计算平均数，即为该处理的MCN，即微核千分率。,微核,微核,MN,NCE
5、,改良：CB法微核:微核（micronuclear）：无着丝粒断片（染色体碎片）或在分裂后期落后的整条染色体，在分裂末期不能纳入主核，当进入下一个间期时，它们在细胞质内浓缩成小于主核1/3，着色与主核相同或略浅的小核。胞浆分裂阻滞微核法(CB法)：培养基中加入胞松素-B,后者不干扰细胞核分裂，但能阻滞胞浆分裂。分裂一次的淋巴细胞的胞浆中出现双细胞核,简称CB细胞。CB细胞大,具有双核,易于鉴别。双核细胞是只经历一次分裂的细胞。,CB法估算剂量范围：0.25-5.0Gy；受照后微核随时间变化规律:照射后立刻升高,然后保持恒定水平,持续时间不清；照后尽早采血,不超过一月；微核法：直接涂片法、培养法
6、、CB法；微核仅出现在诱发后经过一次分裂的间期细胞传统微核法不能分辨未转化、分裂一次和一次以上的淋巴细胞,影响微核测试的准确性；CB法计数CB细胞中的微核,可显著提高微核检测的灵敏度和准确性。,MN,CB法优点：方法简单,分析快速,易于掌握,有利于自动化分析,尤其在核事故涉及的人员较多时更显示具优越性。缺点：不像双着丝粒体对辐射敏感、特异；自发率高，12；个体差异大，自发率与性别无关，与年龄呈正相关，估算剂量下限的不确定性高；衰减速度比双着丝粒体快。,进展：稳定性染色体畸变（易位）分析：荧光原位杂交(FISH)技术,利用生物素(biotin)标记的已知碱基序列的核酸作为探针,按照碱基互补的原则
7、,与标本上染色体同源序列进行特异性结合（原位杂交）,然后用荧光标记的生物素亲和蛋白 (avidin)和抗亲和蛋白的抗体进行免疫监测和放大,使探针杂交区发出荧光(显色),形成可监测的杂交双链核酸,最后在荧光显微镜下检查探针存在与否。结合了探针的染色体呈现出特定的颜色,未结合探针的染色体不着色,如着色与未着色的染色体间发生了互换,这种异常的染色体在荧光显微镜下非常容易鉴别。,1,4,FISH,FISH,易位,易位,特点：L FISH与G显带相比，节省了人力物力,由于不需要分散良好的分裂相,增加了分析的细胞数,提高了检测的精确度。L FISH对结构畸变分析较常规法快速、准确,有望成为较理想的生物剂量计。是当前辐射细胞遗传学发展中的一门前沿技术。缺点：l对倒位和缺失等不大敏感；探针的特异性；价格昂贵。,七、思考题,1、在植物细胞的微核检测实验中，为什么要进行24h的恢复培养？2、产生微核的根尖细胞在产生前的分裂中期可能出现什么样的中期分裂图像？绘蚕豆根尖细胞微核图。,
