1、1阳离子交换液相色谱法检测乳制品中三聚氰胺摘要：建立了超声萃取阳离子交换高效液相色谱法测定乳制品中三聚氰胺含量的方法。乳制品经 1%三氯乙酸乙腈溶液超声萃取 15 分钟后，经强阳离子交换型色谱柱进行分离，采用二极管阵列检测器检测。流动相为 50 mmol 磷酸盐（pH=2.5）：乙腈（35：65） ，检测波长为 235nm，三聚氰胺的线性范围为 0.5400g/g，线性方程的相关系数大于0.99，加标回收率在 93%110%之间，相对标准偏差均小于 9.1%。三聚氰胺的检测限为 0.02g/g。本方法简单、快速，可有效消除乳制品基体干扰，测定结果满意，可应用于乳制品中三聚氰胺的监控。 关键词：
2、超声萃取；三聚氰胺；乳制品；阳离子交换色谱 中图分类号：TB 文献标识码：A doi：10.19311/ki.1672-3198.2016.06.092 1 引言 由于食品和饲料工业蛋白质含量测试方法的缺陷，三聚氰胺常被不法商人用作食品添加剂，以提升食品检测中的蛋白质含量。宠物饲料及婴幼儿奶粉中非法添加三聚氰胺，造成对健康的危害。三聚氰胺的检测颇受关注。目前对三聚氰胺的检测主要局限于饲料类产品，多用离子对色谱法，虽然国家已出台了三聚氰胺的检测标准，前处理采用固相萃取技术，存在费时费力，有机溶剂使用量较大的缺点。国外关于三聚氰胺的分析方法主要是色谱法，如 HPLC，GC/MS 和 LC/MS/M
3、S，也有用拉曼光2谱进行检测的报道，但均未见乳制品中三聚氰胺检测的报道。乳制品含有脂肪、蛋白质，若前处理不好，低含量的三聚氰胺的检测易受干扰。超声萃取是一种有效的前处理方法，萃取溶剂的选择对超声萃取效果影响极大。针对目前乳制品中三聚氰胺的检测样品量大，建立简单、快速、可靠的乳制品中三聚氰胺的分析方法非常必要。 本文采用 1%三氯乙酸乙腈溶液为提取液的超声萃取为前处理方法，以二极管阵列紫外检测器作为定性定量手段，采用阳离子交换色谱方法，建立了一种回收率高，快捷，稳定的乳制品中三聚氰胺的检测方法。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 Waters 2695 高效液相色谱仪，Waters 996PAD
4、 二极管阵列检测器（美国 waters 公司） ；涡旋混合仪；（上海沪西分析仪器厂，WH-3）超声清洗器（上海 KU-DOS 超声仪器有限公司，SK7200LH） 。 三聚氰胺标准品（纯度大于 99%，百灵威公司）用 1：1 甲醇水配制成 10ttg/mL 的标准储备液，于-4下避光保存，根据需要稀释成适当浓度的工作液。实验所用液态奶样品，奶粉样品均为武汉产品质量监督检验所日常检测用品。 2.2 实验方法 2.2.1 超声萃取条件 取 2.00g 液体奶样品置于 50.0mL 比色管中，然后加入 10.00mL1%三氯乙酸乙腈溶液，涡旋混匀，超声提取 15min 后，再次涡旋混匀，静置，取上清
5、液过 0.2tim 微孔滤膜，备检测用。 3取 2.00g 奶粉样品置于 50.0mL 比色管中，先加入 5.00mL 二次水溶解，涡旋混匀后，与液体奶预处理步骤相同。 2.2.2 色谱条件 色谱柱：Lunascx（4.6250mm，5m，美国菲罗门公司） ；流动相：A 相为 50mmol 磷酸二氢钾溶液（pH=2.5） ，B 相为乙腈，A：B=35：65，等度洗脱；流速：1.0mL/min；进样量：30L；检测波长：235nm。 3 结果与讨论 3.1 超神萃取条件的优化 3.1.1 萃取方法及萃取液的选择 通常用液一液萃取法提取乳制品中的三聚氰胺，由于乳制品中蛋白质的含量较多，蛋白质变性后
6、会将中心的样品包裹起来，即使通过超声波，高速振荡等方法也很难将包被层破坏掉，使样品不能被充分的提取。本文针对乳制品的特点，分别称取 5 份空白液体奶样品和奶粉样品，添加 10g/g 的三聚氰胺标准工作液，分别用 5 种不同提取液进行预处理，用 LCPAD 进行分离检测，结果如表 1 所示。 由表 1 可见，单独使用甲醇回收率很低；使用乙腈做提取液回收率提高到 83.2%，但仍不能满足分析的要求；1：1 甲醇与水的混合溶剂进行提取时发现蛋白质沉降缓慢，需进行 12000r 高速离心才能够分层。先用 1%三氯乙酸水溶液，然后用乙腈提取回收率叶较低；单独用三氯乙酸提取，回收率只有 35.%，仍无法满
7、足分析要求。含有 1%三氯乙酸的乙腈溶液进行提取，液态奶与奶粉的回收率均在 93%以上，效果最佳。因此本4研究确定提取液为 1%三氯乙酸乙腈溶液。 3.1.2 提取液体积的优化 萃取液体积对回收率有重要影响。为了确保三聚氰胺能够全部提取出来，本研究提高了液态奶及奶粉中的添加水平（500g/g） ，先按照3.1.1 确定的方法分别加入5.00mL，10.00mL，15.00mL，20.00mL，25.00mL，30.00mL1%三氯乙酸乙腈溶液，涡旋混合，超声提取 15min，进行分离检测。试验结果如图 1 所示，结果表明，提取液体积在大于 10.00mL 后，提取出的三聚氰胺的总量不再增加。提
8、取液体积为 5.00mL 时，反应体系不易分层，需用12000r/min 转速离心；若提取液体积过大，会因稀释比例过大导致方法检出限偏高。故本文提取液用量定为 10.00mL。 3.1.3 超声提取时间的优化 超声提取时间可影响三聚氰胺的回收率。分别称取 5 份空白液体奶样品和奶粉样品，添加三聚氰胺标准工作液到 10/g/g，按照 3.1.1 和3.1.2 节所述方法，分别加入 10.00mL1%三氯乙酸乙腈溶液，涡旋混合，分别超声提取 0min，5min，10min，15min，20min，25min，30min，然后进行分离检测，结果如图 2 所示。结果表明，超声提取能够大幅提高回收率，在
9、超声时间大于 15min 之后，三聚氰胺的回收率基本不再增加。故本文超声提取时间定为 15min。 3.2 色谱条件的优化 比较了 C8（4.6250mm，5/m） ，C18（4.6250mm，5m）和Lunasex（4.6250mm，5/m）三种色谱柱的分离情况。其中 C8 柱和5C18 柱按照国标方法给定的色谱条件进行实验。实验结果表明，选用 C8柱和 C18 柱，应用离子对试剂进行分离，空白样品中有一杂质峰与目标峰发生重叠，检测结果受到较大干扰，如图 3（a） ， （b）所示分别为应用C8 柱和 C18 柱的空白样品和三聚氰胺标准品的色谱图。 而选用强阳离子型色谱柱 LunaSCX，以
10、50mmol 磷酸盐（pH=2.5）：乙腈（35：65）为流动相，大部分杂质在死时间即被洗脱，能够很好的与所有杂质峰分离，见图 3（c） ，分别是空白样品，三聚氰胺标准品及空白加标样品的色谱图。由图可见，杂质峰和三聚氰胺完全得到分离，因此本研究选择上述 Luna-scx 色谱柱作为分离柱；选用 235nm 作为检测波长。 3.3 方法的线性范围，检出限。回收率和精密度 采用外标法定量，三聚氰胺在液态奶及奶粉中的线性范围为0.5400g/g，相关系数均大于 0.99。以阴性样品为测试样品，添加不同浓度水平的三聚氰胺，每个水平做 6 个平行样，计算回收率、相对标准偏差（RSD） ，结果见表 2。通
11、过低浓度（0.5g/kg）添加样品，以 3倍信噪比为检出限（LOD） ，计算得出三聚氰胺的检出限为 0.02g/g，同样条件下，以 10 倍信噪比为定量下限（LOQ） ，计算出三聚氰胺的定量下限为 0.5g/g。 3.4 乳制品中三聚氰胺的测定 测定了 5 种乳制品，分别是原料牛奶，成品纯牛奶，成品乳酸菌饮料，成品酸奶及成品奶粉。样品按照本文确定的前处理方法进行预处理后，以 30L 直接进样分析，所得结果如表 3 所示。三聚氰胺在 5 种乳6制品中的回收率为 94.6%100.2%。 采用超声萃取能有效降低乳制品的基体干扰，与离子交换色谱联用检测乳制品中三聚氰胺，具有检出限低，杂质干扰少，样品前处理步骤简单，回收率稳定等优点，可用于实际奶制品中三聚氰胺的检测。
