1、生物化学Biochemistry山东大学医学院生物化学与分子生物学系田克立Tel: 13791087728E-mail: Spring 2014,1. 小分子 H2O（50%） metal irons: Na+, K+, Cl-, Ca2+, P- . trace element : Fe2+, Zn2+, Mg2+ . carbohydrates (糖类) lipids (脂类) amino acids (氨基酸) vitamins (维生素类) and others2. 生物大分子 proteins（蛋白质）(enzyme，酶) nucleic acids（核酸): DNA and RNA
2、 polysaccharides (多糖) glycoproteins (糖蛋白, 糖+蛋白质) proteoglycan (蛋白聚糖) lipoproteins (脂蛋白, 脂+蛋白质) nucleoproteins (核蛋白, 核酸+蛋白质),构成生物体的生物分子,蛋白质的结构与功能,第 一 章,Structure and Function of Proteins,蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键相连形成的高分子含氮化合物。 蛋白质是生物 体重要组成成分：分布广，含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及
3、横纹肌等高达80。 蛋白质具有重要的生物学功能作为生物催化剂（酶），代谢调节作用，免疫保护作用，凝血抗凝血，物质的转运和存储，运动与支持作用，参与细胞间信息传递，氧化供能等。,第一节 蛋白质的分子组成,蛋白质的元素组成 C (5055%), H (67%), O (1924%), N (1319%), S (04%), P, metal elements,蛋白质元素组成的特点 * 各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。 * 体内的含氮物质主要为蛋白质，测定生物样品中的含氮量，根据以下公式可推算出蛋白质的大致含量： 100克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数 6.25100
4、,一. 蛋白质的分子组成 氨基酸（amino acids）是组成蛋白质的基本单位,存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属 L-氨基酸（甘氨酸除外）。 其他重要的氨基酸 (如鸟氨酸,瓜氨酸,-丙氨酸等),Name,Three-letter Symbol,and One-letter Symbol,丙氨酸 精氨酸天冬酰胺 天冬氨酸半胱氨酸谷氨酰胺谷氨酸甘氨酸组氨酸亮氨酸异亮氨酸赖氨酸蛋氨酸苯丙氨酸脯氨酸丝氨酸苏氨酸色氨酸酪氨酸缬氨酸,根据R侧链基团的结构和性质不同：非极性脂肪族(疏水性)氨基酸极性中性氨基酸芳香族氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸,二. 氨基酸的分类(
5、Classification of amino acids),(1) 侧链含烃链的非极性疏水性脂肪族氨基酸,非极性氨基酸R基团间可形成疏水作用力,(2) 极性中性氨基酸,(3) 芳香族氨基酸侧链含芳香基团,可吸收紫外光，最大吸收峰280nm,Hydrogen bonds氢键,一些功能基团如OH, -SH, -NH3+,H2O等之间可形成氢键,(4) 酸性极性氨基酸-R基团带负电荷（pH 7.2）,(5) 碱性极性氨基酸-R基团带正电荷（pH 7.2）,带相反电荷的氨基酸R侧链基团之间的相互作用,Ionic bonds (salt bonds)离子键（盐键）,几种特殊氨基酸,脯氨酸 Prolin
6、e（亚氨基酸）,-S-S- 二硫键,半胱氨酸, 胱氨酸,Disulfide bond,胰岛素 (Insulin)依赖二硫键维持结构稳定性,二硫键 (Disulfide bond),维持蛋白质结构稳定,苏氨酸,丝氨酸,酪氨酸,-OH 基的H可被其它化学基团，如磷酸基P取代.,其他分类方式,侧链含羟基的氨基酸,蛋氨酸,半胱氨酸,含硫氨基酸,胱氨酸,NH2 and COOH 可解离： COOHCOO- + H+ NH2 + H+ NH3+ R 基团含可解离基团: 酸性和碱性 AAs 氨基酸是两性电解质，其解离程度 取决于所处溶液的酸碱度(pH).,三. 氨基酸的理化性质(Properties of
7、amino acids),1. 氨基酸具有两性解离的性质,pH=pI,pHpI,pHpI,氨基酸的兼性离子,阳离子,阴离子,等电点(isoelectric point, pI) 在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，分子所带的净电荷为零, 呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。,pI = (pK1+pK2),写出电离式,取兼性离子两边的pK值的平均值,2. 紫外吸收,色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。 大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。,3. 茚三酮反
8、应,* 肽键(peptide bond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。,四. 蛋白质是由许多氨基酸残基组成的多肽链,（一）氨基酸通过肽键连接形成肽 (peptide),peptide bond or amide bond (酰胺键),+,甘氨酰甘氨酸,肽键,Peptide 肽,残基,多肽链,* 肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。,羧基末端C末端,氨基末端N末端,Backbone or main-chain主链骨架,Side-chain侧链,COO- CH2,CH2,NH3+CH2CH2CH2,Peptide 肽,Dipeptide (二肽): two
9、 AA residues（2个AA残基） Tripeptide (三肽): three AA residues Oligopeptide (寡肽): fewer than 10 AA residues Polypeptide (多肽): fewer than 50 AA residues Protein (蛋白质): more than 50 AA residues,Gly-Ala, Ala-Gly Gly-Ala-Lys, Gly-Lys-Ala, Ala-Gly-Lys, Ala-Lys-Gly, Lys-Ala-Gly, Lys-Gly-Ala, (1 x 2 x 3 x 4 x 5 x
10、 n),肽有多种形式,20种氨基酸可排列组合形成种类繁多的蛋白质,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,（二） 重要生物活性肽,1. 谷胱甘肽 (glutathione, GSH),三肽 功能基团：- SH,GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,Antioxidant 2GSH + H2O2 GSSG + 2 H2O GSSH + NADPH + H+ 2GSH + NADP,Functions of GSH,体内许多激素属寡肽或多肽,神经肽,2. 多肽类激素及神经肽,第二节 蛋白质的分子结构Structure of Proteins,一级结构 (primary structu
11、re)二级结构 (secondary structure)三级结构 (tertiary structure)四级结构 (quaternary structure),一. 蛋白质的一级结构(Primary structure of protein),从N端至C端以肽键相连的氨基酸排列顺序，包括二硫键的位置。 主要的化学键：肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,翻译,转录,蛋白质的氨基酸序列是由基因序列决定的,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础,R侧链基团的相互作用,二. 蛋白质的二级结构 (Secondary structure),蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原
12、子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。主要化学键：氢键,主链骨架,肽键特性,（一） 肽单元（平面） Peptide unit (plane),肽单元,参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了肽单元 (peptide unit) 。,与C1和C2连接的单键可自由旋转，旋转角度决定相邻肽单元平面的相对空间位置，从而形成不同的二级结构形式。,蛋白质二级结构的主要形式,-螺旋 ( -helix ) -折叠 ( -pleated sheet ) -转角 ( -turn ) 无规卷曲 ( rand
13、om coil ),(二) -螺旋 -helix,right-hand helix,left-hand helix,主链骨架形成 右手螺旋,每3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈 螺距 0.54 nm R侧链伸向螺旋外侧,Model of Right-Handed Alpha-Helix Showing H-Bonding,螺旋结构,多肽链的主链围绕中心轴有规律的螺旋式上升,螺旋走向为顺时钟,即右手螺旋; 氨基酸侧链(R)伸向螺旋外侧。每3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈,螺距为0.54nm;每个肽键的NH和其氨基端第四个肽键的羰基氧(O=C)形成氢键,氢键的方向与螺旋长轴基本平行。肽链中的全部肽键都可
14、形成氢键,以稳固螺旋结构。肌红蛋白和血红蛋白分子中有许多肽链段落呈-螺旋结构。毛发的角蛋白、肌肉的肌球蛋白以及血凝块中的纤维蛋白,它们的多肽链几乎全长都卷曲成螺旋。双性螺旋,（三）-折叠（-pleated sheet）,两条以上多肽链构成，多肽链充分伸展,每个肽单元以C为旋转点,依次折叠如扇面状；通过肽链间的肽键羰基氧(O=C)和亚氨基氢形成氢键从而稳固折叠结构。,氨基酸残基侧链(R)交替位于折叠片层上下方,平行肽链走向有平行与反平行两种方式。,-折叠,两条以上多肽链构成，多肽链充分伸展,每个肽单元以C为旋转点,依次折叠如扇面状；氨基酸残基侧链(R)交替位于折叠片层上下方；平行肽链走向有平行与
15、反平行两种方式。通过肽链间的肽键羰基氧(O=C)和亚氨基氢形成氢键从而稳固折叠结构。蚕丝蛋白几乎都是折叠结构,许多蛋白质既有-螺旋又有折叠。,（四）-转角(turn)和无规卷曲(random coil),无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。,* 转角常发生于肽链进行180回折时的转角上。* 一转角通常由4个氨基酸残基组成,其第一个残基的羰基氧(O=C)与第四个残基的氨基氢(H)可形成氢键。* 转角的第二个残基常为脯氨酸,其他常见残基有甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺和色氨酸。,在许多蛋白质分子中，可发现二个或二个以上具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个有规则的二级结构组合，被
16、称为超二级结构 (super-secondary structures)。 包括：， ， 等。 模体 (motif) 是具有特殊功能的超二级结构。,（五）模体 (motif),Motif (模体),在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，发挥特殊功能，被称为模体(motif)。 一个模体有其特征性的氨基酸序列.,常见模体 motif： helix turn (or loop) helix - Chain - turn chain Chain - turn helix - turn chain等,钙结合蛋白中结合钙离子的模体,锌指结构,有
17、些模体也可仅由几个氨基酸残基（而非超二级结构）组成。 e.g. RGD (Arg-Gly-Asp ) motif,（六）氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响,蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋或-折叠，它就会出现相应的二级结构。,三、蛋白质的三级结构（Tertiary structure）,整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。主要的化学键: 疏水作用、盐键、氢键和 Van der Waals力等.,结构域（ Domain ）,分子量较大的蛋白质三级结构中常可折叠成多个结构较为紧密的区域，并各行使其功能，称为结构
18、域。 球状蛋白质的独立折叠单位，有较独立的三维结构。如：脂肪酸合酶,有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基 (subunit)。蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。含有四级结构的蛋白质,单独的亚基一般没有生物学功能,只有完整的四级结构寡聚体才有生物学功能。亚基之间的结合力主要是氢键和离子键。,四. 蛋白质的四级结构（Quaternary structure）,血红蛋白的四级结构,（一）一级结构是空间构象的基础,一、蛋白质一级结构是高级结构与功能的基础,第三节 蛋白质结构与功能的关系,1 peptide
19、chain: 124 AAs4 Disulfide bonds,天然状态，有催化活性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。 多数多肽链的正确折叠和成熟不能自发完成，需要分子伴侣的参与。,(二) 一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构和功能,Homology (同源性)：由同一基因进化而来的一类蛋白质。,大猩猩,长臂猿,猕猴,鼠,(三) 氨基酸序列提供重要的生物进化信息,关键氨基酸改变,基因突变,蛋白质结构功能改变导致分子病,（四）蛋白质关键氨基酸序列改变可引起疾病,镰刀形红细胞性贫血,
20、这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。,仅此一个氨基酸之差,使水溶性的血红蛋白，聚集成丝，相互粘着，红细胞变形成为镰刀状而极易破碎，产生贫血。,Sickle-cell anemia 镰刀型红细胞贫血,这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”,Crescent-shaped erythrocytes,(lack of blood),（一）肌红蛋白亚基与血红蛋白结构相似,二.蛋白质的功能依赖特定空间结构,球状蛋白；含血红素辅基；均可结合氧,Myoglobin (Mb) 肌红蛋白,单肽链, 具有三级结构,His F8,Hemoglobin (Hb) 血红蛋白,4个亚基组成
21、, 22 (adult)，含4个血红素辅基 具有四级结构,四个亚基之间形成8个盐键,Hb与Mb一样能可逆地与O2结合， Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。,（二）血红蛋白亚基构象变化可影响亚基与氧结合,Hb与O2 结合机制,Mb Hb + + O2 O2MbO2 HbO2O2-饱和度HbO2 Hb,X 100%,Mb与Hb的O2饱和曲线,Mb: 对O2亲和力高，直角双曲线 Hb: 对O2亲和力低，S形曲线,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,Hb紧张态 (T state): 4个亚基紧密结合，对O2亲和力低； Hb松弛态(R
22、 state)：一个亚基结合O2后，盐键断裂，可明显改变Hb其它亚基对O2的亲和力。,别构效应(Allosteric effect),配体分子(O2)与蛋白质(Hb亚基)结合后, 蛋白质空间构象发生变化,从而引起功能的变化，称为别构效应。 别构效应剂: 小分子，如，O2,Cooperativity (协同效应),一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 如果是促进作用则称为正协同效应(positive cooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应(negative cooperativity),Hb and Mb,H
23、b：4 亚基，四级结构Mb：1亚基，三级结构,Hb: 运输O2Mb: 储存O2,空间结构,Hb：正协同效应Mb：无协同效应,O2 结合特性,功能,（三）蛋白质构象改变与疾病,蛋白质构象疾病（折叠病）：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。,蛋白质的错误折叠可造成致命后果,蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。已发现20多种蛋白，包括Prion蛋白、A等可形成与疾病有关的淀粉样沉淀。,多种疾病与蛋白质的错误折叠相关,神
24、经退行性疾病如阿尔茨海默病(AD),帕金森病(PD),亨廷顿舞蹈病(HD),朊蛋白病(prion disease),家族性肌萎缩侧索硬化症(ALS)等均与错误折叠的蛋白质聚集并形成淀粉样纤维沉淀或斑块有关。,是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。表现为进行性痴呆、小脑共济失调、肌肉控制减弱、精神敏锐度下降、健忘和失眠等。又称海绵状脑病。具有传染性、遗传性或散在发病的特点。动物间的传播是由朊病毒蛋白（Prion protein, PrP）组成的传染性颗粒（不含核酸）完成的，是一种蛋白质感染因子。,朊蛋白病 (prion disease),Prio
25、n蛋白研究揭示生物信息可直接在蛋白质间传递，改变了生物信息传递的传统观点。,CJD: Creutzfeld-Jakob disease,学名：克罗伊茨费尔德雅各布氏症 简称克-雅氏症（人纹状体脊髓变性病CJD）俗名：疯牛病 临床症状 ：出现进行性痴呆或神经错乱，视觉模糊，平衡障碍，肌肉收缩等。 神经病理检查 ：病人的脑神经组织发生海绵状变性,病羊(羊瘙痒症)神经组织的海绵状损伤 图片来自http:/www.vetmed.ucdavis.edu,vCJD病人大脑组织切片，左：海绵状病变及周围的沉淀斑，右：淀粉样蛋白沉淀。引自Stanley B. Prusiner 1997,CJD的传播方式,主要
26、方式为家族遗传另外还可以传染：手术时接触受朊病毒污染的器械 食用被疯牛病污染了的牛肉或牛骨髓移植携带CJD的器官,卡里顿加德赛克,美国国立卫生研究院病毒和神经研究室主任，因发现神经性传染性疾病的新病因和传播新机制而获得1976年诺贝尔医学/生理学奖。,加德赛克在新几内亚岛发现了一种奇怪的疾病 ，当地的土著人称之为“kuru”。由于找不到病因，被当地人称为“终极巫术”。 Kuru在当地的含义是颤抖，因某种未知的寒冷或恐惧而颤抖。一旦Kuru的颤抖开始，就不可逆转，诅咒会越来越烈，直至死亡为止。Kuru的诅咒非常残酷：先是不可抑制的颤抖，然后丧失行走能力及无法言语，接着瘫痪。但中了巫术的人至死心智
27、都很清醒，不会陷入昏睡状态，因此格外痛苦。,经过加德赛克对死者脑部的解剖和进一步研究，在大脑的特定区域会检查出细微的小孔，使脑组织看起来像一块海绵。很快就将其与CJD联系起来。但是CJD曾经一度被认为是一种遗传病，它是否含有传染性物质呢？ 1968年，加德赛克将死于CJD病人的脑组织提取物注射到正常的实验动物身上，该动物也会死于与kuru或CJD相似的症状。明显地，这种提取物含有遗传物质，在当时被推测为某种病毒。,史坦利布鲁希纳,美国加州大学旧金山分校教授。因其发现了朊病毒,并在其致病机理的研究方面做出了杰出贡献，而获得1997 年诺贝尔生理医学奖,朊病毒（Prion):不含核酸，完全由蛋白质
28、构成的病毒。 最初推测朊病毒是像普通病毒一样的微粒，只是缺乏核酸。但是实际与预期的相反，朊病毒很快被证明可由细胞自身染色体的基因编码。这个基因称为PRNP，该基因位于人第20号染色体的短臂，小鼠第2号染色体。它可以表达于正常的脑组织并且编码一种命名为PrPc的蛋白质，存在于神经细胞的表面，对蛋白酶和高温敏感。PrPc精确的功能至今仍不清楚。但是这种蛋白质的变异形式目前在人脑中发现，这就是CJD。,具有致病作用的是PrPSc蛋白（scrapie-associated prion protein） ，是一种结构变异的蛋白质，对高温和蛋白酶均具有较强的抵抗力,具有感染性。它能转变细胞内的此类正常的蛋
29、白PrPC，使PrPC发生结构变异，变为具有致病作用的PrPSc。因此是一种蛋白质感染因子。,Prion的结构模型，左PrPc，右PrPSc 图片来自http:/www.cmpharm.ucsf.edu/cohen/media/pages/gallery.html,PrPSc与PrPc的一级结构相似，均由253-4个氨基酸组成，但PrPc的高级结构中只有极少的折叠（3%），而PrPsc则具有45%的折叠。动物被感染后，发生错误折叠的PrPSc蛋白堆积在脑组织中，形成不溶的淀粉样蛋白沉淀，无法被蛋白酶水解，引起神经细胞凋亡（Apoptosis），,PrPc与 PrPSc的比较,第四节,蛋白质的理
30、化性质,NH3+ COOH NH3 + COO- NH2 COO-,+ H+ + OH-,pI pI,一. 蛋白质具有两性电离性质,带正电荷 中性 带负电荷,体内大多数蛋白质的pI值为5.0左右，在体液中带负电荷,Isoelectric point (pI) - 等电点,在某一pH溶液中，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。 pH pI：蛋白质带负电荷,二. 蛋白质的胶体性质,生物大分子 - MW: 10,000 million - diameter: 1 100nm 蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷水化膜,水化膜,溶液中蛋白质的聚沉
31、,（三）蛋白质空间结构破坏引起变性,在某些物理和化学因素(如加热，强酸，强碱，有机溶剂等)作用下，蛋白质的特定空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。,变性的本质: 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构,应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。防止蛋白质变性是有效保存蛋白质制剂（如酶,疫苗等）的必要条件(如低温保存)。,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation) 。,Renaturation of protein (蛋白质复性),天然状态，有催化活
32、性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,变性,复性,Renaturation,denaturation,* 蛋白质沉淀(protein precipitation) 在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链相互缠绕聚集，从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。,* 蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。,四.蛋白质的紫外吸收,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系
33、，因此可作蛋白质定量测定。,五. 蛋白质的呈色反应可用于蛋白质溶液含量测定,茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。 双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色，此反应称为双缩脲反应，可用来检测蛋白质含量和水解程度。,Proteomics 蛋白质组学,Wilkins MR et al : proteome = PROTEin+genOME(蛋白质组) “一种基因组所表达的全套蛋白质”Swinbanks : “代表一完整生物的全套蛋白质”Kahn P : “反映不同细胞的不同蛋白
34、质组合” “蛋白质组proteome” 有不同的含义： 广义上讲，一个基因组、一种生物或一种细胞/组织所表达的全套蛋白质。 狭义：仅指特定的细胞或组织在特定的阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。 具有时空性，比基因组研究更复杂。,(1) Definition:,蛋白质组学（proteomics)研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。差异蛋白质组学、细胞蛋白质组学、结构蛋白质组学、功能蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学、糖基化蛋白质组学、临床蛋白质组学、疾病蛋白质组学等。,(2) 蛋白质组学研究技术平台 (高效率,高通量) 双向电泳分离样品蛋白质 蛋白质点的定位和切取 蛋白质点的质谱分
35、析(3) 研究的科学意义,生物学问题的提出,实验模型的设计,实验组和对照组样品的制备,蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离,图像扫描和初步分析,感兴趣蛋白点的切取,胰酶对蛋白质的消化,质谱的多肽指纹图分析,质谱结果的生物信息学分析和比对,蛋白质的鉴定,其它实验的进一步验证,蛋白质组学流程图,蛋白质样品的色谱分离,Key terms,模体 (Motif )结构域 (Domain)蛋白质的变性(Denaturation of protein)蛋白质的等电点 (pI),Thank You,If you have any questions, please dont hesitate to ask !,
36、粗提 - 沉淀, 离心等,分离- 电泳，层析等,纯化 电泳，层析等,鉴定 - HPLC, MS, NMR,第五节 蛋白质的分离、纯化与结构分析,（一）透析及超滤法,* 透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,* 超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,透析 (Dialysis),（二）有机溶剂沉淀、盐析及免疫沉淀,* 有机溶剂：常用丙酮、乙醇等沉淀，浓度不能太高，低温,* 盐析(salt precipitation)是将高浓度中性盐如硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜
37、被破坏，导致蛋白质沉淀。,agarose bead,免疫沉淀法（IP） 是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G”能特异结合免疫球蛋白FC片段的现象而发展的方法。目前多用精制的protein A/G预先结合固化在agarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能吸附抗原抗体达到沉淀抗原的目的。,protein A,抗原,抗体,（三）电泳,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis)
38、。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,几种重要的蛋白质电泳* SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）， 常用于蛋白质分子量的测定。* 等电聚焦电泳（IEF）， 通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。* 双向凝胶电泳（2D-gel）是蛋白质组学研究的重要技术。,Electrophoresis,Estimating the molecular weight of a protein,Marker,（SDS-PAGE）,Isoelectric focusing （IEF）,Two-dimensional electrophoresis,蛋白质组学研究的重要技术之一,（四）
39、层析 (chromatography),待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。,蛋白质分离常用的层析方法 离子交换层析(ion exchange chromatography)：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 凝胶过滤层析(gel filtration chromatography):又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。 此外还有亲和层析(Affinity chromatography), 疏水层析(Hydrophob
40、ic interaction chromatography), 高效液相层析(High-performance liquid chromatography)等。,gel filtration chromatography,Separates proteins by size,Ion-exchange chromatography Separates proteins by charge,Separates proteins by their binding specificities,Affinity chromatography,（五）超速离心,* 超速离心法(ultracentrifuga
41、tion)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。,*蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关。因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。,（六）多肽链中氨基酸序列分析,分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成,测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基,把肽链水解成片段，分别进行分析,测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法,一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最
42、终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。,通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列,按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列,分离编码蛋白质的基因,测定DNA序列,排列出mRNA序列,7. 蛋白质空间结构测定Spatial structure determination,* 二级结构测定 通常采用圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。 -螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198 nm处的正峰三个成分；而-折叠的CD谱不很固定。,crystal preparation,X-ray diffraction , NMR,* 三级结构测定X射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技术(nuclear magnetic resonance, NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。,
