1、第六部分 细胞凋亡 及其信号转导Part Apoptosis and its signal transduction,2,内容,一、细胞凋亡概述二、细胞凋亡的机理三、细胞凋亡途径四、细胞凋亡的意义,3,一、细胞凋亡概述,1.细胞凋亡概念 1965年澳大利亚科学家发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一些散在的死亡细胞, 其溶酶体并未被破坏，显然不同于细胞坏死。这些细胞体积收缩、染色质凝集从其周围的组织中脱落并被吞噬机体无炎症反应。1972年Kerr等三位科学家首次提出了细胞凋亡的概念，宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始，在此之前，关于胚胎发育生物学、免疫系统的研究，肝细胞死亡的研究都为这
2、一概念的提出奠定了基础。细胞凋亡(apoptosis) ，又称程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD) ：一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程。坏死（性）（necrosis）:由某些外界因素比如局部贫血，高热以及物理、化学损伤和生物侵袭等造成细胞急速死亡，是一种被动性死亡。,4,2.细胞坏死与细胞凋亡比较,5,3.程序性细胞死亡的形态结构变化,6,程序性死亡细胞的形态结构变化,7,1）DNA的有控裂解: 200bp及其倍数DNA 条带2）组织转谷氨酰胺酶（tTG）积累并达到较高水平。其活性依赖钙离子，参与蛋白质的翻译后修饰，导致蛋白质聚合，有助于保持凋亡小体暂
3、时的完整性，防止有害物质逸出。3）细胞内钙离子快速、持续升高。其它：细胞内活性氧增多，质膜通透性变大。,4.程序性细胞死亡的生化特征,8,程序性死亡细胞的DNA降解,9,5. 诱导细胞凋亡的因子,1）物理性因子：射线，较温和的温度刺激（热激、冷激）。2）化学及生物因子：活性氧、钙离子载体、VK3、视黄酸、细胞毒素、DNA和蛋白质合成的抑制剂、正常生理因子（如激素、细胞生长因子）的失调、肿瘤坏死因子、抗Fas/Apo-1/CD95抗体、细菌、病毒等。,10,11,6. 细胞凋亡的检测,1）形态学检测：普通光镜、荧光显微镜、透射和扫描电镜观察2）DNA梯形电泳图谱检测：细胞凋亡数超过30%3）彗星
4、电泳法：单个细胞悬浮于凝胶中，裂解后电泳形成彗星式图谱，无断裂DNA保持圆球形4）TUNEL检测，即DNA断裂的原位末端标记法：末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记5）流式细胞检测：碘化丙锭使DNA产生激发荧光6）Annexin V法：荧光素标记PS特异性结合蛋白Annexin V7）线粒体膜势能的检测：其跨膜电位下降是凋亡发生的早期事件，用亲脂性阳离子荧光染料如罗丹明123结合线粒体基质，荧光强弱反映内膜电负性高低,12,二、 程序性细胞死亡的机理,2002年的诺贝尔生理学和医学奖：英国的Brenner、Sulston和美国的Horvitzfor their discoveries
5、 concerning genetic regulation of organ development and programmed cell death,13,1.雌雄同体的秀丽新小杆线虫,14,2.秀丽新小杆线虫中参与程序性细胞死亡控制的基因,决定死亡的两个基因，即ces-1(ces表示CE细胞存活的调控基因)和ces-2基因。执行死亡的4个基因：ced-3、ced-4、ced-9和egl-1基因。7个与死亡细胞被吞噬细胞所吞噬的基因，即ced-1、ced-2、ced-5、ced-6、ced-7、ced-10和ced-11。死亡细胞在吞噬体中被降解的基因:nuc-1。,15,程序性细胞死亡
6、途径及相关基因,16,3. 凋亡促进基因,1）BAX：C端与BCL2相似，与BAX蛋白量的比率决定细胞命运，BCL2高表达时形成异二聚体抑制凋亡。2）BAK：功能类似BAX，拮抗BCL2、BCL-XL、E1B-19K的抗凋亡效应。3）BAD：置换BCL-XL/BAX、BCL2/BAX中的BAX，使BAX同二聚体含量升高。,17,BcL-Xs，Bad, Bid, Bik，Hrk，Bim, Blk, ,Noxa,BimL,BcL-2,BcL-w，BcL-XL、 MCL-1，AI, BFL-1、Brag-1、NR-13,BOO,Bax，Bak, Bok，,抗凋亡结构域,18,4）天冬氨酸特异性半胱氨
7、酸蛋白酶(cysteine-containing aspartatespecific protease),简称caspase ：自杀性蛋白水解酶白细胞介素-1-转换酶（ICE， caspase1 ）：与ced3同源，促使IL-1前体转换成有活性的IL-1 。 caspase1、 11、4参与白介素前体的活化 caspase2、8、9、10参与细胞凋亡的起始 caspase3、6、7参与细胞凋亡的执行,3. 凋亡促进基因,凋亡蛋白 Caspase 家族,20,3.凋亡促进基因,5）肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）：TNF家族成员，发现5个TRAIL受体，DR4、DR5胞内含死亡结构域
8、（dead domain,DD）。6）Fas/Apo1/CD95：TNFR/NGFR家族成员，编码52kD跨膜蛋白，胞质区有信号传导区和信号转导抑制区，其配体FasL属TNF家族成员。7) TNFR1死亡结构域连接蛋白（TRADD）： 32kD ，C端有DD，可和TNFR1特异性结合，被ICE蛋白酶的特异性抑制剂CrmA抑制；可激活转录因子NF-B。,21,3.凋亡促进基因,8）Fas死亡结构域连接蛋白（FADD）： 208aa ，C端有DD，与 Fas/Apo1结合，N端含MORT结构域或死亡效应结构域（DED），可与MACH/FLICE（caspase 8）结合，向下转导Fas及TNF1
9、2个受体的细胞凋亡信号。9）受体相互作用蛋白（RIP）： 74kD， C端有DD， N端与蛋白激酶同源，可与Fas及TNF1 2个受体结合。10）Daxx： 81kD， C端可与Fas的DD结合， N端可激活JNK途径。,22,4. 凋亡抑制基因,1）BCL2：原癌基因，ced9的同源物。C端含19aa组成的跨膜结构，位于线粒体、SER、核膜。稳定线粒体，阻遏氧自由基诱导的细胞凋亡途径，阻断从ER向胞质的钙流。2）BCL-X：BCL-XL与线粒体结合，抑制细胞色素C释放；与Apaf-1结合，抑制其形成复合物。BCL-Xs可与BCL2 、BCL-XL组成异二聚体。3）MCL-1：与BCL2同源，
10、可与BAX形成异二聚体。4）A1：与BCL2同源，可与BAX形成异二聚体。,23,5. 细胞生长抑制基因,P53通过调节BCL2和BAX基因的表达来影响细胞凋亡。 P53抑制BCL2表达，促进BAX表达。正常发育过程中的细胞凋亡并不要求P53参与。,24,6. 细胞增殖基因,c-Myc在抑制细胞周期因子、抑癌基因、低浓度血清培养条件下，可诱导细胞凋亡。在GF充足时主要激活介导细胞增殖的基因。作用：拮抗Fas/ Fas L途径中的凋亡抑制因子；作为转录因子促进Fas/ Fas L的表达。,25,7.动物细胞中蛋白质酶解级联系统对程序性细胞死亡的介导,26,8.执行者caspase在程序性细胞死亡
11、中的作用,27,能够被caspase切割的靶蛋白蛋白激酶核纤层蛋白细胞结构蛋白与DNA修复相关的酶类：多聚ADP核糖聚合酶caspase激活的DNase抑制蛋白：ICAD/DEF45,A. 使抑制凋亡因子失活，如CAD/ICADB. 破坏细胞结构，如LaminaC. 将调节区与催化区分离，使蛋白失活，如Gelsolin,28, caspase8、10含串联重复的“死亡效应子”结构域（DED）caspase2、9含caspase募集结构域（CARD） 连接器FADD 修饰子蛋白TRADD Apaf-1(apoptotic protease activating factor-1,凋亡蛋白酶活化因
12、子-1),9. caspase的活化,caspase 激活模型,30,caspase的抑制剂,痘病毒蛋白Crm A抑制caspase 1、8杆病毒蛋白p35对大多数有较强抑制作用,主要作用于起始caspase疱疹病毒v-PLIPs：一组受体介导的细胞凋亡抑制剂，含两个DED，可与FADD相互作用，阻止caspase 8、10与连接器蛋白的结合及活化。细胞凋亡抑制因子（inhibitor of apoptosis protein, IAP）：抑制caspase 3、7、9，对caspase 1、8、10无抑制作用。N端为杆状病毒IAP重复序列(baculoviral IAP repeat, BI
13、R结构域):与caspase结合; C端锌指结构域: 可作为E3泛素连接酶,31,A、氧化损伤（自由基的作用）,1）引起DNA损伤可激活P53基因导致细胞凋亡。2）引起DNA损伤可活化多聚ADP核糖合成酶， 引起NAD快速消耗，ATP大量消耗，引发细 胞凋亡。3）引发脂质过氧化反应，直接造成细胞膜损伤 可诱导细胞凋亡。4）激活核酸内切酶。5）引起细胞膜通透性增高（ Ca2+内流增加） 和线粒体膜损伤6）活化核转录因子，可加速凋亡相关基因的表达。,10.细胞凋亡的发生机制,32,B、钙稳态失衡,1）激活Dnase,2）激活谷氨酰胺转移酶，催化细胞内肽链间的酰基转移，使蛋白广泛交联，有利于凋亡小体
14、形成。,3）激活核转录因子，加速细胞凋亡相关基因的转录。,4）Ca 2+在ATP的配合下使DNA舒展，暴露出核小体之间的连接区内的酶切位点。,5）激活Ca2 敏感的蛋白酶,33,C、线粒体损伤,凋亡诱导因素,线粒体跨膜电位,线粒体PTP开放,Cyt.C,Apaf,等释放,凋亡诱导因子（AIF）,潜在Dnase,活化Dnase,激活Caspases,细胞凋亡,（通透性转换孔）（凋亡蛋白酶激活因子）,34,三、细胞凋亡途径,1. 死亡受体介导的细胞凋亡途径（外源性死亡通路 ）,死亡受体: CD95 (或者Fas) TNFR1 (TNF receptor-1) DR4 和 DR5,35,2. 细胞色
15、素c/凋亡蛋白酶激活因子（apoptotic protease-activating factor，Apaf）途径 （内源性死亡通路 ）,36,37,38,39,细胞内源信号激发细胞程序性死亡,40,41,3. Ras-PI3K-Akt(PKB)抗细胞凋亡途径,42,4. NF-B与细胞凋亡,NF-B：一种转录因子，抑制细胞凋亡。Ras可促进NF-B活化。TNFR激活后，通过TRADD、RIP、TRAF2激活NIK（ NF-B诱导激酶），再激活IKK（IB激酶），将IB磷酸化降解，释放NF-B进入核内。NF-B的靶基因为TRAF1（TNFR结合因子1）、TRAF2、c-IAP（细胞凋亡抑制因子
16、）1和c-IAP2 ，共同作用，抑制caspase 8的活化而抑制细胞凋亡。,43,5. ASK1-SAPK/JNK及ASK1-p38途径,ASK1：一种MAPKKK，参与胁迫和细胞因子诱导的细胞凋亡。JNK、p38都是 MAPK。ASK1可活化MKK4-JNK 和MKK3-p38两条信号通路。TNFR可通过接头蛋白与MEKK结合而激活JNK通路。,47,6.内质网信号途径, Bcl-2蛋白家族成员可定位于内质网高表达Bcl-2可有效阻止Ca2+从内质网的释放 Ca2+胞内可作为促凋亡的第二信使参与启动凋亡 caspase-12可在内质网被激活，进一步切割caspase-3,9,48,7. 非
17、caspase依赖的细胞凋亡,非caspase依赖的细胞凋亡：自吞噬性细胞死亡和坏死 AIF (apootosis inducing factor):线粒体内保守的氧化还原酶，是可直接介导细胞核凋亡的效应分子。作用于染色质，在caspase dependent DNAse进一步催化下，DNA呈大片段断裂(-50kb)，使细胞发生凋亡。 Cathepsins:溶酶体蛋白酶，可激活线粒体细胞凋亡通路和非caspase依赖的细胞凋亡 Calpains:受Ca2+调控的蛋白酶，可切割和激活caspase-12，也参与非caspase依赖的细胞凋亡 Granzyme B:可直接激活caspase ，也能
18、诱导非caspase依赖的细胞凋亡,50,四、程序性细胞死亡的意义,动物机体靠对细胞增殖和细胞周期的正负控制以及对程序性细胞死亡的正负控制来维持细胞总数的平衡和机体的生命活力。程序性细胞死亡在形态建成中起重要作用。,51,细胞凋亡是普遍存在的, 变态： 蝌蚪 青蛙 昆虫 、卵 幼虫 成虫, 哺乳类: 皮肤，指（趾）甲, 红细胞：分化成熟 失去细胞核 凋亡, 淋巴细胞：95% 以上在成熟之前死去， 不到 5% 成熟后只存活一至几天, T细胞杀伤靶细胞的机制之一， 就是诱使靶细胞凋亡, 癌细胞亦可看作是凋亡失控了的细胞。,52,动物细胞数量控制的途径,53,程序性细胞死亡对发育中神经细胞数量的调节
19、,54,程序性细胞死亡 在形态建成中的作用,In the human foetus, the interdigital mesoderm, initially formed between fingers and toes, is removed by programmed cell death.,The intestinal lumen and other tissues are sculpted by programmed cell death.,55,Male Female,Programmed cell death eliminates unwanted structures during the development of the male and female inner reproductive organs.,56,蝌蚪向蛙发育的变态反应中程序性细胞死亡的作用,57,植物PCD龟背竹,58,不足与过度并存：动脉粥样硬化(内皮凋亡过度, 平滑肌细胞增殖凋亡),凋亡与疾病,凋亡失调,过度：心肌缺血（缺血缺氧） 神经元退行性疾病（氧自由基增加）,不足：肿瘤（Bcl-2基因表达增加） 自身免疫病（识别自身抗原的淋巴细胞）,
