1、遗传病的诊断和治疗,遗传病的诊断,一般诊断（病史、症状、体征、实验室）特殊诊断（系谱分析、染色体检查、特殊生化检测、基因诊断）现症诊断、症状前诊断、产前诊断,现症诊断,一、病史、症状和体征 1、病史： 家族史、婚姻史、生育史 2、症状和体征： 特异性症候群：PKU、半乳糖血症、性染色体病,二、系谱分析,从先证者入手，调查其亲属的健康及生育状况，将调查材料绘制成系谱图进行系谱分析。由于各种单基因遗传病常表现出特定的孟德尔式遗传，所以，系谱分析常有助于单基因病的诊断。,三、细胞遗传学检查,是较早应用于遗传病诊断的辅助手段，能较准确地判断和发现染色体数目和结构异常综合征，因而该方法是确诊染色体病的主
2、要方法。,1染色体检查 亦称核型分析（karyotype analysis）,是确诊染色体病的主要方法。随着显带技术的应用以及高分辩率染色体显带技术的出现和改进，能更准确地判断和发现更多的染色体数目和结构异常综合征，还可以发现新的微畸变综合征。,2性染色质检查,优点是方法简单，主要用于疑为两性畸形或性染色体数目异常的疾病诊断或产前诊断，有一定价值，但确认仍需依靠染色体检查。,3、染色体原位杂交：,应用标记的DNA片段与玻片上的细胞、染色体或间期核的DNA杂交，在样品核酸不改变其结构和分布格局的情况下，研究核酸片段的位置、相互关系。,4、荧光原位杂交（FISH）：,应用荧光素标记的DNA探针与标
3、本进行原位杂交后，使杂交区域发出荧光。优点：快速、安全 灵敏度高 特异性强。 图示为18三体综合征患者的FISH检测,染色体检查的指征：,有明显的智力发育不全、生长迟缓或伴有其他先天畸形者；夫妇之一有染色体异常，如平衡结构重排、嵌合体等；家族中已有染色体或先天畸形的个体；多发性流产妇女及其丈夫；原发性闭经和女性不育症；无精子症男子和男性不育症；两性内外生殖畸形者；疑为先天愚型的患儿及其父母；原因不明的智力低下伴有大耳、大睾丸和（或）多动症者；35岁以上的高龄孕妇（产前诊断）。,四、生化检查,生化检查主要用于生化遗传病的检测。主要针对三方面：1）蛋白、酶活性；2）反应底物、代谢中间产物或终产物的
4、浓度；3）受体的结合能力。例如疑为苯酮尿症患者，可检测血清苯丙氨酸或尿中苯乙酸浓度；粘多糖病可测定尿中硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素等。,五、基因诊断,采用分子生物学方法在DNA水平或RNA水平对某一基因进行分析，从而对特定的疾病进行诊断。,特 点：,针对直接病因诊断特异性强，灵敏度高适应性强，诊断范围广目的基因是否处于活化状态均可，无组织和发育特异性。在感染性疾病的基因诊断中，可检测正在生长的病原体或潜伏病原体。,基因诊断的样本：,可以是任何有核细胞，包括：1、外周血白细胞、口腔粘膜细胞2、活检标本、石腊包埋的组织块3、沉淀细胞（唾液、痰液、尿液）4、羊水细胞、绒毛细胞、 进入母体循环的胎儿细胞应
5、用PCR，样本可微量化到一个细胞,基因诊断的基本技术：,核酸分子杂交聚合酶链反应PCRDNA测序技术,Southern blot印迹杂交,通过用已知基因的DNA片段制备探针与待测基因组DNA的限制性酶切片段进行杂交，分析带谱。可直接确定致病基因的缺陷。是最经典、应用最广泛的分子遗传学技术。常用于基因缺失。,aa/aa aa/- aa/a- a-/- -/-,14kb10kb,10kb 4kb,BamH I,BamH I,左侧：16号染色体上携有数目不同的基因右侧：a基因探针杂交的结果,-地贫基因缺失的诊断,正常,贫血症状,携带者,HbH,限制性片段长度多态性（RFLP）分析：,RFLP：DNA
6、顺序上发生变化而出现或丢失某一限制性内切酶位点，使酶切产生的片段长度和数量发生变化。RFLP分析：利用RFLP与DNA Southern印迹杂交结合对遗传病作出诊断和分析的方法。,镰状贫血的基因诊断：,IVS-I,1.35kb1.15kb,正常 镰性 镰状 性状 贫血,Mst II,1.15kb,1.15kb,1.35kb,IVS-II,珠蛋白基因,Polymerase Chain Reaction (PCR),A method to amplify specific genetic sequences.,Template (DNA or RNA)Two primersdNTPsPCR buf
7、ferKCl, Tris, MgCl2Thermostable DNA Polymerase (Taq),PCR Reagent Components,PCR Cycle：,STEPS,Denaturation: DNA strandsseparate.94oC,Annealing: Primers bind toDNA.65-40oC,Extension: New DNA issynthesized.72oC,Cycle 1,Cycle 2,Cycle 3,Geometric Amplification：,After 30 cycles, theDNA is amplifiedover a
8、billion fold.,基于PCR技术的DNA诊断,PCR直接扩增（大片段缺失）PCR/ASO、PCR/SSCP、PCR/DGGE联合应用（点突变的检测)PCR/Southern blot 联合应用（三核苷酸重复相关遗传病）,多重PCR：在同一PCR体系中加入数对PCR引物，可同时扩增多个DNA片段。常用来检测同一基因的多个外显子的缺失。,PCR/ASO探针斑点杂交：,常用于检测点突变。等位基因特异性寡核苷酸（ allele-specific oligonucleotide，ASO）：人工合成的长约20个核苷酸的DNA片段，其序列与所研究基因的相应区段互补。,Single Strand C
9、onformation Polymorphisms,Gene,PCR,DenatureQuick cool,Non-denaturing gel.Slow run.Cool.,PCR SSCP：,PCR DGGE：,Denaturing Gradient Gel Polymorphisms,PCR/Southern blot 联合应用检测三核苷酸重复相关遗传病：,DNA测序法：,DNA测序（DNA Sequencing)是检测未知突变和已知突变基因的最基本和最重要的实验手段。,基因芯片,又称DNA芯片，（DNA array）.指把成千上万个寡核苷酸或cDNA探针密集、规律地排列在1cm2大小的
10、硅片或玻璃芯片上，容量可达2040万个基因探针。将荧光标记的DNA或cDNA样品送到在芯片上与探针杂交，经激光共聚焦显微镜扫描，以计算机系统对荧光信号做出比较和检测，可迅速得出所需的信息，比常规方法快几十到几千倍。,DNA microarrays on glass slides,表达谱芯片和寡核苷酸芯片,表达谱芯片工作原理：,提取RNACy3标记对照组，Cy5标记实验组。混合两种探针，与芯片杂交扫描仪以两种波长激光扫描，532nm探测Cy3，633nm探测Cy5。Red：明显上调；green：明显下调，yellow：差异不显著。Cy5/Cy3的比率（0.5-2.0)。,寡核苷酸芯片工作原理：,
11、由于DNA链短（20-30nt），单个碱基错配可以降低杂交链的稳定性，Tm值降低5-10控制杂交条件：时间、温度、盐浓度等，可以使完全匹配和单碱基错配的双链杂交几率明显不同。提取基因组DNA，PCR扩增并用荧光标记，与芯片杂交，可以判断待测样品同芯片上哪个片段结合，可知待测DNA序列上特定位点的碱基特征。,基因芯片应用,基因芯片是生物芯片研究中，最先实现商品化的产品。 *寻找新基因 *DNA测序 *疾病诊断 *药物筛选 *毒理基因组学 *农作物优育和优选 *环境检测和防治 *食品卫生监督 *司法鉴定,基因诊断是基因芯片中最具有商业化价值的应用,从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可
12、以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。这种基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。,应用实例,Affymetrix公司，把P53基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，制成P53基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用。Heller等构建了96个基因的CDNA微阵，用于检测分析风湿性关节炎(RA)相关的基因，以探讨DNA芯片在感染性疾病诊断方面的应用。现在，肝炎病毒检测诊断芯片、结核杆菌耐药性检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等一系列诊断芯片逐
13、步开始进入市场。,G6PD缺乏症检测芯片,由G6PD基因的突变、插入和缺失引起。根据已知的基因突变型可设计突变基因探针，制成芯片可同时检测中国人种的8种突变类型，覆盖率达90%以上，并能精确确定突变类型及纯、杂合状况。操作时间短（4小时以内），适于大批量检定。,基因芯片的其他临床应用：,HLA分型地中海贫血检测乙肝耐药性检测,症状前诊断,针对一些发病较迟的常染色体显性遗传病患者在出现症状或生育前对其作出诊断。 基因诊断是症状前诊断的主要手段。,产前诊断,是对胚胎或胎儿是否患有遗传病或先天畸形在出生前进行的诊断,母婴保健法规定：,第二十条 孕妇有下列情形之一的，医师应当对其进行产前诊断： （一）
14、羊水过多或者过少的； （二）胎儿发育异常或者胎儿有可疑畸形的； （三）孕早期接触过可能导致胎儿先天缺陷的物质的； （四）有遗传病家族史或者曾经分娩过先天性严重缺陷婴儿的； （五）初产妇年龄超过35周岁的。,产前诊断的方法,1、非侵袭方法母亲血清、尿液的生化检查B超2、侵袭性方法：根据妊娠时间及检测目的有针对性地选用不同的穿刺取样技术，然后将样品进行实验室检查（细胞遗传学、生化检查、基因诊断）。羊膜穿刺术、绒毛吸取术 、 脐带穿刺术,取样方法 取样时间 待测样品 羊膜穿刺术 孕16-20周 脱落细胞绒毛吸取术 孕7-9周 绒毛膜细胞脐带穿刺术 孕18周 脐带血细胞,羊膜穿刺术：,羊膜穿刺术指征：
15、,高龄孕妇异常的母体血清三倍体标记筛查结果染色体异常家族史神经管缺损/异常母体血清甲胎蛋白生化检查或DNA分析检测的孟德尔遗传病,绒毛吸取术,新进展：着床前诊断,在受精6天胚胎着床前进行。优点：即可避免分娩患儿，又不必行流产术,胚胎移植前遗传病诊断preimplantation genetic diagnosis, PGD,PGD是在体外受精（in-vitro fertilization, IVF）技术、分子生物学和显微操作的基础上，对受精三天后的胚胎在种植前，检查其正常后再移植到子宫的一项新技术，也即所谓第三代试管婴儿技术。一般在卵裂期，当胚胎发育到6-8个细胞阶段，抽取1-2个细胞，进行遗
16、传疾病诊断。根据遗传诊断结果，仅将正常胚胎移植至子宫,PGD的应用：,该技术由英国Handyside医生小组首创，于1990年第1例妊娠成功。目前PGD已成功应用于以下疾病：镰形红细胞贫血、血友病、囊性纤维增生症、地中海贫血和自毁容貌综合征等。1997年1月至1998年9月有66例临床妊娠 .,遗传病的治疗,常规治疗包括：手术治疗、饮食、药物控制和物理疗法。近十年随着人们对遗传病发病机制的逐渐深入及分子生物学技术在医学中的广泛应用，使遗传病的治疗从常规治疗跨入了基因治疗，为根治遗传病带来了希望。,一、常规治疗,1、手术治疗手术矫正畸形改善症状（切脾：遗传性溶血病） 器官和组织移植：重型地中海贫
17、血、遗传性角膜萎缩、a1抗胰蛋白酶缺乏）,2、药物及饮食治疗,补其所缺激素替代疗法：生长激素、胰岛素生化遗传病的补缺：蛋白、酶或反应终产物 禁其所忌：PKU 、半乳糖血症 去其所余促排泄剂：消胆胺代谢抑制剂：别嘌呤醇螯合剂：D-青霉胺平衡清除法：溶酶体储积症换血或血浆过滤,二、基因治疗,指应用DNA重组技术，更换、修正或替代患者细胞中有缺陷的致病基因，纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗的目的。基因治疗可分为：生殖细胞基因治疗体细胞基因治疗,基因治疗的历史：,60年代 Edward Tatum提出在基因水平上纠正缺陷基 因是遗传病治疗的根本途径。1966年 美国国立实验室的Roge
18、rs发现，接触兔乳头 状病毒的实验工作人员中相当部分的血精氨 酸降低。推测病毒核酸进入细胞使精氨酸酶 活性升高。1973年 Rogers用shope兔乳头状瘤病毒感染一个患 有精氨酸血症女孩的皮肤成纤维细胞，使细 胞精氨酸酶活性上升，且可持续7个月。,基因治疗的历史：,1980年 美国Cline等将正常人的珠蛋白质基因转 入两名重型地中海贫血患者的骨髓细胞 并经静脉输回体内。两名患者存活6年。1989年 美国NIH正式批准国立癌症研究所(NCI)和 Rosenberg等进行5例标志基因的人体转移 试验。,基因治疗的历史：,1990年11月 美国NIH的Blease和culver进行了首例人 体
19、基因治疗临床试验。患ADA缺乏症的4 岁小女孩，利用反转录病毒将ADA基因转 移到T淋巴细胞中，再回输。患者免疫力 明显提高，取得了巨大成功。1991年12月 我国复旦大学与长海医院合作进行世界 上首次血友病B基因治疗临床试验。1998年底 经各国政府批准的临床试验方案达329项， 已有2,557名患者接受了正规的基因治疗,基因治疗的类型,（一）基因治疗的策略,1、基因修正：定点导入外源正常基因以代替有缺陷 的基因，对靶细胞基因组其他部分无任何改变。2、基因替代（增强）：将有功能的正常基因转移到疾变细胞或其他细胞基因组的某个部位上，以代替或增强缺陷基因的作用。目前最常用的基因治疗策略。,（一）
20、基因治疗的策略：,3、基因开放：重新开放已关闭的基因，促使与缺陷基因有类似功能的基因表达，以代替异常基因的表达。4、基因抑制：导入外源基因以抑制原有的有害基因表达5、基因封闭：反义RNA被称为基因封条，能封闭 mRNA，抑制基因表达。,（二）基因治疗的步骤,1、目的基因的克隆2、表达载体的构建：为使目的基因有效表达，需在重组载体 中装上启动子或增强子等调控元件,目前基因治疗使用的载体,基因治疗载体的优缺点,3、靶细胞的选择,原则： 1） 耐处理，易于分离及回输 2）具有增殖优势，生命周期长 3）易于转化 4）目的基因表达的细胞特异性 常用：骨髓干细胞；皮肤成纤维细胞； 血管内皮细胞；肝细胞,4
21、、目的基因的转移：,1）在体转移(ex vivo)：将试验对象的细胞取出，体 外培养并导入重组基因，而后将这些经遗传修饰 的细胞重新输回试验对象体内。 特点：经典方法。安全、效果易控制，但步骤多， 技术复杂，不容易推广。2）活体直接转移(in vivo)：将带有遗传物质的病毒、脂质体或裸DNA直接注射到实验对象体内； 特点：操作简便、易推广，为基因转移的发展趋势。,转移方法,化学法：磷酸钙共沉淀、脂质体包埋等方法，通过改变细胞膜的通透性及增加DNA与细胞的吸附而实施基因转移。物理法：显微注射技术、电穿孔法、微粒子轰击法。生物法：病毒介导的基因转移 常用：逆转录病毒、腺病毒及其相关病毒、 单纯疱
22、疹病毒等,（三）已实施的遗传病基因治疗的代表性方案,1、T淋巴细胞为靶细胞的体外途径 从ADA缺陷型患儿外周血中分离出单核细胞，用重组的人类单克隆抗体刺激T细胞增殖，以逆转录病毒载体转染，使ADA基因稳定整合，扩增T细胞后回输。治疗后患儿T细胞数上升，细胞和体液免疫功能及临床症状明显改善，随访5年仍可在患儿体内的T细胞中测得转入的载体序列，其它免疫指标检测也证实其长期作用。,2、以造血干细胞为靶细胞的体外途径,2000年4月，法国科学家在Science上报导：从2名患有严重型免疫缺陷症的患儿骨髓中抽取出造血干细胞，以逆转录病毒为载体将正常基因导入造血干细胞中，然后回输给病孩。经过10个月的随访
23、获得了较满意的效果，患儿的免疫系统达到正常水平。干细胞水平的治疗方案不像成熟的T细胞那样需要反复回输，减少了患儿反复注射的痛苦，同时基因表达的水平也明显高于以前的方案。可见，干细胞水平基因治疗会成为今后发展的方向。,3、以皮肤成纤维细胞为靶细胞的体外途径,应用逆转录病毒载体转染血友病B患者的成纤维细胞，回植到患者皮下，使患者血浆中IX因子抗原活性升高1-2倍，并持续2年以上，鼻出血等症状有所好转，每年所需输血次数减少。但转入的IX因子表达水平仍有待进一步提高。,（四）基因治疗中存在的问题及对策,1、插入突变 为基因治疗临床试验前首先要考虑的问题。由于基因治疗尚未发展到定点整合的阶段，随机整合有
24、可能激活原癌基因或使抑癌基因失活，从而引起细胞癌变。相对而言，腺病毒对人类的安全性要高于逆转录病毒。,1999年9月，1名18岁的青年在宾夕法尼亚大学的基因治疗试验中意外死亡。2002年法国连续发现2名接受基因疗法的“气泡儿童”出现了类似白血病的症状。美国FDA2003年1月宣布：鉴于法国接受基因治疗的“气泡儿童”患上了白血病，该局决定暂停27项类似的基因治疗试验。,2、免疫原性 临床治疗有时需多次操作，使机体产生免疫反应，排斥携带基因的病毒或靶细胞，给进一步治疗造成困难。,3、转基因体内表达水平及稳定性问题 基因进入靶细胞后，基因表达不稳定甚至不表达；靶细胞在复制时，新基因可能被丢失。现正研究利用高效的启动子构建入载体及使用寿命较长的靶细胞，如干细胞。4、伦理问题,
