1、,弧 菌 属(Vibrio)侯 珏临 床 微 免 教 研 室,目的与要求1、掌握霍乱弧菌及副溶血弧菌的主要生物学性状、微生物鉴定方法2、 熟悉霍乱弧菌及副溶血弧菌致病性,一、概述,弧菌科包括4个菌属 弧菌属 气单胞菌属 邻单胞菌属 发光杆菌属 共性： 革兰氏染色阴性 氧化酶阳性 发酵糖类 具有极端单鞭毛,弧菌属,分布广泛, 水中最多共36个种, 引起人类致病的14种 短小弧形, 革兰阴性菌单鞭毛能发酵葡萄糖氧化酶阳性对弧菌抑制剂O/129 （二氨基二异丙基喋啶）敏感钠离子能刺激其生长,一 霍乱弧菌(Vibrio cholerae),霍乱弧菌是霍乱的病原菌我国传染病防治法: 甲类传染病国际检疫的
2、烈性传染病到目前为止共发生了七次霍乱世界大流行,流行情况 1817-1923年 六次大流行 （均从印度恒河三角洲发源地） 古典生物型1961年 第七次大流行 El Tor生物型1992年 亚洲流行（印度、盂加拉、泰国） O139群,一、生物学特性,形态与染色,革兰氏染色阴性弧型或逗点状,米泔水样粪便涂片镜检：可见“ 鱼群样排列单端单鞭毛，无荚膜，无芽胞活菌悬滴镜检, 可见“ 穿梭或流星状运动”,霍乱弧菌（革兰染色，1000倍）,Vibrio cholerae with its single polar flagellum.,营养要求不高，生长较快兼性厌氧最适生长温度： 37怕酸嗜碱，最适pH:
3、7.2-7.4 pH:7.4-9.6快速生长,培养特性,培养特性,选择性的增菌培养基:碱性蛋白胨水pH8.5 常用的强选择性培养基：庆大霉素琼脂(GTA)pH8.4-8.5四号琼脂pH8.4硫代硫酸盐-枸橼酸盐-胆盐-蔗糖琼脂平板 (TCBS琼脂)pH8.6常用的弱选择性培养基：碱性琼脂pH8.4碱性胆盐琼脂pH8.4,培养特性,菌落特征TCBS琼脂：形成圆形、微凸、表面光滑 湿润整齐、大黄色菌落庆大霉素培养基：扁平、湿润、半透明菌落中心呈灰褐色血琼脂上形成的菌落较大，EL Tor生物型可形成-溶血,霍乱弧菌培养于TCBS琼脂（37，18小时）发酵蔗糖产酸而使菌落呈黄色,生化反应,发酵葡萄糖、
4、甘露醇、蔗糖，产酸不产气能分解色氨酸赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶（+）精氨酸双水解酶（-）氧化酶（+）,抗原性,O抗原：耐热，耐受100 2h 特异性高，分群和分型的基础H抗原：不耐热，特异性低,抗原性,根据O抗原不同: 霍乱弧菌分155个血清群根据与O1抗血清凝集与否： O1群 ：与O1抗血清凝集（+） 非 O1群： 与O1抗血清凝集（-）O1群 根据表型差异： 古典生物型 EL Tor生物型 菌体抗原（A、B、C)不同：小川型(AB) 稻叶型(AC) 彦岛型(ABC,血清型：O1群霍乱弧菌的菌体抗原由A、B、C三个抗原成份组成,性状生物型 古典型 EL Tor组噬菌体裂解 + -组噬菌体裂解 -
5、+ 对多粘菌素B的敏感性 + -鸡RBC凝集 - +羊RBC溶血 - +V-P - +霍乱弧菌两个生物型 的鉴别,生物型：根据表型差异,O1群霍乱弧菌有古典生物型和E1 Tor 生物型之分,鸡红细胞凝集试验：在玻片上滴加生理盐水一滴，取被检菌18-24h培养物少许在盐水中制成浓厚菌悬液，然后加一滴2.5鸡红细胞悬液，充分混匀，,1min内出现凝集者为阳性，红细胞呈均匀分散者为阴性。El Tor生物型为阳性，古典型为阴性。,分型和分群,（一）、血清學分群（型） 血清 群 生物型 血清型 古典型 小川型(AB) 稻叶型(AC) 彦岛型(ABC) O1群 小川型(AB) El Tor型 稻叶型(AC
6、) 彦岛型(ABC) 非 O1群 (O2- 群),变 异 性,抵抗力水中存活20天怕酸耐碱庆大霉素耐药消毒 漂白粉：吐泻物（1：4）,1hr,二、临床意义,致病物质侵袭力： 鞭毛 菌毛霍乱肠毒素（cholera enterotoxin ,CE),致病机理,霍乱弧菌,胃,对酸敏感，很快被杀死,肠,胃酸降低或缺乏，菌体增多,鞭毛、菌毛、粘液素酶,绒毛上大量繁殖,CT的B亚单位结合神经节苷脂受体,形成膜通道,A1肽链进入细胞,ATP cAMP,大量体液和电解质进入肠腔而发生剧烈吐泻,大量脱水和失盐,发生代谢性酸中毒，血循环衰竭，甚至休克或死亡,激活腺苷酸环化酶系统,粘膜细胞分泌亢进、Na+、Cl-吸
7、收抑制,二、临床意义,所致疾病 霍 乱,烈性肠道传染病我国的法定传染病（甲类）表现为剧烈的上吐下泻泻出物呈“米泔水样”，并含大量弧菌，此为本病典型的特征,微生物学检查,标本采集粪便（主）肛拭子呕吐物尸体肠内容物 采得的标本应立即接种于培养基 不能立即检查的，要放入碱性蛋白胨水或插入Cary- Blair运送培养基中 标本与保存液比例约为15,检验程序,标本 直接检查碱胨水增菌培养 直接荧光抗体染色 CT测定 直接涂片 凝集试验 动力及制动试验TCBS等分离培养 血清学鉴定 药敏试验 初步报告 生化鉴定、分型 确诊报告,检验方法一.直接检查1.直接涂片镜检:革兰氏染色阴性,鱼群状排列的弧菌2.动
8、力及制动试验动力观察：采取病人“米泔水样”大便或呕吐物制成悬滴片，观察细菌动力，可见流星或穿梭状动力的细菌。制动试验： 标本， 霍乱多价诊断血清（效价1：64），用暗视野镜观 察，3分钟内运动被抑制的即为阳性 快速而特异操作简便，但必须有数量较多的弧菌才检出3.直接荧光抗体染色 4. CT测定,检验方法二.分离培养：,分离用的培养基有强、弱2种选择培养基。弱选择培养基：碱性琼脂和碱性胆盐琼脂。强选择培养基：常用的有庆大霉素琼脂、4号琼脂和 TCBS琼脂等现多采用碱性蛋白胨水增菌，再用强选择培养基进行分离。,检 验 方 法三. 鉴定 以血清学（玻片凝集）为主，结合形态学、生化反应作出判断1.玻片
9、凝集试验:试剂;O1群霍乱弧菌多价和单价诊断血清 O139群诊断血清方法:从分离培养基上挑取可疑菌落于霍乱弧菌多价诊断血清作玻片凝集试验。诊断血清应稀释成1:32-1:64的效价使用，立即出现凝集者为阳性，同时设生理盐水和阳性细菌株对照,2. 形态学检查 取纯培养物涂片革兰氏染色，观察菌体形态及染色性 用悬滴法或半固体穿刺法检测动力,3. 生化反应分解葡萄糖、蔗糖，产酸不产气；氧化酶试验（+）吲哚（+）赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶（+）精氨酸双水解酶（-）霍乱红试验（+）粘丝试验（+）O/129敏感试验(+) 耐盐试验: 3%NaCl(+), 6%NaCl(+) 0% NaCl(+), 10% NaC
10、l(-),红色,硝酸盐 亚硝酸盐色氨酸 靛基质 浓硫酸,霍 乱 红 反 应（cholera red test）,5. 分型鉴定(1) 使用小川型及稻叶型的单价血清作玻片凝集反应 小川型单价血清凝集 稻叶型单价血清小川型 + -稻叶型 - +彦岛型 + +(2)古典型和埃尔托型的鉴别 我国流行以El Tor、小川型霍乱弧菌为主,鉴定依据,1、形态学 G弧菌或杆菌，具有活泼动力， 制动试验阳性；2、培养特点 弧菌选择培养基上菌落形态典型；3、血清学 能与霍乱弧菌诊断血清发生明显凝集；4、生化反应 分解葡萄糖、蔗糖，产酸不产气 氧化酶试验（+），霍乱红试（+） 粘丝试验（+）, O/129敏感试验(
11、+),报告方式,1、标本直接镜检：见形态典型、运动活泼、制动试验（+），可作初报。2、若确定为霍乱弧菌时，可报告：经培养有霍乱弧菌生长。,139型霍乱弧菌O139血清群它是已发现的第一个能引起霍乱流行的非1群霍乱弧菌目前世界卫生组织规定，霍乱病原菌包括O1群霍乱弧菌与O139群霍乱弧菌与1群霍乱弧菌O抗原不同；O22群与O155群有交叉反应对弧菌抑制剂/129的低浓度和高浓度均具有抗性具有荚膜对多种抗生素耐药,副溶血弧菌 Vibrio parahaemolyticus,概述,副溶血弧菌隶属于弧菌科弧菌属，是一种具有嗜盐性的细菌,需在NaCl浓度较高(3%-4%左右)的环境中才能生长繁殖。是沿海
12、地区食物中毒和急性腹泻的主要病原菌。,生物学性状,形态与染色,革兰阴性菌杆状无荚膜、无芽胞单鞭毛,培养特性,具有嗜盐性，氯化钠的最适浓度为3.5%；增菌培养基: 1%NaCl碱性蛋白胨水或 4%NaCl蛋白胨水TCBS琼脂: 菌落圆形、隆起、光滑、湿润、不透明， 蓝绿色SS琼脂： 2-3mm，扁平、无色、半透明、蜡滴状， 菌落不易挑起我妻琼脂培养集: 溶血(神奈川现象，KP),生物学性状,生物学性状,生化反应,( 1) 耐盐试验 3%NaCl(+), 7%NaCl(+) 0% NaCl(-), 10% NaCl(-) (2) 神奈川现象（3) 氧化酶(+) 、蔗糖(-) 吲哚试验(+)、赖氨酸
13、脱羧酶（+） 鸟氨酸脱羧酶（+）,抗原构造与血清学分型,（1） 鞭毛(H)抗原 （2） 菌体(O)抗原 是分群的依据 （3） 表面(K)抗原,生物学性状,抵抗力,抵抗力弱不耐冷不耐热6530min即被杀死耐碱怕酸,生物学性状,二、临床意义,1、致病因素: 粘附因子和毒素（1）菌毛（2）毒素 1）耐热性溶血素 细胞致死活性 溶血作用 肠毒性作用 心脏毒性 2）耐热相关溶血素 2、所致疾病 食物中毒、急性胃肠炎,三、微生物学检测 1、标本采集 取粪便、肛拭子和可疑食物。2、 检验程序 标本 增菌培养（4%NaCl蛋白胨水） 分离培养(TCBS) 可疑菌落（绿色） 纯培养（营养琼脂） 毒素测定 鉴定
14、（生化、血清学检验）,3、检验方法,（1） 增菌培养：1%NaCl的碱性蛋白胨水 4%NaCl的蛋白胨水 35，6-8h;（2） 分离培养：标本(增菌培养物) TCBS琼脂 35，18-24 h（3） 鉴定： 嗜盐性试验：3%NaCl(+), 7%NaCl(+) 0% NaCl(-), 10% NaCl(-) 氧化酶阳性、蔗糖阴性、 赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶（+）精氨酸双水解酶（-） KP(+),4、鉴定依据（1）形态染色特点：G-杆菌具有多形性,悬滴标本运动活泼；（2）培养特点：在选择平板上菌落形态典型，TCBS琼脂 上菌落为蓝绿色；（3）嗜盐性试验：3%NaCl(+), 7%NaCl(+) 0% NaCl(-), 10% NaCl(-)；（4）生化反应：KP(+),氧化酶阳性、蔗糖阴性、脲酶阴性等。（5）毒素测定5、报告方式：经分离培养和鉴定试验，符合鉴定依 据各项即可报告：“有副溶血弧菌生长”。,谢 谢,
