1、 * 基金项目：重庆市自然科学基金（csic,2006BB5427） 。作者简介：郭变琴，女（1979） ， 主管检验师，硕士，主要从事乳腺癌方面的研究。电话：13512388623 E-mail: 。 通信作者：电话：（023）65330078 ， E-mail: WLX。SYBR 实时荧光定量 PCR 检测人乳腺癌细胞 AnnexinmRNA 方法的建立及应用郭变琴，黄学梅 , 吴立翔 （重庆市肿瘤研究所检验科；重庆 400032）摘要 目的 建立检测人 AnnexinmRNA 含量的 SYBR 实时荧光定量 PCR 方法，并用其测定人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 和 MCF-7 中
2、Annexin mRNA 水平。方法 根据人 Annexin II mRNA 的保守序列设计特异性引物，提取人乳腺癌细胞总 RNA，并逆转录为 cDNA，胶回收纯化 PCR 产物,并与 pGM-T 载体连接构建质粒标准品,进一步通过 SYBR 实时荧光定量 PCR 检测人乳腺癌细胞中 Annexin mRNA 水平。结果 该方法标准曲线的 r2 为0.997，融解曲线分析显示单个峰，pGM-T Annexin II 质粒标准品高、低拷贝数的批内、批间变异系数分别为 6.2%，7.8%和 9.1%和 12.3%。进一步的研究表明人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 中 Annexin mRNA 显
3、著高于 MCF-7( P0.01)。结论 建立的检测人 Annexin II mRNA 的 SYBR 实时荧光定量 PCR 方法灵敏、特异且重复性好，并可用于乳腺癌细胞中Annexin mRNA 的定量。关键词: Annexin；SYBR 实时荧光定量 PCR；乳腺癌细胞 中图分类号 R737-9 文献标识码 AThe establishment and application of a SYBR real time fluorescence quantitative PCR for detection AnnexinII mRNA of human breast cancer cells G
4、UO Bian qin，HUANG Xue mei，WU Li xiang（Chongqing Cancer Institute ，Chongqing 400032）Abstract： Objective To establish a SYBR based realtime fluorescence quantitative PCR method for detection human AnnexinII mRNA expression；and detect AnnexinII mRNA in human breast cancer cells（MCF-7，MDA-MB-231. Method
5、s The specific primers were designed according to the conserved sequence of human Annexin II gene. Total RNAs were extracted from human breast cancer cells (MCF-7，MDA-MB-231)，then the RNAs were transcribed reversely into cDNAs. The plasmid standards were constructed. The sensitivity and specificity
6、of the method were evaluated. The relative expression levels of human AnnexinII mRNA in human breast cancer cells were detected by this method. Results The squared of correlation coefficient of the standard curve of this method was 0.997, melting curve analysis showed single peak. The relative expre
7、ssion levels of human AnnexinII mRNA in MDA-MB-231 were higher than MCF-7 (P0.01). Conclusions The method to detect AnnexinII by realtime fluorescence quantitative PCR was good in sensitivity, specificity and linear function. It can be used as a standard method of qRTPCR for detection of human Annex
8、inII expression.【Key words】 ：Annexin；SYBR real time fluorescence quantitative PCR；breast cancer cellsAnnexin 最早是作为 Rous 肉瘤病毒转化基因的酪氨酸激酶底物于 1982 年被发现的，属于 Annexins 蛋白家族成员之一，是一种 ca2+依赖的磷脂结合蛋白 【1】 。目前研究表明，Annexin II 在多种恶性肿瘤中呈高表达 【2-4】 。本课题拟建立一种检测人 Annexin mRNA的 SYBR 实时荧光定量方法，进一步检测人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 及 MCF-
9、7 中AnnexinmRNA 水平，为深入研究 Annexin在乳腺癌中的功能作用奠定基础。1 材料与方法1.1 材料：1.1.1 乳腺癌细胞系 MDA-MB-231、MCF-7 （中科院上海细胞研究所） ；RNA rose 质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒 (上海华舜) ；RT-PCR，SYBR 实时荧光定量 PCR 试剂盒（ TAKARA 公司） ；Annexin ，-actin 引物（ Invitrogen 公司） ；PGM-T(TIAN GEN 公司)；AMP( 上海闪晶公司)；RPMI-1640 和小牛血清(GIBCO)。1.1.2 引物的设计 根据 Annexin(gi:1542661
10、2, gi:50845387,gi:5084538,gi:50845389 ),-actin(gi:28251) 序列，在其高保守区应用 DNAssist Primer5.0 软件设计各自的引物.Annexin 引物序列：F：5- ACTTTGATGCTGAGCGGGATG-3R：5-CGAAGGCAATATCCTGTCTCTGTG-3，扩增长度为 126bp；-actin 引物序列： F: 5-TCATGAAGTGTGACGTGGACATC -3；R：5- CAGGAGGAGCAATGATCTTGATC -3 ，扩增长度为 156 bp。1.2 方法1.2.1 细胞培养：人乳腺癌细胞 MDA
11、-MB-231MCF-7 接种于含 10%小牛血清，PH 为 7.4的 RPMI1640 的培养基中，置 37，5%CO2 培养箱中培养，至对数生长期进行实验。1.2.2 总 RNA 的提取和 RT-PCR 反应：取对数生长期的细胞，其融合达到 90%，每瓶（25cm2）加入 RNA rose1ml 充分吹打，转移至 1.5 ml EP 管中，按 RNA rose 提取试剂盒说明进行，核酸紫外分析仪检测 RNA 质量和浓度。逆转录得到 cDNA 第一链, 分装置于- 20冰箱备用。50 ul PCR 反应的体系为：10xPCR buffer 5ul, dNTP Mixture:2ul, Pri
12、mer-F:0.5ul, Primer-R:0.5ul 反转录液： 5ul ,TaKaRaExTaqTMHs:0.5ul, 灭菌水：36.5ul. Annexin ,-actin 的反应条件为 95预变性 5min ,9430sec，6030sec，72 17sec，30 个循环，72延伸 5min.1.2.3：目的片段的纯化及 T-A 克隆: 1.2.3.1 目的片段的纯化:将 50l 的 PCR 产物全部上样电泳, 在紫外灯下将目的条带切下并按说明书进行胶回收。回收的纯化产物再电泳鉴定其纯化效果, 另取 5l 用核酸分析仪测浓度。1.2.3.2 T-A 克隆: T4 DNA 连接酶的 10
13、连接缓冲液 5l、pGM- T 载体 1l、T4 DNA 连接酶 1l、目的片段的纯化产物 0.25l，用移液器吹打连接反应液，混匀，置 16 7h 。1.2.4 感受态细胞的制备及转化： 采用 CaCl2 法制得感受态细胞 DH5,取一管感受态细胞( 200l) ，加入 10l T-A 克隆产物进行转化 , 在转化后的 200l 大肠杆菌混合液中加入1mlLB 液体培养基(不含 AMP),混匀后，37振荡培养 1 小时,将此菌液摇匀后取 100ul 涂布于含氨苄青霉素( 100g/ml) 的 LB 固体培养基上, 37孵箱培养过夜。1.2.5 阳性克隆的鉴定: 1.2.5.1 菌落 PCR:
14、挑数个单菌落分别溶于 10 ul 无菌水中,在 PCR 仪内 99加热 10min 裂解细菌, 12000rpm 离心 1min,分别取上清 2l 做模板，用 Annexin 引物进行 PCR 扩增, 电泳检测是否有目的片段。1.2.5.2 测序: 挑产生目的片段的单菌落接种于 2ml LB(含 AMP) 液体培养基,37过夜, 取1ml 放入 EP 管内送上海生工测序。1.2.6 质粒定量及稀释：1.2.6.1 质粒的定量：测序结果证实为 Annexin 片段成功克隆至 PGM-T 载体后，按照上海华顺质粒抽提试剂盒说明大量制备质粒，以质粒为模板,用 Annexin 引物进行验证。用核酸分析
15、仪检测 3 次抽提质粒的浓度, 并取平均值，采用公式：( 抽提质粒的浓度6.021023copies/mol) /(载体的碱基+ 插入目的片段的碱基 )660，将 Annexin质粒换算成copies/ml。1.2.6.2 质粒的稀释：用双蒸馏水将重组 Annexin 质粒标准品原液作梯度稀释，用于后续Annexin mRNA 定量。1.2.7 特异性的评价 将标准品及乳腺癌细胞 cDNA 的 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，并分析荧光定量 PCR 的溶解曲线，验证该方法的特异性。1.2.8 重复性的分析 以 PGM-T Annexin II 质粒标准品相对低拷贝数(104copies/l)和
16、相对高拷贝数(107copies/l)在批内和批间均重复检测 10 次作为重复性实验，获取各自的变异系数。1.2.9 SYBR 实时荧光定量 PCR 检测乳腺癌细胞中 Annexin mRNA20l 的 PCR 反应体系: SYBRpremix ExTaqTM(2x)10.0ul,primer-F :0.3ul,primer-R:0.3ul,RoxDye(50x)0.4ul;cDNA:2.0ul,dH2O7.0ul.9510sec1 个循环，955sec,62 31sec共 40 个循环,9515sec,60 20sec,9515sec 1 个循环,ABI7000PCR 仪检测标准品 Anne
17、xin 的线性范围及乳腺癌细胞中 Annexin II mRNA copies/l。1.2.10 统计学方法 应用SPSS12.0软件行相关数据分析, 计量资料采用Error!s表示; 两组均数的比较用t检验， P0.01为具有显著性差异。2 结果2.1 RNA 质量：核酸分析仪测抽提总 RNA A260/A280 吸光度比值在 1.82.0 之间, 提示总 RNA 质量较好, 总 RNA 浓度为 1 0002500g/ ml。2.2 RT-PCR 扩增乳腺癌细胞中 AnnexinII mRNA：RT-PCR 检测人乳腺癌细胞中 MCF-7及 MDA-MB-231 中 AnnexinIImRN
18、A，产物电泳显示清晰的目的条带。所有产物均上样电泳，纯化、回收，Annexin 浓度为 136 ng/ul。见图 1图 1：RT-PCR 检测 MCF-7、MDA-MB-231 中 AnnexinII mRNA1,2 代表 MDA-MB-231; 3，4，5 代表 MCF-72.3 阳性克隆的鉴定：2.2.1 菌落 PCR: 细菌经高温裂解后，用 Annexin 引物进行 PCR, 产物电泳显示清晰的目的条带。见图 2Maker 1 2 3 4 5Annexin II图 2：PCR 检测菌落 AnnexinII mRNA2.2.2 菌落测序结果：产生目的片段的单菌落测序结果显示： 所测 Ann
19、exin 序列与目的片段序列完相同。见图 3图 3：Annexin 阳性克隆菌落测序结果2.3 质粒的定量及稀释：分别以含 Annexin 质粒为模板，使用 Annexin 的引物进行PCR 扩增, 产物电泳显示清晰的目的条带，表明 Annexin 片段成功克隆至 PGM-T 载体上，可用于标准品的制备。通过公式计算得出，Annexin 原液浓度为7.721010copies/ml，用双蒸馏水将重组 Annexin 质粒标准品原液作梯度稀释，稀释后浓度为 7.72109、7.72108 、7.72107、7.72106、7.72105 、7.72 104、7.72103、7.72102 cop
20、ies/ml；2.4 SYBR 实时荧光定量 PCR 检测 Annexin II 熔解解曲线和标准曲线2.4.1 溶解曲线：主要呈单个熔解曲线峰，表明定量 PCR 产物 Annexin 具有特异性。见图 4A2.4.2 标准曲线：成功地构建了人 Annexin 基因检测的标准曲线, 其线性范围分别可达 6个数量级, 重组质粒 Annexin 浓度在 7.721037.72108 copies/ml 之间 Cp 值与起始浓度的 log 值具有很好的线性(slope=-3.09, r2=0.997) 。见图 4BAnnexin IIMakerA B图 4：SYBR 实时荧光定量 PCR 检测 An
21、nexin 标准曲线和溶解曲线 A： PGM-T Annexin 溶解曲线；B ：PGM-TAnnexin 标准曲线2.5 SYBR 实时荧光定量 PCR 检测 Annexin II mRNA 标准品的重复性： PMG-T Annexin II质粒标准品相对低拷贝数(104copies/l)批内和批间变异系数分别为 9.1%和 12.3%;PMG-T Annexin II 质粒标准品相对高拷贝数(107copies/l)批内和批间变异系数分别为6.2%，7.8% 。2.6 Annexin mRNA 在人乳腺癌细胞中的水平：高转移人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 中Annexin mRNA 含
22、量显著高于低转移人乳腺癌细胞 MCF-7（P0.05)。见表 1表 1：Annexin mRNA 在人乳腺癌细胞中的含量（ n=3，拷贝/L，Error!s) P*0.01,与 MCF-7 比3 讨论: Annexin II 又 名 P36，ANX2，其基因位于 15q21q22，编码的蛋白有 339 个氨基酸，分子质量 36kd，在人体内皮细胞 、单核/ 巨噬细胞 、骨髓细胞和某些肿瘤细胞中表达丰富 【1】 。研究表明：Annexin 在多种肿瘤中高表达：在结肠癌中，Annexin 过表达与肿瘤的大小、组织学类型、浸润深度及 TNM 分期相关，与转移性无关，但和 TenascinC 的共同表
23、达却与结肠癌的进展和转移相关，并提示预后不良 【5】 ；此外，有研究发现 Annexin 蛋白的表达水平与星形细胞瘤恶性程度的分级相关，恶性程度越高，表达水平越高，可以作为胶质瘤分级的指标，提示预后 【6】 。但 Annexin 并非在所有肿瘤中均呈现高表达状态，相反，Annexin 在某些肿瘤中表达下调，如：前列腺癌 【7】 ，食管癌 【8】 ，转染细胞株 Annexin mRNA -actin mRNA Annexin/-actinMCF-7 （19.230.60）103 （4.740.71）108 （4.060.81）10 -5MDA-MB-231 （2.750.02）107 （2.42
24、0.07）108 0.110.03*Annexin 基因的前列腺腺癌细胞恢复表达，对肿瘤细胞的增殖和凋亡无影响，但迁移能力被抑制；Annexin mRNA 和蛋白在人食管鳞状细胞癌组织中低表达，在中分化和低分化肿瘤中，蛋白表达明显低于高分化肿瘤。 Sharma MR 等 【9】 研究者报道 Annexin 在正常和增生的乳腺导管上皮细胞 Annexin 无表达，而乳腺浸润性导管癌和原位癌中有表达。据此，我们推测 Annexin 在乳腺癌的发生中可能起着重要作用。本课题拟建立一种检测人 Annexin II mRNA 的 SYBR 实时荧光定量 PCR 方法，以期为进一步深入探讨 Annexin
25、 II 在乳腺癌发生中的作用奠定基础。PGM-T Annexin II 质粒标准品在 103108copies/l 范围内，标准曲线的 r2 为 0.997，说明该方法的线性较好;此外，溶解曲线呈单个峰，经琼脂糖凝胶电泳分析，只有目的基因而无引物二聚体等非特异性扩增产物，说明该方法的特异性较好；另外，重复性分析显示：批内和批间的变异系数均在可接受的范围内。因此，本研究建立的检测人 AnnexinII mRNA的 SYBR 实时荧光定量 PCR 方法特异且重复性好，能够准确检测 Annexin II mRNA 的含量。我们应用成功构建的 Annexin II 质粒标准品，通过 SYBR 实时荧光
26、定量 PCR 检测人乳腺癌细胞高转移株 MDA-MB-231 与低转移株 MCF-7 中 Annexin II mRNA 水平，结果显示：MDA-MB-231 中 Annexin II mRNA 显著高于低转移株 MCF-7，由此我们推测 Annexin II 可能在乳腺癌的转移性上起一定作用，在进一步的研究中我们将加以证实。参考文献：1 萧笑，王元，张思河.钙依赖性磷脂结合蛋白 Annexin II 的研究进展J. 第四军医大学学报,2007,（6）:570-572.2 Emoto K，Yamada Y，Sawada H，eta1 AnnexinII overexpression corre
27、lates with stromal tenascinC overexpression：a prognostic marker in colorectal carcinomaJ.Cancer，200l, 92(6) ：1419-1426.3 Frohlich M，Motte P，Galvin KEnhanced expression of the protein kinase substrate p36 in human hepatocelluar carcinonmJ.Mol Cell Biol,1990，10(6):3216-3223.4 Emoto K， Sawada H， Yamada
28、 Y， et a1. Annexin II overexpression is correlated with poor prognosis in human gastric carcinomaJ.Anticancer Res，2001，21(2B)：1339-1345.5 Emoto K，Yamada Y，Sawada H，et a1. Annexin II overexpression correlates with stromal tenascinC overexpression： a prognostic marker in colorectal carcinomaCancer，200
29、l,92(6)：1419-1426.6 Roseman BJ,Bolen A,Hsu J,et al. Annexin II marks astrocytic brain tumors of high histologic gradeJ.Oncol Res,1994,6(12):561-567.7 Lehnigk U， Zirnmermann U，Wenckhans C，et a1. Localization ofarmexins I,II,IV and VII in whole prostate sections from radical prostatectomy patientsHist
30、ol Histopathol，2005，20(3)：673-680.8 张洵，支会英，张健，等钙磷脂结合蛋白在人食管鳞状细胞癌中的表达中华肿瘤杂志，2003，25(4)：353-355 9 Sharma MR，Koltowski， Ownbey RT，et a1. Angiogenesis associated protein annexin in breast can cer： selective expression in invasive breast cancer and contribution to tumorinvasion and progression. Exp Mol Pathol,2006，81(2)：146-156.本文建立检测人 AnnexinmRNA 含量的 SYBR 实时荧光定量 PCR 方法，并用其测定人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 和 MCF-7 中 Annexin mRNA 水平。内容可信，图片清晰。遗憾的是，实时定量 PCR 方法在科研上应用较普及，用于基因检测，只是比 RT-PCR 精确度高些而已。建议作基础研究刊用。
