1、全国基层医疗机构抗菌药物合理应用,培训项目,临床微生物实验室规范化管理,天津市第一中心医院 张坚磊,临床微生物学所面临的挑战,（一）新传染病的不断出现 使临床对感染性疾病的诊断和治疗陷入了困境 （二）多重耐药细菌的出现 随着抗生素的广泛应用，我国已经提早步入抗生素高水平耐药的国家行列，某些菌株的耐药性甚至位居全球之首,及时、准确的病原菌诊断正确的形态学分析与病原鉴定，具备疑难病原确认技术细菌耐药性监控标准的抗药性检测与结果解释医院感染的监控 能快速反应医院感染与应急事件 必须规范临床微生物实验室的管理,临床微生物室所面临的任务,国际上实验室的规范化标准,美国国会的临床实验室改进法案修正案198
2、8（简称CLIA88）法国政府也于1999年11月发布了NOR：MESP9923609A关于正确实施医学生物分析实验的决议。 ISO 15189医学实验室质量和能力的具体要求,卫生部于2006年6月1日颁布 医疗机构临床实验室管理办法2008年31家医院实验室通过认可ISO15189医学实验室质量和能力的专用要求,我国实验室规范化管理进程,临床实验室管理办法,第一章 总则 （5条）第二章 实验室管理的一般规定 （16条）第三章 实验室质量管理 （11条）第四章 实验室安全管理 （11条）第五章 监督管理 （9条）第六章 附则 （4条）,5. 技术要求5.1 人员5.2 设施和环境条件设施5.3
3、 实验室的设备5.4 检验前程序5.5 检验程序5.6 检验程序的质量保证5.7 检验后程序5.8 结果报告,ISO 15189医学实验室质量和能力的专用要求,ISO15189认可与微生物实验室,ISO15189医学实验室质量和能力的专用要求按照其质量管理体系要求，改进检验流程、规范实验操作、提高检测能力，使每项微生物检验技术与诊断报告可追溯到体系的源头，为客户提供准确、快速、安全、经济的微生物专业诊断服务. 既从病人准备、标本采集、标本传递与方法选择，到诊断报告得出、结果解释与指导临床的标准化过程.,参考CLSI 文件从以下7方面提出建议,标本采集和运送的基本规范；培养前标本质量检测基本规范
4、标本分离的基本规范细菌鉴定基本规范；细菌药物敏感试验基本规范；实验室质量保证基本规范；细菌报告基本规范；,一.标本采集和运送,标本采集和运送是细菌培养成功的最最重要的关键微生物人员和临床医护人员一道，根据临床微生物检验规范的规定，研讨和制定本院微生物标本采集、保存和运送的具体要求。要广泛宣传，认真实施，建立健全标本验收制度，对于不合格的标本要坚决退回，说明原因，要求重送。,美国与欧洲对实验室的新要求,NCCLS M40 标 准 DIN 58942 标 准,1.痰标本的采集和运送,1. 标本采集时间：用抗生素前2. 采集方法：自然咳痰：必须用请水漱口3次，应包括咽喉部，立即用力咳出痰，于灭菌容器
5、中或输送培养基中。支气管镜或支气管毛刷:由医生采集，建议直接种入输送培养基,2.泌尿标本的采集和运送,1采集后的标本应立即送检。2采集时间：多数药物从尿道排泄，所以不管用哪种方法都应在用药前采集。应采集早晨第一次的尿。3 标本管不应含防腐剂和消毒剂。4.长期留置导尿管的患者应在更换新管时留取尿标本。5. 做厌氧培养时应膀胱穿刺采集尿。,3.分泌物的采集和运送,1. 对开放性病灶的采集：如眼结膜脓性分泌物、扁桃体、外耳道、手术后切口、导管治疗感染、瘘管内脓液、生殖道分泌物等均属于开放性病灶。应先用灭菌生理盐水冲洗表面污染菌，去除旧的分泌物，用灭菌拭子采集病灶深部的分泌物，也可取感染部位下的组织送
6、检。2. 闭锁性脓肿：如淋巴脓肿、肺脓肿、肝脓肿、腹腔脓肿、盆腔脓肿等，对封闭的脓肿常采用穿刺或引流的的方法采样，应在用药前采集，应注意脓液的气味、性状、颜色注意厌氧菌存在的可能。不能及时送检应应用输送培养基。,4.便标本的采集和运送,1.采集时间：腹泻患者应在用药前、急性期采集；沙门菌感染、肠热症应在2周内采；厌氧菌出现症状即采集。2.采集方法：自然排便者可用小木棒挑取有脓血和黏液的部位的粪便2-3克，如液状粪便取絮状物盛于无菌的、密封的、不吸水的、容器内或直接盛于增菌液或保存液中；对不易获得粪便患者及幼儿，可用直肠拭子采集后置保存液或输送培养基中送检。,便标本的采集和运送,注意事项：虽然粪
7、便标本本身含很多细菌但也要用无菌容器。在患者病情许可的条件下应在用药前采集标本。应床边接种或置输送培养基送检。厌氧细菌（难辩梭菌）培养的标本应尽量减少与空气接触。,5.厌培养标本的采集和运送,1.痰标本的厌氧培养标本采集：必须用气管穿刺法获得痰液，从口腔吐出的痰标本不能用于厌氧培养。2.尿标本的厌氧培养标本采集：耻骨上膀胱穿刺获得尿标本可用于厌氧菌培养 3便标本厌氧培养标本采集： 可用排出的便做厌氧培养但也应少与空气接触。,6.血液及骨髓标本的采集和运送,1.采血时间：尽可能在用抗生素前，心内膜炎例外。2. 采血量：至少应采一套2瓶，分需氧和厌氧。血量按培养瓶要求，先将1注入需氧瓶，再将剩余血
8、注入厌氧瓶。3. 采血方法：不要与血气和血沉标本一起采血；不推荐血入瓶前换针头；不推荐静脉血直接入瓶；不宜在静脉导管或静脉留置口采血。,血液及骨髓标本的采集和运送,4.采血间隔：如第一次采集2套（4瓶）血培养标本，在以后的2-5天不必采血，但除外心内膜炎和导管相关性败血症。5. 儿童：采血量是总血量的1%。6.延迟培养瓶处理: 延迟培养瓶不要放冰箱或孵箱，放常温，尽早送往临床细菌室。7.皮肤消毒液推荐：建议先用70-80%异丙醇去脂，再用葡萄糖酸氯乙定消毒。,二.标本培养前的基本规范,1.痰培养标本实验室在接种前必须作痰涂片革兰染色，当在低倍镜下白细胞25个/LP时应作为不宜做培养的标本；当白
9、细胞 10个/LP，上皮细胞20个/油镜或该菌占所见到细菌的50%,可推测是标本中的优势细菌.,有了合格的标本是保证培养成功的重要条件，但如果没有适宜的分离培养基和培养环境同样不能获得好的结果，为此制定如下基本条例以保证致病细菌分离成功。,三.分离培养基本规范,1.痰培养,1培养基：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、中国兰琼脂或伊红美兰、或加MRSA显色琼脂。2培养环境：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、置5-7%CO2、35环境培养，其他培养基置35空气培养。3结核培养：罗氏鸡蛋斜面，每一标本种2支，37空气培养。,2.尿标本,1培养基：5%羊血琼脂、中国兰或伊红美兰，或CP3尿致病菌分离显
10、色琼脂。2.菌落计数：每个标本都要做，用加样器或定量接种环取样本10ul分别接种于上述培养基均匀涂布整个平皿，此日作菌落计数。3培养环境：35空气环境培养,3.便培养,1培养基：中国兰或伊红美兰，沙门氏志贺氏琼脂（SS琼脂）或加沙门菌分离琼脂。2培养环境：35空气环境培养。3疑似伪膜性肠炎：5%羊血琼脂、沙保弱琼脂斜面、梭状芽孢杆菌分离琼脂（CCFA）。5%羊血琼脂、沙保弱琼脂斜面置35空气环境培养。CCFA置35厌氧环境培养。其他特殊肠道致病菌培养按国家CDC要求执行。,4.脑脊液培养,1培养基：5%兔血巧克力琼脂、5%羊血琼脂。 2培养环境：35，5-10%CO2环境培养。,5.分泌物培养
11、,1培养基：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、 中国兰或伊红美兰、葡萄糖肉汤2培养环境：35空气环境培养。,6.胆汁或胸水或腹水,1培养基：如标本量大时可按血液培养方法直接取16-20ml分别种入需氧和厌氧培养瓶。如标本量有限，可接种5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、中国兰或伊红美兰、葡萄糖肉汤。2培养环境：35空气环境培养。,四.细菌鉴定规范操作,1. 涂片染色一涂片染色：应具备最基本的两种染色技术，即革兰氏染色和抗酸染色。1 革兰染色：革兰染色报告必须包括染色反应或微生物种类和类别，描述物种的形态或结构。如革兰染色见到革兰阳性球菌，呈葡萄状排列；又如革兰染色见到真菌小分生孢子及菌丝。,涂片
12、染色,2.抗酸染色：抗酸染色报告应显示找到或未找到或可疑抗酸杆菌三种结果，报告中应以加号体现标本中抗酸杆菌的存在量。如找到抗酸杆菌+；见到染色不典型抗酸杆菌+，建议再送标本。不能报告找到结核杆菌但可报告未找到结核杆菌,2. 趋向性鉴定试验,革兰阳性球菌:触酶试验:3%H2O2用30%的H2O2稀释10倍后使用，避光4度保存 ；试验时设立阳性和阴性对照；1分钟内产生大量气泡为阳性。凝固酶试验：采用商品试剂或EDTA抗凝的多个兔混合血浆；测定玻片法测定凝聚因子10秒钟即可观察结果；测定凝固酶需在37度3-4h，若阴性还应放置24h再观察结果。,革兰阴性杆菌:氧化酶试验,建议用纸片法保存比较方便；试
13、剂配制：1%盐酸四甲基对苯二胺水溶液阳性：由粉红变为蓝紫色为阳性对照：铜绿假单孢菌 ATCC 27853 + 大肠埃希菌 ATCC25922 -,3.血清学试验,肠道致病菌生化特征符合的前提下必须有血清学的试验作最后确认，基层细菌室应具备1-3项血清试剂。 1.志贺氏菌多价和单价凝集血清：2.沙门氏菌多价和单价凝集血清3.致病性大肠杆菌多价和单价凝结血清,4.真菌鉴定,1每一基层实验室必须开展真菌涂片，报告临床是否找到真菌；是否见到真菌菌丝；从形态辨别常见丝状真菌;区别曲菌或毛霉菌。2开展酵母样真菌分离培养，应具备最基本的沙保弱培养基或用显色培养基，鉴别白念和非白念，隐球菌等。3.有条件的实验
14、室应开展非培养的鉴定方法，如-D葡聚糖的检测。,五.药敏试验的规范操作,1. 用CLSI指南推荐的KB药敏标准进行常规药敏试验判断。2.根据CLSI更新及时替换应用的标准。3.根据CLSI推荐的方法，开展重要耐药菌的检测，如MRSA、VRE、HLARE、ESBL。,纸片扩散法,AST,操作步骤 制备接种物（0.5麦氏单位） 接种（15分钟内接种，涂抹均匀） 在接种好的琼脂平板上贴加纸片 孵育（15分钟内反转平板，35C空气孵育） 苛养菌5CO2孵育 判断结果和解释结果,AST纸片扩散法,判读结果 将游标卡尺置于反转的平板的背面，测量到最接近的整数毫米数。平板应距离一个黑色不反光的背景，并用反射
15、光照明。 如果是加血的琼脂培养基，则应在透射光照射下，打开培养皿盖，从上表面测量抑菌圈。 如果被测菌是葡萄球菌或肠球菌，则应孵育24小时，再在透射光下分别观察苯唑西林或万古霉素的透明抑菌圈内有无耐甲氧西林或耐万古霉素菌落的微弱生长。,ESBL初步筛选实验,奇异变形杆菌 ESBL 监测试验,*P. mirabilis 不同于其他菌 (比如 17 mm and 4 g/ml for E. coli and Klebsiella spp.); NA, 不适用,CLSI M100-S16; Table 2A (M2, M7),43,NEW,ESBL确认试验,ESBL的质控频率,筛选试验和表型确证试验均
16、可每日进行或每周进行，所选择菌株为肺克700603或大肠埃希菌25922。 应该注意的是：肺克700603ESBL基因在质粒上，应将其冻存于-60或以下。,可诱导的克林霉素耐药 (erm-介导)常规D试验: 阳性 15 g 红霉素纸片及 2 g克林霉素之间距离为15-26.,“D Test” 阳性反应,2006强调,mecA介导的葡萄球菌耐药的表型试验,纸片扩散法 用头孢西丁 (CX DD 30 g) 纸片金葡菌 其结果等于苯唑西林纸片(OX DD)结果。CoNS 结果优于苯唑西林纸片的结果。结果清晰，读起来比苯唑西林容易。报告时仍写苯唑西林，而不写头孢西丁。MIC试验 仍用苯唑西林药。,43
17、,Confirmatory Tests for Suspected Carbapenemase Production in Enterobacteriaceae,2009,需证实药敏试验的结果和确认菌种的鉴定,CLSI 在表格的导言中对ESBL增加了警告 “Warning” 条文,NEW,六.质量控制的规范化,1药物敏感试验的质量控制：应包括30天的初始质量稳定测试；每周一次的常规质量控制；5天的纠控程序。2鉴定试剂质量控制：购入新的试剂；在更换批号；更换生产厂家；结果发生异常等情况时均应进行质量控制。3染色液质量控制：每天临床标本染色前应包括染色结果阳性和阴性的对照物及染色液污染的质量检查。
18、,质量控制内容,4分离培养基：如血琼脂和巧克力，用肺炎链球菌、B-溶血和草绿色溶血的链球菌、流感嗜血杆菌、等苛养细菌的标准菌株或经标准化试剂已证实结果正确的菌株进行测试，判断其分离能力。5.培养箱温度的质量控制：每天第一个开箱和最后离开实验室均应对培养箱的温度作记录；CO2培养箱还应记录CO2的含量。,质量控制内容,6冰箱温度记录：按每一冰箱存放的物品不同设置不同的质控范围，特别对低温冰箱；每天记录一次。7自动化设备：按厂家提供的SOP文件进行质控；在设备软件升级或修改版本时均应进行质量控制程序。8.每一有权向临床发报告的实验室都应参加全国或省或市级质量控制活动。,细菌实验室应对不同的细菌检验
19、报告时间和内容应有相应的规定，并告诉临床各科，依此可防止不明原因的报告延迟应分两种报告形式：1.危重感染报告:2.常规报告:,七.临床细菌室报告制度的规范,1.涂片报告,1.革兰染色： 危急报告30分钟报告。 报告内容应包括染色反应、是细菌或真菌、细菌形态。有无细胞内吞嗜现象，有无菌丝。2.抗酸染色：报告抗酸染色阳性或阴性；菌量以加号表示。 常规报告24h,危重报告1h2。,2.血液和无菌体液培养的报告制度,实行三级报告制度：第一级：培养液直接涂片结果；第二级：初步药敏结果和平皿菌落涂片结果；第三级：正式细菌鉴定和药敏报告。,3.便培养,24小时可发出初始报告;72小时应报告药敏试验结果；根据
20、检测范围报告检测结果，如未检测出沙门菌、志贺菌。 错误报告: 未见到致病菌,4.尿培养,可在24小时报告初始结果，包括菌落计数和可能细菌种类，如氧化酶阴性的革兰阴性杆菌；金黄色葡萄球菌等。,5.痰培养,24小时初始报告，报告内容包括痰标本是否合格，优势细菌，金葡菌、铜绿假单孢菌等特征明显细菌的鉴定结果。,6.分泌物报告,24h初始报告：有无细菌生长；革兰阳性或阴性细菌或特征明显的细菌名称；根据涂片结果推测致病菌。,加强与临床的沟通交流,参与会诊查房 及时与临床交流 巡视危重病人 关注病情变化 预防医院感染流行发生 定期汇总病原菌分离率与抗生素耐药率 编写微生物标本采集与微生物检验手册,实验室空间与生物安全,ISO 15190医学实验室-安全要求和WHO生物安全手册国务院病原微生物实验室生物安全管理条例国务院医疗废弃物管理条例、卫生部医疗卫生机构医疗废物管理办法、实验室生物安全通用要求（GB19489)生物安全实验室建筑技术规范（建设部）、可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运 输管理规定和人间传染的高致病性病原微生物实验室 和实验活动生物安全审批管理办法 进行生物安全手册与微生物风险评估,质量保证和质量控制的关系,标本,检测,结果,正确：采集时间采集标本采集方法,临床,实验室,SOP质量控制,质量保证,质 量 保 证,与医生沟通对话,分析前,分析中,分析后,谢谢,
