1、冰冻切片制作与染色过程中常见的问题,夏春梅,1,问题思考,组织是否足够新鲜？1w以内？灌注固定液、洗液PH值、离子浓度是否合适？一抗是选择途径，滴度如何确定的？是否阅读过DATASHEET? 保存，有效期，reactivity, Cross-Reactivity ？对该蛋白表达和分布有无预期的估计和了解?是否设了阳性和阴性对照？是否排除了自发荧光？是不是判读正确？,2,一、冰冻切片的优缺点,优点：简便，快速，用时短可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋组织变化不大能很好保存脂肪，类脂能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。,缺点：不
2、容易做连续切片组织不能过大-不容易冻结或者组织冻结不均不容易制作较薄的切片冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位组织结构不如石蜡切片清晰，但是满足科研的要求,针对其缺点要注意操作条件优化，避免错误,3,二、切片制作过程中几个关键步骤,1. 动物取材2. 组织固定3. 切片制作4. 切片染色好的切片制作和染色成功的关键细节决定成败固定、漂洗溶液PH值，成分；切片厚度、手感；抗体效价、特异性；切片孵育时间，湿度、温度；切片判读正确-反映真实的科学现象知识结构背景组织学结构的熟悉认识病理改变：炎细胞侵润、坏死、水肿、蛋白变性、纤维化、增生、凋亡审美观、拍照角度、视野、曝光时间
3、、对比度,4,常规HE染色特殊染色如：Masson(Thichrome staining)，油红O，尼氏染色，台盼蓝（肥大细胞）染色免疫染色(immunol staining)免疫荧光(immunol fluorescence)免疫组化(immunol histochemistry),依据科学研究的需要选择方法,5,1. 动物取材：一定要注意“平行性”,1 Control,6 Control,2 Control,3 Control,4 Control,5 Control,1 sham,6 sham,2 sham,3 sham,4 sham,5 sham,1 I/R,6 I/R,2 I/R,3
4、I/R,4 I/R,5 I/R,1 I/R+treatment,2 I/R+treatment,3 I/R+treatment,4 I/R+treatment,5 I/R+treatment,6 I/R+treatment,预实验时早发现趋势而不被误导，减少无效率的工作量减少不同组间baseline的影响，便于不同批次实验组间比较（背景，抗体效价，环境条件对染色影响）发表、修改文章图的一致性,横向,纵向,横向“block”,6,举例：不同实验时间和条件下同种一染色方法结果差异,A B C,Masson staining,7,2. 标本固定应充分,固定的标准切片冰晶少，细胞挤压变形小，切片完整，
5、染色清晰一般较多采用组织固定后再行切片浸入法和灌注法浸入法：活检、手术标本，不能进行灌注的组织固定灌注法：动物实验研究固定剂种类：醛类、非醛类、丙酮及醇类中性缓冲液配制多种聚甲醛较为常用组织固定时固定液要有足够的量(固定液是组织体积的8-10倍)保持一定时间，快速灌注固定后，相同的固定剂再固定2-4h（ 4冰箱）,8,减少冰晶的形成,公认：未经固定的组织切片冰晶较多固定后的组织切片仍然会有一定的冰晶，为防止冰晶的形成采取如下方法速冻法：将组织置入低温环境，使组织骤然降温利用高渗溶液吸收组织水分子：将组织置于20% 30%的蔗糖溶液中，置4摄氏度冰箱足够时间（多长时间? 判定？）,9,3. 切片
6、：组织新鲜非陈旧标本是成败首要因素,低温恒冷箱冰冻切片法组织快速冷冻到一定的硬度(机器要预冷)选择不同的冷冻度 根据不同的组织而定未经固定的脑组织、肝组织：-10- -15左右甲状腺、脾、肾、肌肉等组织：-1520含脂肪组织，-25左右含大量的脂肪 -30,10,保持切片的完整性,切片破碎不全、有缺损的常见原因固定不完全 温度设置不当组织块过冷、过硬，则切片就容易破碎组织块冷冻不够，硬度和韧度达不到，切片也同样易粘、易碎组织块带有皮肤、包膜、过大或冰晶过多切片刀钝或较脏，切片出现刮痕，使切片不完整操作手法不当，如速度不适宜,11,防止切片卷缩,常见原因切片刀钝或粘有组织碎屑防卷板位置不正确或防
7、卷板较脏静电或者气流作用防卷板温度高、室温高采取对策：保持防卷板干净、平整、无缺损、无刮伤戴口罩，以避免呼出的气流直接吹到防卷板切片时间过长时，应注意间隔一会儿，盖上冷冻室盖，降低防卷板温度,12,贴片中常见问题及处理,载玻片粘不上切片准备的载玻片温度过低将载玻片置于常温即可 贴片时切片易碎排除固定不充分等因素外贴片时应注意动作轻、稳、准根据切片大小，选用笔尖软硬适中、大小合适的毛笔,根本的解决方法：多观察，多练习，熟能生巧,13,贴片方式及标记,载玻片上标记（铅笔）组织类型时间组别检测抗原类型同一载玻片上包括各个所有组染色齐性,L1 DRG,Con. TNBSLY ZD72882014.4.
8、20TRPV1+CGRP,TNBS,Con.,ZD7288,LY,L1 DRG,Con. TNBSLY ZD72882014.4.20TRPV1+CGRP,TNBS,Con.,ZD7288,LY,L1 DRG,Con. TNBSLY ZD72882014.4.20TRPV1+CGRP,TNBS,Con.,ZD7288,LY,L1 DRG,Con. TNBSLY ZD72882014.4.20TRPV1+CGRP,TNBS,Con.,ZD7288,LY,1,2,3,4,14,4. 染色：抗体孵育和选择: 免疫组化最关键环节,试剂公司提供标准化的试剂附详细的试剂说明书（datasheet，特别强调
9、！）包括抗体的来源免疫球蛋白的亚类单抗或多抗交叉反应使用稀释度使用流程和注意事项洗涤时缓冲液的适宜离子强度和PH值等,15,抗体分装和保存,购入的抗体分装在多个安瓿中根据月需要量，大致每安瓿含520微升立即放置低温冰箱内贮存（-20以下）长期保存在4冰箱内会失效避免反复冻融抗体效价急剧下降而失效,16,工作抗体的确定,确定对于所要研究抗原的最敏感抗体已出版的文献作为参考资料(IHC和WB抗体要注意区别)阳性切片进行预试验检测抗体的最佳工作浓度了解哪些组织表达这些抗原有助于确定阳性染色，特别是当细胞表达水平低时尤为重要,17,三、 免疫组化结果分析,免疫组化结果的判断原则：,1.必须设对照2.抗
10、原表达必须在特定部位3.阴性结果不能视为抗原不表达,18,1.实验分析的相关介绍,阳性对照：用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色。对照切片呈阳性结果，标为阳性对照。,19,用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照阴性对照还应包括空白对照：用PBS替代第一抗体替代对照：用与第一抗体来源的同一动物前血清，来替代第一抗体吸收实验：用过量的已知相应的纯化抗原与第一抗体反应，抗体结合点全部与抗原结合，这种被抗原吸收的抗体不能再与组织内的抗原反应抑制实验：待检标本先与未标记的特异性抗体反应后再与标记的特异性抗体染色,阴性对照：,20,2. 免疫组化染色实验组与对照组结果分
11、析表,21,只有6，7实验结果有意义15均因对照组的结果已否定Ab的特异性或因IHC技术操作存在错误等而使实验结果失去意义必须重复实验或换用 Ab,22,阳性染色特点定位：胞浆、胞核、胞膜、间质有结构性染色强度不同：颜色深浅不一非特异性染色 细胞与组织无区别弥散性均匀,3. 综合评价特异性阳性染色：,23,优秀免疫组化切片: 信噪比高,A B C,假阳性示范图,*弥漫棕色或单一黄色的细胞染色可能是非特异性的,25,4. 染色失败的几种表现：,(1)所染的全部切片均为阴性结 果，包括阳性对照在内。,染色失败,(2)所有切片均呈阳性反应,(3)所有切片背景过深,(4)阳性对照染色良好，检测的 阳性
12、标本呈阴性反应,26,27,切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。,缓冲液PH值不准确，洗涤不彻底。,使用已变色的显色底物溶液，或显色反应时间过长。,抗体温育的时间过长。,H2O2 浓度过高，显色速度过快且粘 附剂太厚。,（2）所有切片呈阳性反应，其原因：,28,29,（4）阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。,最常见的原因是：,标本的固定和处理不当,30,最后一个细节：PBS洗液的PH和离子强度,建议PH在7.4-7.6，浓度是0.01M,中性及弱硷性条件（PH=7-8）有利于免疫复合物的形成酸性条件则有利于分解低离子强度有利于免疫复合物的形成高离子强度则有利于分解,31,谢 谢！,32,
