1、现代组织化学技术(Modern Histochemical Technology),现代组织化学是介于细胞生物学、组织学、生物化学及分子生物学之间的交叉学科，它已渗透和应用于生命科学的许多领域。近几十年来，组织化学发展突飞猛进，日新月异，已产生了许多分支，各类分支虽有特点，但都源于组织化学。因此，组织化学已成为医学生物学科研过程中必备知识之一。,免疫组织化学免疫电镜组织化学原位杂交技术原位PCR技术,组织化学的发展,组织化学是在组织学和化学的基础上发展起来的，早在十九世纪，人们把显微镜与化学技术结合起来，开始观察组织中的化学反应，解释生物界中的生理现象。,(1890一1920)随着显微镜的改进
2、和组织细胞学染色技术的发展，组织细胞化学开始从生理组织学的概念转为显微化学。依赖细胞内的某些酶催化特异底物的化学反应形成酶细胞化学。70年代由于细胞显微分光光度法和荧光显微光度法的建立，使细胞化学的成分得以定量，形成了定量细胞化学。,80年代电镜细胞化学可以观察化学成分的亚细胞定位。80 90年代，先后流式细胞术、激光扫描共聚焦显微技术出现。本世纪初，激光捕获显微切割技术（Laser capture microdissection，LCM）。,激光扫描共聚焦显微技术（laser scanning confocal microscope，LSCM），相似于对单个细胞进行细胞“CT”分析，并能研究
3、活细胞和定量分析细胞内的遗传物质DNA、RNA、细胞器的酶含量，细胞内各种荧光标记物(包括分子和离子的浓度及其分布，如Ca2+和pH值等)。,流式细胞术（flow cytometry，FCM）是一种快速对单细胞化学成分定量分析的新技术，每秒可测上万细胞信息，从一个细胞中，可同时测量多种参数，并可以快速分选细胞。,激光共聚焦显微镜,线粒体,Hela 细胞,激光捕获显微切割技术（Laser capture microdissection，LCM）是近年发展起来的一种新技术。该技术可以在显微镜下快速地从由多细胞组成的组织中捕获感兴趣的单一同类细胞群甚至单个细胞。这一技术迅速地被运用到疾病发生的细胞和
4、分子机制的研究之中。这将有利于提高疾病的诊断、治疗及预后判断的水平。,1、经典组织化学2、免疫组织化学3、免疫电镜组织化学4、原位杂交组织化学5、原位PCR技术,现代组织化学的内容,组 织 化 学（Histochemistry）,一、组织化学的基本概念,（一）组织化学的定义 应用化学或物理反应原理，通过显示组织或细胞内的化学成分或酶活性，对其进行定性、定位和定量研究。 尽量保持组织的原有结构和化学组成 组织原位 借助显微镜 （二）组织化学与组织学、生物化学的区别,组织化学：研究组织细胞内的化学组成及其含量、酶的存在及其活性组织学： 研究组织细胞的形态结构及其与功能的关系生物化学：通常将组织和细
5、胞破坏，制成匀浆进行化学测定（不考虑定位）,（三）组织化学的基本原理,化学试剂,+,拟检物质,反应产物沉淀（有色）,化学反应,（组织切片或细胞涂片、爬片）,（拟检物质所在处）,（四）组织化学技术的基本要求,保持组织和细胞的良好形态结构，保持组织和细胞生前的化学成分和酶的活性反应产物不被溶解、不易位、不弥散，保证反应产物的精确定位反应产物具有可视性，反应产物的颜色深度与相应物质含量或酶的活性具有一定的量效关系所用组织化学方法必须具备一定的特异性（仅与某种化学成分发生反应）和灵敏性（能够显示微量的物质）方法稳定并能重复设置必要的对照实验,1、固定的目的： 1）保持组织细胞原有的形态结构 2）使组织
6、硬化2、固定的优、缺点： 优点：使组织细胞的形态结构得到保持 缺点：拟检物质反应性减弱，酶的活性易受损,取材：位置准确、速度快、减少挤压、大小适中（宁可面积大、不能厚）,二、组织化学标本的制备,(一) 取材与固定,固定液的种类很多。可分为单纯固定液和混合固定液两大类。单纯固定液：是用一种化学试剂作为固定液，如甲醛溶液、乙醇、冰醋酸等。它们只是对细胞的某种成分固定得较好，不能将细胞所有的成分都保存下来。如升汞固定蛋白质、冰醋酸固定核蛋白、无水乙醇可固定糖原等，单纯固定液有一定局限性。 混合固定液：是用几种化学试剂，按一定的比例混合配制而成的，由于各种试剂的优缺点互相弥补，因此可产生更好的效果。,
7、3、常用固定剂, 10%中性缓冲福尔马林：甲醛实际浓度为4 甲醛原液10ml, 0.1mol/L磷酸缓冲液(PB, pH7.4) 90ml混匀 4%多聚甲醛（HCHO)n，n=8100：多聚甲醛40g, 0.1mol/L PB 500ml，两者混合加热至60，搅拌并滴加1mol/L NaOH至溶液清澈，补充0.1mol/L PB至总量1000m1 PB和PBS是最常用的缓冲液， 0.01mol/L PBS主要用于漂洗组织标本、稀释抗体和血清等。 0.1mol/L PB常用于配制固定液及蔗糖等。,为减少固定剂与抗原的交联，在使用醛类固定剂时，应缩短固定时间(824h)，降低固定温度(4)。,2）
8、戊二醛：C3H10(CHO)2,24%戊二醛溶液：较好的保存细胞的超微结构，但是保存酶活性效果不佳。,1）甲醛：HCHO,3) Bouins液 苦味酸饱和水溶液 75ml 甲醛 25ml 冰醋酸 5ml 是常用的良好固定液，渗透速度快，收缩小，组织固定均匀，不使组织变硬变脆，保持结构完整，适合于各种胚胎连续切片，对于肝、皮、胰腺特殊染色效果好。固定为1224小时，但固定过久，对碱性染料着色不利。,4）Carnoy氏液 纯酒精 60ml 氯仿 30ml 冰醋酸 10ml 此固定液渗透速度快，2mm以下小块组织固定时间24小时，它是细胞极好的固定液，适合于细胞分裂、RNA、DNA及糖元等固定。固定
9、后直接入纯酒精脱水。,5）乙醇：CH3CH2OH,培养细胞、细胞涂片、冰冻切片的固定4%PFA 、甲醇、乙醇、丙酮,有固定和脱水的双重作用。能较好的保存酶活性和糖原，但会使组织严重收缩和硬化，常与其它固定剂混合使用,甲醇：CH3OH,既可作固定剂，又可作脱水剂。能使蛋白凝固，但不影响蛋白质的反应功能基团而保存酶的活性。缺点是易使组织细胞收缩，保持细胞结构欠佳。4下10分钟。,6）丙酮：(CH3)2CO,1、石蜡切片： 组织取材和固定（甲醛） 脱水（梯度酒精） 透明（二甲苯） 浸蜡（石蜡） 包埋（石蜡） 切片（石蜡切片机） 粘片（载玻片） 烤片（烤箱） 组织化学染色程序,组织结构保存良好，结构清
10、晰，定位准确，方便标本长期保存。,（二）组织切片的制备,石蜡切片：组织取材和固定（甲醛） 脱水（梯度酒精） 透明（二甲苯） 浸蜡（石蜡） 包埋（石蜡） 切片（切片机） 粘片（载玻片） 烤片（烤箱） 组织化学染色程序,石蜡切片：组织取材和固定（甲醛） 脱水（酒精） 透明（二甲苯） 浸蜡（石蜡） 包埋（石蜡） 切片（切片机） 粘片（载玻片） 烤片（烤箱） 组织化学染色程序,以肉眼可见自然光线基本透过样品为宜,松节油代替二甲苯：作用柔和,制片材料不易硬化，避免二甲苯对人体和环境的危害,石蜡切片： 组织取材和固定（甲醛） 脱水（酒精） 透明（二甲苯） 浸蜡（石蜡） 包埋（石蜡） 切片（切片机） 粘片（
11、载玻片） 烤片（烤箱） 组织化学染色程序,脱水、透明要充分，否则不利于浸蜡。但时间过长会造成组织过硬和抗原损失。,较软的组织可选择软蜡（熔点4250）较硬的组织可选择硬蜡（熔点5060）石蜡需要熔化过滤除去杂质,石蜡切片：组织取材和固定（甲醛） 脱水（酒精） 透明（二甲苯） 浸蜡（石蜡） 包埋（石蜡） 切片（切片机） 粘片（载玻片） 烤片（烤箱） 组织化学染色程序,包埋盒,包埋模具,石蜡切片：组织取材和固定（甲醛） 脱水（酒精） 透明（二甲苯） 浸蜡（石蜡） 包埋（石蜡） 切片（切片机） 粘片（载玻片） 烤片（烤箱） 组织化学染色程序,必要时哈气、或冰冻,石蜡切片：组织取材和固定（甲醛） 脱水
12、（酒精） 透明（二甲苯） 浸蜡（石蜡） 包埋（石蜡） 切片（切片机） 粘片（载玻片） 烤片（烤箱） 组织化学染色程序,4045,粘片剂,石蜡切片： 组织取材和固定（甲醛） 脱水（酒精） 透明（二甲苯） 浸蜡（石蜡） 包埋（石蜡） 切片（切片机） 粘片（载玻片） 烤片（烤箱） 组织化学染色程序前的处理 组织化学染色,如37度过夜,组织化学染色程序前的处理: 脱蜡（二甲苯） 纯酒精置换二甲苯 梯度酒精入水 组织化学染色程序 常规脱水、透明、封片,2、 恒冷箱冰冻切片 组织取材和固定或不固 定骤冻（液氮， 198；干冰，78； 冻结金属座，30） 切片（恒冷箱） 粘片（载玻片） 晾片 组织化学染色程
13、序 常规脱水、透明、封片,能够完好地保存细胞膜表面和细胞内多种酶的活性，以及抗原的免疫活性（注意抗体的选择），能够很好地保存脂肪、类脂等成分步骤更简单，快速、省时冰冻过程容易使组织中的水分形成冰晶，破坏组织细胞的形态结构，造成抗原的弥散，从而定位不准确组织过大不容易冻结或组织冻结不均，影响切片及染色效果。不容易制作较薄的切片，不容易做连续切片，不容易长期保存,冰冻切片的优点和缺点,糖类显示法,过碘酸是一种强氧化剂，可将糖分子中的乙二醇基氧化成乙二醛基，后者再与Schiff试剂中的亚硫酸品红（无色）反应，形成不溶性紫红色反应产物,对照：先用唾液淀粉酶滴于切片上， 37 30 60min，再按实验
14、步骤进行。,最常用于显示细胞、组织内的多糖和蛋白多糖的方法是过碘酸-雪夫反应（periodic acid Schiff，PAS反应)。,脂类物质显示法,苏丹黑B 为脂溶性染料，染色后与组织中的脂类物质结合，故组织中含脂类物质处呈黑色。,脂类物质包括脂肪与类脂。标本可用甲醛固定、冷冻切片、用油红O、苏丹黑B等脂溶性染料染色；亦可用锇酸固定兼染色，脂类呈黑色。,油红O是很强的脂溶剂和染脂剂，与甘油三酯结合呈小脂滴状，在脂类中的溶解度比在溶剂中大。当组织切片置人染液时，染料则离开染液而溶于组织内的脂质(如脂滴)中，使组织内的脂滴呈橘红色,Feulgen反应显示DNA,用稀盐酸处理切片，使DNA水解，
15、打开脱氧核酸与嘌呤碱基之间的连接键（糖苷键），形成醛基，再与Schiff试剂作用，形成紫红色反应产物。,常用核酸组织化学,吖啶橙染色显示DNA和RNA,吖啶橙（acridine orange，AO）是一种常用荧光染料，与细胞内的DNA、RNA都有亲和力，但有一定的特异性，即结合后发不同颜色的荧光，DNA呈亮（黄）绿色，而RNA呈橘红色至火红色。此法简便快捷，既可染活细胞又可染固定的细胞。,Hoechst33258 和Hoechst33342显示DNA,Hoechst 33342 和 33258主要的特点是能够穿透完整的细胞膜，所以可以用来染活细胞，许多种类的干细胞（如NSC等）由于可以更有效地
16、将进入细胞的Hoechst染料主动转运到细胞外，所以染色会弱一点，但染固定过的细胞则没有区别。 Hoechst 33342 比 33258更容易透过细胞膜，所以常用来进行活细胞的 DNA含量分析。染活细胞时，不同种类的细胞摄入Hoechst的效率不同，染色的强度也不一样，在做细胞流式的时候会看到不同的信号峰。,LABELING LIVE CELLS : Labeling DNA with Hoechst 33342,亮蓝色荧光,DAPI显示DNA,DAPI是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，可用于活细胞和固定细胞的染色。 DAPI像Hoechst染料一样，粘附在DNA双螺旋的小沟区，是一种能够
17、与DNA强力结合的荧光染料。,与双链DNA结合后可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光,碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）,PI检测试剂盒可用于细胞凋亡检测，也可用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色，染色后可用荧光显微镜检测或流式细胞仪检测。PI是一种DNA结合性染料，其激发和发射波长分别为488nm和630nm，产生红色荧光，但无膜通透性，不能透过活细胞膜，只能染死细胞。,The green is the microtubule network (part of the cell cytoskeleton) stained with an antibody
18、to tubulin. The red is the nucleus stained with propidium iodide.,正常细胞： 不能着色早期凋亡细胞：呈微弱红光晚期凋亡细胞：红光加强坏死细胞： 呈强红色荧光,酶组织化学,酶组织化学基本反应原理 酶特异性底物 + 相关捕获剂 反应产物沉淀（有色） 反应产物沉淀（无色）+置换剂,酶,（孵育液内）,（组织细胞内）,镜下观察,有色沉淀,酶组织化学是显示酶的活性,一、金属-金属盐显示法,酶作用于底物时，其分解产物与底物混合液中某种物质结合，沉着在作用部位。然后结合物被金属置换，通过金属显色来证明酶的存在。或者，酶作用于底物后生成的分解产物
19、，与底物孵育液中的金属离子相结合，直接沉着于酶反应部位，使其显色（钙-钴法、铅法）。,如：磷酸酶分解磷酸底物后，可与铅/钴形成磷酸铅，在硫存在时形成 PbS或CoS的棕黑色沉淀，从而标出酶所在部位。,二、偶联偶氮色素法,用人工合成的酶底物，在酶的作用下产生分解产物，后者与重氮盐结合，引起偶氮偶联反应，而形成不溶性的偶氮色素。 萘基磷酸钠 磷酸氢二钠萘酚 萘酚FAST BLUE 偶氮染料,碱性磷酸酶水,-磷酸萘酚,-萘基氯化重氮盐,不溶性偶氮色素,酶作用,三、色素形成法,四唑盐法 主要用于显示脱氢酶。底物中含有四唑盐或双四唑盐。在脱氢酶的作用下，底物释出氢原子，并与四唑盐或双四唑盐形成红色或蓝色
20、的甲 （cn）或二甲 色素。,C6H5C,NNC6H5,NNC6H5,酶作用,+2H,C6H5C,NNHC6H5,NNC6H5,+ HCl,四唑盐(无色),甲 （红色）,靛酚蓝法：,H3C CH3,N,N,H3C CH3,N,NH2,OH,+,酶作用,+ 2H2O,二甲基对苯二胺,-萘酚,靛酚,O,O2,细胞色素氧化酶过氧化物酶,酶组织化学注意事项1.选择最适温度、pH值及缓冲液2.为保持酶活性，最好使用冰冻切片，固定时间不能过长3.有些物质能提高或抑制酶的活性，故要选择合适的捕捉剂4.进行对照实验：用酶的抑制剂、用去底物的孵育液、用已确定含该酶的组织细胞进行对照,免疫组织化学（Immunoh
21、istochemistry）,第一节 概述,一、免疫组织化学的基本概念,免疫组织化学(Immunohistochemistry) 又称免疫细胞化学，其主要原理是用荧光素、酶、胶体金等标记的抗体检测细胞或组织内的相应抗原，经过组织化学的呈色反应之后，用光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察，进行定性、定位或定量分析。通过免疫组织化学手段，凡是能作抗原、半抗原的物质，如蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体及病原体等都可用相应的特异性抗体在组织、细胞内将其检出和对其进行研究。,二、免疫组织化学的免疫学依据,抗原,抗体,抗原 抗体复合物,抗原与抗体之间的结合具有高度特异性,三、免疫组织化学的
22、基本原理,组织抗原,标记物,被标记的抗体,标记抗体与组织抗原特异性结合,利用免疫学中抗原与抗体特异性结合的特点以及组织化学的原理，在组织或细胞标本中加入特定的标记抗体，然后对标记物进行显示，从而对组织或细胞内的抗原物质进行定性、定位或定量研究。,第二节 抗原和抗体,抗原（antigen）,一、抗原的定义： 免疫原性和反应原性,完全抗原 和 半抗原或不完全抗原,半抗原和大分子蛋白质结合以后，就获得了免疫原性,能诱导免疫应答并能与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生反应的物质。,二、抗原的特异性,抗原决定簇或表位,三、抗原的异物性： 抗原的化学结构必须与宿主自身物质的化学结构相异,1、异种物质，异种抗原,
23、2、同种异体物质，异体抗原,3、自身物质，自身抗原,决定抗原特异性的基本结构或化学基团,抗体（antibody）,重链（heavy chain, H chain）轻链 (light chain, L chain)氨基端 (N端)羧基端 (C端)可变区 (variable region, V区)稳定区 (constant region, C区),浆细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白（immunoglobulin, Ig）,IgA, IgD, IgG, IgE, IgM,F(ab)2段Fc段,抗体经酶水解后的产物,Fab即抗原结合片段（fragment antigen
24、 binding），由一条完整的轻链和部分重链（VH和CH1）组成。该片段具有单价抗体活性，能与一个相应的抗原决定族特异性结合。Fc即可结晶片段（fragment crystalline），Fc段含有两条重链C端的一半，包含CH2和CH3两个功能区，它无抗体活性。Ig在异种间免疫所具有的抗原性主要存在于Fc段，同时Fc段还具有活化补体、亲细胞、通过胎盘和介导与细菌蛋白结合等生物学活性。,用木瓜蛋白酶水解IgG分子，可将其裂解为2个完全相同的Fab和1个Fc片段。,抗体(antibody)多克隆抗体(polyclonal antibody) 纯化的抗原直接免疫动物（大多数为兔）多个B淋巴细胞克隆
25、所产生的抗体混合物。特异性不如单克隆抗体好，有时会造成一定的交叉反应，但灵敏度、稳定性高于后者。能广泛用于石蜡包埋组织切片。单克隆抗体(monoclonal antibody) 单克隆抗体是由一个B淋巴细胞克隆分泌的针对一种抗原决定簇的抗体。大多数为小鼠Ig。其优点为特异性强、抗体产量高。但灵敏度逊于多抗。在免疫组织化学中广泛用于冰冻切片和石蜡切片。,多克隆抗体（polyclonal antibody, PcAb）大多数天然抗原物质往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可刺激机体产生一种特异性抗体。多克隆抗体是多个抗原决定簇刺激机体后，由多个免疫淋巴细胞分泌的多种抗体的混合物。 PcAb
26、 特异性相对较差，易出现交叉反应。,由单一克隆B细胞杂交骨髓瘤细胞产生的，只识别一种抗原表位的具有高度特异性的抗体。,制备单一表位特异性抗体的理想方法是获得针对单一表位的浆细胞克隆，使其在体外扩增并分泌抗体。但浆细胞在体外的寿命较短，也难以培养。于是，将可产生特异性抗体但短寿的浆细胞与无抗原特异性但长寿的恶性浆细胞瘤细胞融合，建立了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞和单克隆抗体技术。,单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb）,优点：结构均一、纯度高、特异性强、效价高、易大量制备。,基因工程抗体（genetic engineering antibody）,第三代抗体，利用基因工
27、程技术制备而来。是指应用DNA重组及蛋白工程技术对编码抗体的基因按不同的需要进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体。包括人源化抗体、小分子抗体、双价特异性抗体和抗体融合蛋白等的制备。,第三节 免疫组织化学技术的原理,最原始的免疫组织化学技术可概括为:,直接法,间接法,简便、快速、特异性强、非特异性背景反应低敏感性低，难以检测抗原量少的样品,1. 因第二抗体的放大作用，敏感性大大增高 2. 一个标记二抗能与多种产生于同一种属动物的一抗结合，其成本更低。,免疫组织化学技术包括： 一、免疫荧光技术 二、免疫酶技术 三、亲合素-生物素技术 四、免疫胶体金技术,常用免疫组织化学染色步骤：
28、A、一步法 B、二步法 C、三步法 D、多步法,一、免疫荧光技术,将荧光作为标记物的免疫组织化学技术,当某种常温物质经某种波长的入射光(激发光，通常是紫外线或X射线)照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的波长长的出射光(发射光，通常波长在可见光波段)；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。,FITC,TRITC,（一）直接法1、抗原直接定位法,组织中的抗原,2、抗体直接定位法,荧光标记的抗原,组织中的抗体,（二）间接法1、抗原间接定位法,荧光标记的第二抗体 （二抗）,组织中的抗原,第一抗体（一抗）,2、抗体间接定位法,荧光标记抗体,
29、组织中的抗体,抗原,（三）免疫荧光双标记法,1、直接法,2、间接法,免疫荧光双标记法的应用： 1.将两种抗体分别用不同的荧光素加以标记，用来显示含有不同成分的两种细胞在同一区域的定位模式,激光扫描共聚焦显微镜观察,免疫荧光双标记法的应用： 2. 将两种抗体分别用不同的荧光素加以标记，用来定位同一细胞内存在的两种不同成分,激光扫描共聚焦显微镜观察,荧光显微镜,透射式荧光显微镜,落射式荧光显微镜,透射式荧光显微镜,透射式：低倍镜时荧光强，随放大倍数增加其荧光减弱落射式：视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强,用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光,在照明系统的光源中使用高压汞灯提供全波段激发光,
30、阻断滤片吸收和阻挡残余激发光进入目镜，选择并让特异的荧光透过,双色束分离器使激发光和荧光分开,每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片(如蓝色、绿色激发滤片)，仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉,为延长汞灯寿命，打开后不可立即关闭(至少15min)，以免水银蒸发不完全而损坏电极；汞灯关闭后则不可马上打开(至少30min)，否则灯内汞蒸汽尚未恢复液态，内阻极小，再次施加电压会引起短路，导致汞灯爆炸。,荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源 、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。,激光共聚焦显微镜,采用点扫描技术
31、,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像，清晰度和精密度大大提高。而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。图像数字化,在电脑中进行处理,提高图像的清晰度和分析的便利度。利用光电倍增管将很微弱的信号放大,使灵敏度大大提高 光学成像的分辨率提高30%-40%用于观察细胞形态、细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量等。,激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。,采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差,用于激发
32、荧光的激光束透过入射小孔被二向色镜反射，通过显微物镜汇聚后入射于待观察的标本内部焦点处。激光照射所产生的荧光和少量反射激光一起，被物镜重新收集后送往二向色镜。其中携带图像信息的荧光由于波长比较长，直接通过二向色镜并透过出射小孔到达光电探测器(通常是光电倍增管PMT)，变成电信号后送入计算机。而由于二向色镜的分光作用，残余的激光则被二向色镜反射，不会被探测到。,二、免疫酶技术,常用作标记物的酶有： 辣根过氧化物酶(HRP) 碱性磷酸酶 (AP),抗原抗体免疫结合反应 + 酶组织化学反应,H2O2和DAB (diaminobenzidine, 二氨基联苯胺)为其常用底物，产物为稳定的棕黄色沉淀,辣
33、根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）,BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate，5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐) 和 NBT（Nitro-Blue-Tetrazolium，四唑氮蓝）是AP的常用底物组合。,BCIP被AP水解成一种蓝色的中间物，后者然后被NBT氧化形成二聚体（不溶性紫蓝色沉淀）。,Phosphatase hydrolysis of BCIP is coupled to reduction of NBT, yielding a formazan and an indigo dye that toget
34、her form a black-purplecolored precipitate.,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, AP）,（一）抗原间接定位法,组织中的抗原,一抗,酶标二抗,PAP法主要染色原理 ： 先将过氧化物酶和抗过氧化物酶抗体制成复合物； 用第二抗体作“桥梁”，既与第一抗体结合，再与PAP复合物联接，最后用底物显色剂显色。,非酶标法：PAP法,过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物 (peroxidase anti-peroxidase complex）,三、亲和免疫组化,1、葡萄球菌蛋白A（SPA法）：用SPA代替桥抗体2、亲合素生物素技术,亲合素（avidin）
35、也称卵白素，一种糖蛋白,生物素（biotin）即维生素H,过氧化物酶(HRP),生物素与亲合素有很高的亲和力 一个亲合素分子上有四个生物素结合位点,亲合素生物素过氧化物酶复合物法(ABC法）,组织抗原,生物素化二抗,ABC,一抗,亲合素作为“桥”将生物素化的抗体与生物素结合的酶连接起来，使抗原与抗体反应信号放大，以增强敏感性,亲和素生物素过氧化物酶复合物法 (Avidin Biotin-peroxidase Complex, ABC) ABC法是利用亲和素与生物素特有的高度亲和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化HRP，然后与卵白素按一定比例混合，形成ABC
36、复合物。然后通过生物素化二抗与特异性抗体（第一抗体）结合，再与ABC复合物联结形成抗原-抗体-生物素化二抗-ABC。最后用底物显色剂显色。,链霉亲合素生物素过氧化物酶复物法 (StreptAvidin Biotin-peroxidase Complex，SABC),此法为上述ABC法的改良，是用链霉亲合素（streptavidin ）代替ABC法中的亲合素（avidin ）,Streptavidin链霉亲合素,avidin亲合素,链霉亲合素为蛋白质，非糖蛋白，不与其它分子结合，可降低背景。,亲合素是糖蛋白，含有约7%的糖类，可与组织中含糖基的物质起反应，造成背景着色。,1用链霉亲和素连结辣根过
37、氧化物酶，则为： 法：(StreptAvidin Peroxidase conjugataed method) 若用碱性磷酸酶标记链霉亲和素则称法。 若分别用碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，则称法2将链霉亲和素和生物素先连结起来，则称： 法：labelled StreptAvidin-Biotin特点: 敏感性高，（比PAP高倍）； 背景淡，链霉亲和素更好； 方法较简便，时间较短； 应用范围广，也可用于原位杂交和免疫电镜。,链霉亲合素-过氧化物酶（streptavidin peroxidase，S-P）技术,Streptavidin链霉亲合素,酶标链霉亲合素,标记亲合素生物素法（LA
38、B法）,过氧化物酶标记的亲合素,生物素标记（化）的抗体(二抗),组织抗原,一抗,第四节 免疫胶体金技术,胶体金的制备： 氯金酸（HAuCl4或 AuCl3 HCl ) 还原剂 胶体金,金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液,较小的胶体金颗粒基本是圆球形的，较大的胶体金颗粒(一般指30nm以上的)多呈椭圆形。,胶体金双标记法,一抗甲,金标二抗甲,抗原乙,抗原甲,一抗甲,金标二抗乙,第四节 光镜免疫组织化学染色程序,以ABC法为例,组织抗原,生物素化二抗,ABC,一抗,一抗：常用的多克隆，单克隆抗体,染色程序: 组织采用石蜡切片或恒冷箱切片,片厚510 m或者10 30 m 。 若石蜡切片则脱蜡到水冰
39、冻切片：漂片or 贴片 1、 PBS漂洗, 10 min；,染色程序: 2、 3%BSA, 30 min； 3、 0.2%Triton X-100, 3%H2O2处理，30 min; 4、 兔抗血清孵育过夜； 4、 PBS漂洗, 35 min； 5、生物素化羊抗兔IgG 孵育, 60 min； 6、PBS漂洗，35 min；,载玻片,标签,组织切片,生物素化二抗,生物素,Triton X-100为去污剂，其脂溶性可使细胞膜穿孔，增加细胞膜对抗体的渗透性。 3%H2O2灭活内源性过氧化物酶 非免疫血清封闭（与二抗种属相同的非免疫血清）阻止一抗被组织中富有电荷的胶原和结缔组织成分吸附而导致的非特异
40、性背景着色。,染色程序:7、 ABC复合物孵育, 60 min；8、 PBS漂洗, 35 min；9、 DABH2O2显色液显 色，至深棕色为止， 约510 min； （DABH2O2 临用前配制）,ABC,标签,组织切片,ABC,染色程序:10、先后经自来水冲洗 和双蒸水浸洗；11、常规脱水、透明、 树胶封片。,染色结果：镜下观察。阴性对照试验： 1、常用空白试验：即用稀释一抗的稀释液， 如3% BSA等，或 PBS替代一抗，反应应呈阴性；,2、替代试验：正常兔血清或 正常羊血清代替兔抗血清或羊抗兔IgG，反应应呈阴性；3、吸附试验：一抗血清经相 应抗原预吸附处理后孵育组织切片，反应应呈阴性
41、。,结果判断：同一公司不同批号的同种抗体，不同公司的同种抗体，结果可能不同，这时需要根据文献、个人经验、western blot的结果等综合判断。假阳性和假阴性：防止干片（免疫组化笔Pap pen、湿盒）、阴性对照、阳性对照。,SABC 步骤： (1) 石蜡切片脱蜡至水后； (2) PBS浸洗，5min3次； (3) 3%过氧化氢溶液，10min；（去除内源性过氧化物酶） (4) PBS浸洗，5min3次； (5) 滴加10%正常非免疫动物血清（与二抗同源）10min（封闭）； (6) 倾去血清，不洗！加第一抗体，37，30-60min； (7) PBS浸洗，5min3次； (8) 加生物素化
42、二抗，4560min； (9) PBS浸洗，5min3次； (10) 加ABC复合物，4560min；或 (10)每张切片加1滴或50l链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，10min； (11) PBS浸洗，5min3次； (12) 新鲜配制的DAB-H2O2溶液，310min； (13) 自来水冲洗，复染，中性树胶封固。,显示剂的合理使用目前最常用的显示剂用于辣根过氧化物酶（HRP）系统 DAB： 3.3-diaminobenizidine（3、3-二氨基联苯胺盐酸盐） AEC： 3-amino-9-ethlylcarbazde（ 3-氨基-9-乙基卡吧唑）用于碱性磷酸酶（AP）系统 BCI
43、P（5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸)NBT(硝基四氮唑蓝)AP-Red和Fast-Blue （ 萘酚AS-BI磷酸盐快红或快蓝） AEC溶于酒精，所以封片时不能用中性树胶，以免退色，而只能用甘油明胶或市售的AEC封片剂。,免疫组织化学组织细胞处理切片前的准备工作,(1)载玻片的清洁： 市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片240烤2 h。(2)切片粘合剂的种类 多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。 APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）： 干净载玻片丙酮5min APES（1ml+ 50ml丙酮）：用镊子夹住浸入APES试剂13次纯丙酮洗二次干燥玻片用铝箔包好，室温或4保存备用。,石蜡组织切片中抗原性的修复：A、化学方法： 胰蛋白酶（0.050.1% ，含0.1%CaCl2） 蛋白酶K、胃蛋白酶B、物理方法 微波方法： 单纯加热法：,胰蛋白酶抗原修复法：,切片脱蜡至水。 3%H2O2处理切片10分钟。自来水洗，蒸馏水洗。切片置于0.050.1% 胰酶（含0.1%CaCl2）中作用10分钟，流水冲洗后，PBS洗2次，按免疫组织化学染色方法进行染色。,
