1、Genistein 对 K562 细胞生长及 CyclinD1 基因和 bcrabl 融合基因表达的影响作者：王玮 孙秉中 于文彬 冯琦 【关键词】 染料木黄酮 关键词: 染料木黄酮;CyclinD1 基因;CDK4 蛋白;bcr-abl 融合基因 摘 要:目的 研究 Genistein抑制 K562细胞生长的机制及对CyclinD1基因和 bcr-abl融合基因表达的影响. 方法 用 RT-PCR方法检测 Genistein作用于 K562细胞前后 CyclinD1基因和 bcr-abl融合基因的 mRNA表达变化，用免疫荧光、流式细胞仪和电镜检测 CDK4蛋白的表达、细胞周期及凋亡. 结果
2、 K562细胞中 CyclinD1基因、bcr-abl 融合基因的 mR-NA和 CDK4蛋白表达阳性，用 Genistein与 K562细胞共同孵育后，bcr-abl 融合基因的 mRNA表达阴性，CyclinD1 的 mRNA和 CDK4蛋白表达下降，细胞阻滞于 G2/M期，K562 细胞出现凋亡. 结论 bcr-abl融合基因、CyclinD1 基因和 CDK4蛋白在 K562细胞中高表达，Genistein能使 K562细胞生长受抑，诱导其凋亡，抑制 bcr-abl基因的 mRNA表达，并使 CyclinD1基因的 mRNA和 CDK4蛋白表达下降，表明 bcr-abl融合基因、Cyc
3、linD1 基因和 CDK4对慢粒发展存在内在关系. Keywords:Genistein;CyclinD1gene;CDK4protein;bcr-abl fusion gene Abstract:AIM To investigate the mechanism of how Genis-tein restrains the growth of K562cells，and its effect on the expression of CyclinD1gene and bcr-abl fusion gene.METHODS Genistein was incubated with K562c
4、ells，the mRNA of CyclinD1gene and bcr-abl fusion gene were exam-ined by RT-PCR and the expression of CDK4protein，cell cy-cle and apoptosis were examined by immunofluorescence，flow cytometry and electron-microscope at the same time.RESULTS The expression of CyclinD1gene and bcr-abl fu-sion genemRNA w
5、as positive in K562cells.After K562cells was incubated with Genistein，the expression of bcr-abl fusion genemRNA and CDK4protein were negative，mRNA of CyclinD1gene decreased.And the cell was blocked in G2/M phase.Using electron-microscope we could observe the cells apoptosis.CONCLUSION CyclinD1gene a
6、nd bcr-abl fusion gene are highly expressed in K562cells.The growth of K562cells could be restrained by using Genistein，which induces K562cells apoptosis，repress the expression of bcr-abl fusion gene，and makes CyclinD1and CDK4protein de-crease.This illuminates that CyclinD1gene，CDK4protein and bcr-a
7、bl fusion gene may have relation to the pathogenesis of chronic myelogenous leukemia（CML）. 0 引言 肿瘤的发生、发展与细胞周期调控失调密切相关，细胞周期有关的原癌基因（如 CyclinD1）与细胞增殖相关的癌基因（如 bcr-abl）在肿瘤发展上存在密切关系.已有文献1，2 报道，用 RT-PCR方法检测到K562细胞中 CyclinD1基因和 bcr-abl融合基因的 mRNA高表达，我们进一步用酪氨酸激酶抑制剂 Genistein作用于 K562细胞后，观察 CyclinD1基因、bcr-abl 融
8、合基因的 mRNA和 CDK4蛋白表达的变化，同时观察Genistein对 K562细胞生长、周期变化及凋亡的影响，探讨其抑制 K562细胞生长的机制. 1 材料和方法 1.1 材料 K562细胞株由西京医院血液科于文强博士惠赠.Genistein购于美国 Sigma化学制剂公司，CDK4 单抗购于美国 Santa Cruz化学制剂公司（由博士德公司提供） ，扩增 CyclinD1基因和 bcr-abl融合基因的引物由大连宝生物 Takara公司合成. 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 K562细胞用含 100mLL-1 胎牛血清的RPMI1640培养液置 37，50mLL-1 CO2 孵箱
9、中培养，实验取对数生长期细胞.绘制细胞生长曲线，每隔 24h台盼蓝染色，计算细胞存活率. 1.2.2 RT-PCR检测 CyclinD1基因和 bcr-abl融合基因的 mRNA表达 将对数生长期细胞接种于 6孔培养板中，细胞密度为 3109 L-1 ，加入 40mgL-1 的 Genistein，置 37，50mLL-1 CO2 孵箱中培养 48h后，采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿法抽提总 RNA，反转录成 cDNA后进行 PCR扩增.扩增 Cy-clinD1基因的引物顺序:上游引物5-CTGGCCAT-GAACTACCTGGA-3，下游引物 5-GTCACACT-TGATCACTCTGG-3，
10、扩增 483个 bp1 ;扩增 bcr-abl基因引物序列:上游引物 5-GATGCTGAC-CAACTCGTGTG-3，下游引物 5-ACACCATTCC-CCATTGTGAT-3，扩增 376个 bp3 ，10gL-1 琼脂糖电泳检测扩增产物. 1.2.3 检测细胞周期、凋亡及 CDK4单抗 用流式细胞仪检测，取2106 个细胞，700mLL-1 乙醇（-20预冷）固定 24h，离心，弃去乙醇，细胞重悬浮于 PBS液中离心洗涤 2次，去上清，细胞重悬浮于 DNA染液中（含碘化丙锭） ，室温避光染色 30min，取波长 488nm蓝色激发光检测4 .参照文献5检测 CDK4单抗.电镜观察 K
11、562细胞凋亡形态. 2 结果 2.1 Genistein抑制 K562细胞株生长 Genistein浓度40mgL-1 时即可明显抑制 K562细胞的生长，50.0%细胞生长被抑制时间约 48h，作用 72h内台盼蓝染色未见死细胞，细胞生长曲线如Fig1. 2.2 CyclinD1基因和 bcrabl 融合基因的 mRNA表达降低 K562细胞中 CyclinD1基因和 bcr-abl融合基因的 mRNA表达均为阳性.Genistein作用 48h后，bcr-abl 融合基因的 mRNA表达阴性，CyclinD1基因 mRNA表达降低，电泳检测扩增产物，荧光亮度轻度减弱（Fig2，3）. 2
12、.3 Genistein阻断细胞生长于 G2/M期及诱导 K562细胞凋亡 流式细胞仪检测 K562细胞 S期细胞占 47.7%，提示其 DNA的合成、复制活跃，细胞增殖旺盛（Fig4）;Genistein 与 K562细胞共同作用后， 阻断 K562细胞生长主要在 G2/M期，使 G2/M期细胞数大量增加，S 期细胞明显减少（19.5%） ，并在细胞周期图中的二倍体峰前可见一亚二倍体峰-凋亡峰（apoptosis peak） ，提示其能抑制 K562细胞生长，诱导其凋亡（Fig5）. 图 1 图 3 略 2.4 CDK4蛋白的表达下降 K562细胞中 CDK4蛋白表达阳性（平均荧光强度 2.
13、10） ，Genistein 作用 24h后，CDK4 蛋白的表达水平明显下降（平均荧光强度 0.807，Fig6，7）. 图 4 图 7 略 2.5 电镜观察到 K562细胞凋亡 Genistein作用 24h后，K562 细胞变小，胞质轻度变性肿胀，核浓缩深染，核膜清楚，染色质聚集成团块状，靠近核膜边缘（Fig8）.并可见早期凋亡小体，核碎裂呈团块状散布于胞质，被细胞膜所包绕，其中无各种细胞器. 3 讨论 K562 细胞为慢性粒细胞白血病（慢粒）急变细胞株，含有 Ph染色体，产生 bcr-abl融合基因，编码 p210Bcr-Abl 蛋白，具有异常的高酪氨酸激酶活性，使细胞恶性增殖6 .近
14、来研究发现慢粒发病和凋亡受抑7 以及细胞周期调控失调8 有密切联系，Genis-tein 治疗慢粒的机制主要是阻断信号传导途径，促进细胞凋亡.其是否在基因水平及细胞周期调控角度发挥抗肿瘤作用，值得进一步研究. Carler 等9 研究发现 Genistein能诱导慢粒患者骨髓中Bcr/Abl阳性集落进入凋亡，我们用 Genis-tein作用于 K562细胞后，出现细胞凋亡和 G2/M期阻滞，说明 Genistein除能抑制 p210蛋白的酪氨酸激酶活性外，尚能从促进凋亡和调控细胞周期角度抑制 K562细胞的生长.其诱导 K562细胞凋亡的机制，主要是阻断了与 bcr-abl相关的信号传导途径（
15、如 Ras途径）后，抑制抗凋亡基因 bcl-2的表达，并促使凋亡基因 fas等发挥作用10 .此外，细胞周期的改变，亦是促进细胞凋亡的因素，因 G2/M期细胞明显增加，变异基因 bcr-abl被阻滞于 G2/M期检测点，不能进入 M期进行有丝分裂，使其在退出细胞周期过程中逐渐发生凋亡. 图 8 略 我们发现，Genistein 能抑制 bcr-abl融合基因的 mRNA表达.Carmelo等2 的研究已排除 Genistein通过抑制 bcr-abl的转录起作用的机制，故可能是抑制了 bcr-abl基因的复制.从细胞周期角度分析，Genistein作用 K562细胞后使 S期细胞数量明显减少，
16、导致 DNA的合成、复制减少，变异基因 bcr-abl的合成和复制相应减少，故 bcr-abl融合基因的表达降低.同时发现 Genistein能使 cyclinD1基因的 mR-NA表达下降.Cortez 等11 研究 bcr-abl融合基因的高酪氨酸激酶活性，可使造血细胞在失去生长因子的条件下激活 CDK蛋白.本实验用 Genistein抑制了 K562细胞中的高酪氨酸激酶活性后，流式细胞仪检测证实能抑制CDK4蛋白的表达，而 CyclinD1的表达依赖于 CDK4蛋白的活化，因而CyclinD1基因的表达水平下降.在 K562细胞中同时有 CyclinD1基因和bcr-abl融合基因的高表
17、达，表明 CyclinD1基因和 bcr-abl基因对慢粒发展可能有密切的联系.Cy-clinD1 的过表达使细胞周期中 G1/S期检测点功能低下，变异的 bcr-abl癌基因失去调控而进入 S期复制，不能启动凋亡途径而凋亡，还能使细胞周期及癌基因的复制加速，故 CyclinD1基因对 bcr-abl融合基因的表达起促进作用.但原癌基因 CyclinD1单独作用不能使细胞发生恶性转化12 ，必须通过癌基因 bcr-abl而发挥作用. 参考文献: 1Uchimaru K，Taniguchi T，Yoshikawa M，Asano S，Arnold A，Fujita T，Motokura T.De
18、tection of CyclinD1（bcl-1，PRAD1）over-expression by a simple competitive reverse transcription-polymerase chain reaction assay in t（11，14） （q13，q32）-bearing B-cell malignancies and/or Mantle cell lymphoma J.Blood，1997;89（3）:965-974. 2Carmelo CS，Gianpietro D，Lina M，Ester R，Daniela G，Anto-nio B，Camillo
19、 A，Gabriella S，Barbara S，Maria TR，Vittorio R.Selection of myeloid progenitors lacking BCR-ABL mRNA in chronic myelogenous leukemia patients after in vitro treatment with the tyrosine kinase inhibitor Genistein J.Blood，1996;88（89）:3091-3100. 3Feng Q，Sun BZ，Zhao YT，Sun K，Yan Z，Han W，Zhang YQ.Study on
20、the cleavage ability of three rihozymes specific to the different sites of bcr-abl fusion gene J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，1999;20（4）:284-287. 4Cao RX，Liu ZG，Qu P，Zhang YF.A rapid way of determining activity of cells by flow cytometry J.Di-si Junyi Daxue Xue-bao（J Fourth Mil M
21、ed Univ） ，2000;21（7）:S198. 5Cao YX，Liu ZG，Zhong XN，Dong JY.Indirect staining of pe-ripheral blood samples for flow cytometry J.Di-si Junyi Dax-ue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，2000;21（2）:244-246. 6Feng Q，Sun BZ，Zhao YT，Sun K，Yan Z，Han W，Zhang YQ.Construction and identification of a chronic myeloid
22、leukemia specific bcr-abl3-units ribozyme J.Di-si Junyi Dax-ue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，1998;19（4）:471-472. 7Shang ZC， Sun BZ，Feng Q，Wang CH，Xie XP，Song TT，Zhu HF.The synergistic effects of bcr-abl and c-myc anti-sense oligodeoxynucleotides on chronic myeloid leukemia J.Di-si Junyi Daxue Xueba
23、o（J Fourth Mil Med Univ） ，2000;21（3）:275-277. 8Bedi A，Barber JP，Bedi GC，Deney WS，Sidransky D，Vala MS，Akhtar AJ，Hilton J，Jones RJ.Bcr-Abl mediated inhibi-tion of apoptosis with delay of G2/M transition after DNA dam-age:A mechanism of resistance to multiple anticancer agents J.Blood，1995;86（1）:1148-1
24、158. 9Carler SC，Dotti G，Mangoni L，Regazzi E，Garau D，Bonati A，Almici C，Sammarelli G，Savoldo B，Rizzo MT，Rizzoli V.Selection of myeloid progenitors lacking bcr-abl mRNA in chron-ic myelogenous leukemia patients after in vitro treatment with the tyrosine kinase inhibitor Genistein J.Blood，1996;88（8）:309
25、1-3100. 10Raitano Whang YE，Sawyers CI.Signal transduction by wild-type and leukemogenic abl proteins J.Biochim Biophys Acta，1997;1333（3）:F201-F216. 11Cortez D，Reuther G，Pendergast AM.The bcr-abl tyrosine ki-nase activate mitogeniz signaling pathways and stimulates G1-to-S phase transition in hematopoietic cells J.Oncogene，1997;15（19）:2333-2342. 12Gao P，Wang MQ.CyclinD and cancer change of cell J.Guowai Yixue-Zhongliuxue Fence（Foreign Med Sci-Cancer Section） ，1998;25（2）:72-75.
