1、hTERT 启动子驱动的 TRAIL 联合放化疗对HeLa 裸鼠移植瘤生长抑制的作用作者：张明 辛晓燕 李红梅 宋辉 【Abstract】 AIM: To study the inhibitory effect of hTERT promoter regulated TRALL combined with chemo radiotherapy on the growth of transplantation tumor of HeLa cells in nude mice. METHODS: The TRAIL gene activated by the hTERT promoter was
2、transfected into HeLa cells; The GFP protein expression of TRAIL was examined by immunohistochemical staining;The rats were divided into TRAIL gene transfection group,chemotherapy group,radiotherapy group,combined treatment group(genetransfection + chemoradiotherapy), and control group,with 5 rats i
3、n each group.The TRAIL gene transfected cells and the blank HeLa cells were seeded in mice subcutaneously. The combinded effects of TRAIL with chemoradiotherapy on the nodulation of the cervical cancer HeLa lines were detected. The changes of tumor weight,sizes, and the tumor growth inhibition rate
4、were determined. RESULTS: GFP/TRAIL expression rate was significantly higher in hTERT_TRAIL transfected cells than in control cells(P0.01). Nodulation of HeLa cells was observed on day 57 in all group, with no difference in nodulation generation time(P0.05). The transplanted tumor weight was signifi
5、cantly different between transfected hTERTTRAIL group and control group (P0.05). The transplanted tumors in hTERTTRAIL grew slowly compared to control group.The tumor growth inhibition rate was 43.08% in hTERTTRAIL group and 61.63% in the gene transfection plus radiochemotherapy group at week 4 (P0.
6、01). CONCLUSION: hTERTTRAIL exerts obvious inhibitory effects on the growth of HeLa cells transplanted tumor in nude mice.The gene transfection plus radiochemotherapy may enlighten the future preclinical study and clinical therapy for tumors. 【Keywords】 cervix neoplasms; tumor necrosis factorrelated
7、 apoptosisinducing ligand (TRAIL); telomerase; promoter regions (genetics); cisplatin; neoplasm transplantation; mice, nude; apoptosis 【摘要】 目的： 探讨 hTERT启动子驱动的 TRAIL联合放化疗对宫颈癌 HeLa裸鼠皮下移植瘤生长抑制的作用. 方法： 将含有 hTERT启动子的 TRAIL基因载体转染宫颈癌细胞 HeLa，检测稳定转染细胞中GFP/TRAIL的表达；实验裸鼠分为基因组，化疗组，放疗组，综合组（基因+放化疗） ，对照组，每组 5只，未转染
8、 HeLa组为对照组,不作任何处理；将稳定转染基因载体及未转染的 HeLa细胞种植于裸鼠背部皮下，联合放化疗，来观察移植瘤成瘤情况，移植瘤的体积、质量以及质量抑制率的变化. 结果： 转染 hTERTTRAIL 细胞中 GFP/TRAIL(绿色荧光蛋白)表达率高于对照组，有统计学意义 (P0.01)；各组裸鼠在接种细胞第57日全部长出肿瘤小结节，结节出现的时间差异无统计学意义(P0.05)；转染 hTERT TRAIL 细胞与对照组 HeLa细胞裸鼠的移植瘤质量相比差异有统计学意义(P0.05); hTERT TRAIL 细胞在裸鼠体内所形成的移植瘤生长较慢, 4 wk后肿瘤质量抑制率为 43.
9、08%,联合放化疗后肿瘤质量抑制率为 61.63%，有统计学意义(P0.01). 结论：hTERT启动子驱动的 TRAIL对人宫颈癌裸鼠移植瘤有明显的抑制作用，联合放化疗能抑制裸鼠移植瘤的生长. 基因治疗联合放化疗等多途径综合治疗为以后的肿瘤研究和临床治疗提供思路. 【关键词】 宫颈肿瘤;肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体; 端粒，末端转移酶；启动区（遗传学） ；顺铂；肿瘤移植；小鼠，祼；细胞凋亡 0 引言 HTERT 端粒酶启动子属于肿瘤细胞的特异性启动子1 ，对肿瘤细胞具有靶向作用. 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumor necrosis factorrelated apoptosisin
10、duced ligand, TRAIL)具有选择性杀伤肿瘤细胞的作用，其抗肿瘤的优点已受到研究者的广泛重视2. 本实验旨在探讨端粒酶(hTERT)启动子驱动的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对 HeLa裸鼠宫颈癌移植瘤的抑制作用，以及与化放疗的协同作用. 1 材料和方法 1.1 材料宫颈癌细胞株 HeLa由第四军医大学西京医院妇产科实验室提供，体外培养传代. 质粒 hTERTpromoterpIRES2EGFP 由李红梅博士惠赠. Lipofectamine2000脂质体转染试剂盒、G418 购自 Invitrogen公司. 胎牛血清购自杭州四季青公司，DMEM 购自 Gibco公司. cDDP为
11、齐鲁制药厂产品. BALB/C 裸鼠 56 wk，体质量 1618 g，购自上海金来克实验动物研究所. 第四军医大学口腔医院动物中心恒温恒湿条件下饲养，垫料饮水饲料均经过灭菌处理. 1.2 方法 1.2.1HeLa 细胞培养和 TRAIL基因转染含 100 mL/L胎牛血清的 DMEM于 37，50 mL/L CO2孵箱中培养传代，倒置显微镜下观察细胞生长状况，于对数生长期时收集细胞，以 5105细胞/孔接种于 6孔板，过夜培养. 待细胞长满至 80%85%板面积时，分别以hTERTpromoterpIRES2EGFPTRAIL 载体, HeLa细胞，具体操作按Lipofectamine200
12、0试剂盒说明书进行，同时以未转染的 HeLa细胞为阴性对照. 转染 48 h后，以含 800 g/L G418的选择培养液进行筛选. 1.2.2 转染 hTERTpromoterpIRES2EGFPTRAIL 细胞的免疫荧光表达 G418筛选后的抗性克隆扩大培养，2.5 g/L胰酶消化，制备细胞爬片，以 950 mL/L乙醇固定 20 min，0.01 moL/L PBS振洗 5 min，免疫荧光染色采用间接免疫荧光法检测 GFP/TRAIL的表达. TRAIL mAb（1400）,37孵育 1 h , FITC标记兔抗小鼠 IgG 37 45 min ,各步骤间用 PBS(pH 7.4)充分
13、漂洗,磷酸甘油封片,于 MRC1024 型激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察摄片（激发波长为 488 nm，共聚焦系统由BioRad 公司提供的软件控制） ，转染 3次细胞, 利用软件在镜下随机选取 5个细胞，对其进行定量分析，取平均值. 1.2.3 接种细胞和动物分组 1.2.3.1 分组每组 5只,对照组命名 HeLa1 ，腹腔注射 PBS 0.2 mL；实验组：命名 HeLaT 基因组，腹腔注射 PBS 0.2 mL；命名 HeLaC 为化疗组，腹腔注射 DDP，剂量为 3 mg/kg；命名 HeLaR 放疗组，腹腔注射 PBS 0.2 mL，放疗剂量 2 Gy;命名 HeLaRC 为
14、联合组，放疗剂量 2 Gy ，放疗前 30 min腹腔注射 cDDP 3mg/kg,放疗 2次. 1.2.3.2 接种细胞取对数生长期的转染 hTERTTRAIL 细胞，HeLa 细胞，分别制成 11011/L的细胞悬液 0.2 mL，用 0.2 mL注射器接种于 6周龄 BALB/C裸鼠背部皮下，上下各 1点，每点 0.2 mL细胞悬液，观察肿瘤生长情况. 1.2.3.3 照射条件 X射线采用美国 Varian公司 Clinac 600 直线加速器 6 MV X射线，源皮距（SSD）100 cm，吸收剂量率 250 Gy/min，射野面积 6.5 cm30 cm，照射剂量 2 Gy. 采用局
15、部照射，其他部位屏蔽. 将裸鼠固定使肿瘤暴露于照射野内，肿瘤表面覆盖 1.5 cm厚蜡板以提高建成区. 1.2.3.4 化疗腹腔注射 cDDP，剂量为 3 mg/kg. 1.2.4 观察与测量定期观察裸鼠的精神饮食及排便情况. 4 wk后处死裸鼠. 测量裸鼠移植瘤的体积和瘤质量. 肿瘤体积质量的测定. 用瑞士 WHB游标卡尺测量肿瘤最长径（a）和垂直方向最大横径（b） ，按公式V（mm3）=ab2/2，计算肿瘤体积. 取瘤称质量, 计算抑瘤率(%)=（对照组瘤质量-实验组瘤质量）/对照组瘤质量100%. 1.2.5 裸鼠移植瘤中 TRAIL的表达将对照组和实验组取下的瘤体经40 g/L多聚甲醛
16、固定梯度乙醇脱水及石蜡包埋，进行连续切片，厚度 4 m，按实验 SABC免疫组化法检测移植瘤中的 TRAIL的表达用 PBS代替一抗作为染色的阴性对照，用已知的阳性乳腺癌切片为阳性对照. 一抗TRAIL作用浓度 1400. 统计学处理：采用 SPSS10.0软件分析, 实验所得数据,计量资料数据用 xs表示,各组间差异比较采用方差分析;计数资料用 2 检验,P0.05认为有统计学意义. 2 结果 2.1 免疫荧光 TRAIL的表达情况以 hTERTTRAIL 转染的肿瘤细胞的细胞质中可见到特异性 GFP绿色荧光蛋白的表达，说明肿瘤细胞有转录活性(图 1). 载体转染成功. 转染组的 TRAIL
17、表达率为 0.5710.008,对照组为 0.1660.03,差异有统计学意义(P0.01). 2.2 成瘤率及肿瘤重量的抑制率、肿瘤终体积和质量各组组平均肿瘤终体积质量如下表所示. 统计学分析表明，各组肿瘤终体积和质量均明显小于对照，有统计学意义(F=62.712,88.287, P0.01，表 1). 在接种第 57日全部长出肿瘤小结节，结节出现的时间差异无显著性意义(P0. 05). 转染真核表达 hTERTTRAIL 组细胞与对照组未转染的 HeLa细胞在裸鼠体内瘤质量分别为(0.3990.012)和( 0.7010. 057) g 两者相比有显著差异(P0.05)；转染 hTERTT
18、RAIL 细胞在裸鼠体内所成肿瘤生长较慢, 4 wk后肿瘤质量抑制率为 43.08%,联合放化疗后肿瘤质量抑制率为 61.63%，有统计学意义(P0.01). 图 1转染 hTERTpromoterpIRES2EGFP_TRAIL 的肿瘤细胞中的TRAIL表达情况200（略） 表 1裸鼠皮下成瘤试验肿瘤的质量和体积（略） bP0.01 vs 对照. 2.3 裸鼠宫颈癌移植瘤的 TRAIL表达情况裸鼠宫颈癌移植瘤组织中均有 TRAIL的表达，转染真核表达 hTERTTRAIL 组裸鼠宫颈癌移植瘤组织中 TRAIL的阳性表达率为 50.7%,高于对照组的 21.2%,差异有统计学意义(2=5.83
19、, P0.05，图 2) . 图 2裸鼠宫颈癌移植瘤中 TRAIL的表达情况200（略） 3 讨论 子宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一. 由于近年来年轻患者和腺癌比率的增加3 ，宫颈癌的防治面临着新的挑战. 为此，人们致力于探索提高宫颈癌治疗效果的方法. Kuzuya4报道以顺铂为基础的联合化疗方案治疗宫颈癌在行手术可提高五年生存率. 同时以顺铂作为放疗增敏剂的研究，认为顺铂可通过使肿瘤细胞在 G/S期同步化、抑制放射损伤细胞的修复能力等方式增加了肿瘤细胞的对放疗的敏感性. 同时，辐射可提高细胞膜的通透性，增加对铂类的摄入，从而增加顺铂的毒性作用，提高化疗效果. 放疗化疗药物联合应用治疗复发性
20、宫颈癌取得了一定的疗效和进展5. hTERT 人端粒酶的限速酶，是肿瘤细胞的特异性启动子，可在转录水平调控目的基因的表达确保对肿瘤细胞的杀伤作用1. 宋悦等6研究结果显示，在端粒酶阳性的宫颈癌细胞系及永生化的 HEK293细胞中，hTERTmRNA表达阳性并且 hTERT启动子被激活. 而 TRAIL是 TNF超家族成员，因其具有的特异性的诱导肿瘤源性和转化细胞,不诱导正常细胞的凋亡7 ，已成为基因治疗的热点. 本实验结合了 hTERT启动子的肿瘤靶向和 TRAIL选择性杀伤肿瘤细胞的效应，联合放化疗来研究对 HeLa裸鼠移植瘤的作用. 实验表明，将hTERT TRAIL 稳定转染的肿瘤细胞的
21、裸鼠宫颈癌瘤组织中 TRAIL呈阳性表达，在肿瘤细胞的浆膜均有黄褐色沉着,与对照组相比，有统计学意义（P0.01）. 实验观察了顺铂联合放疗对裸鼠宫颈癌瘤组织有明显的抑制作用. 转染组肿瘤细胞于接种第 57日全部长出肿瘤结节,结节出现的时间差异无显著性意义(P0.05). 转染 hTERTTRAIL 组细胞与对照组 HeLa细胞在裸鼠体内的瘤质量分别为(0.3990.087)和( 0.7010. 057) g， 两者相比差异有统计学意义(P0.05) ；基因组、放疗组、化疗组及综合组瘤质量比较,有统计学意义 (F=11.018, P0.05). 说明放疗化疗对肿瘤细胞有明显抑制作用，两者具有协
22、同作用;hTERTTRAIL HeLa裸鼠移植瘤肿瘤生长缓慢, 4 wk后肿瘤质量抑瘤率为 43.08%,联合放化疗后肿瘤质量抑瘤率为 61.63%，两者相比有统计学意义(P0.01). 国外 Gliniak等8实验研究也显示，化疗药物喜树碱能增强 TRAIL引起的结肠肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长，延长裸鼠的生存期. 肿瘤综合治疗是当今肿瘤防治研究的热点, 特别是基因疗法和其他传统疗法联合治疗给肿瘤患者带来了希望9. 本实验利用 hTERT启动子构建 TRAIL表达载体用于基因治疗，并联合放化疗，避免损伤正常细胞，提高治疗的特异性方面有一定的作用,也为肿瘤的进一步实验研究奠定基础，为临床治疗
23、提供思路. 【参考文献】 1 Pitti R M, Marstemrs SA, Ruppert S, et al. Induction of apoptosis by Apo2 ligand, a new member of the tumor necrosis factor cytokine family J. J Biol Chem, 1996,271（8）:12687-12690. 2 Song K, Chen Y, Coke R, et al. Tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand ( TRAIL)is an inh
24、ibitor of autoimmune inflammation and cell cycle progressionJ. J Exp Med, 2000,191(3):1095-1104. 3 曹泽毅. 子宫颈癌治疗的变迁和思考J. 中华妇产科杂志,2004,39(3):212-215. 4 Kuzuya K. Chemoradiotherapy for unterine cancer: Current status and perspectivesJ. Int J Clin Oncol, 2004,9(6):458-470. 5 Fatehi D,Van der Zee J ,Van d
25、er Wal E, et al. Temperature data analysis for 22 patients with advanced cervical carcinoma treated in Rotterdam using radiotherapy, hyperthermia and chemotherapy: a reference point is neededJ. Int J Hyperthermia, 2006,22(4):353-363. 6 宋悦，孔北华，马道新，等. 宫颈癌及子宫内膜癌细胞系中启动子活性的研究J. 肿瘤防治杂志，2003,10(3),442-443.
26、 7 Kagawa S, He C, Gu J, et al. Antitumor activity and bystander effects of the tumor necrosis factorrelated apoptosis inducing ligand (TRAIL)geneJ. Cancer Res, 2001,61（8）:3330-3338. 8 Gliniak B, Le T. Tumor necrosis factorrelated apoptosis inducing ligands antitumor activity invivo is enhanced by the chemotherapeutic agent CPT11 J. Cancer Res, 1999,59（7）:6153- 6158. 9Choi CH, Kim TJ, Lee SJ, et al. Salvage chemotherapy with a combination of paclitaxel, ifosfamide, and cisplatin for the patients with recurrent carcinoma of the uterine cervixJ. Int J Gynecol Cancer, 2006,16(3):1157-1164.
