1、VEGF165 表达载体的构建及其对人胃癌生长的作用作者：刘都户，张学庸，黄裕新，樊代明 【关键词】 胃肿瘤 关键词: 胃肿瘤;血管内皮生长因子;基因转染 摘 要:目的 构建血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF 165 ）真核表达载体，研究其对胃癌生成的作用. 方法 用 DNA 重组方法，将编码 VEGF165 的全长 cDNA 克隆于 pcDNA3 载体中，构建 VEGF165 mRNA 真核表达载体;用阳性脂质体介导的基因转染技术，将重组体转入人胃癌细胞（SGC-7901）省系;观察转染细胞的细胞周期、增殖能力及致瘤生长情况等生物
2、学指标. 结果 斑点杂交、间接免疫荧光等分析显示，正义 VEGF 基因转染技术可使 VEGF 的表达得到明显地加强.与未转染细胞相比，转染细胞的 G2 /M 期细胞增加（0.44）而 S 期细胞减少（0.17） ，克隆形成率（9.0%）明显高于未转染细胞（4.0%）.瘤细胞接种裸鼠后33d，过表达 VEGF 人胃癌细胞所致的移植瘤体积（2351638）mm 3 明显大于未转染细胞所致的移植瘤体积（1534363）mm3 . 结论 VEGF 可以通过加强肿瘤组织血管生成而促进肿瘤的生长，另外，VEGF 的表达可能与细胞增殖能力有关. Keywords:stomach neoplasms;vasc
3、ular endothelial growth factor;gene transfection Abstract:AIM To construct a eukaryotic expression vector of VEGF165 （vascular endothelial growth factor）gene，and to more directly establish the role of VEGF in the oncogenesis of human gastric carcinoma.METHODS VEGF165 sense RNA expression vector was
4、constructed by inserting the VEGF165 cDNA into SGC-7901cells by lipofect technique.Then the cell cycle，proliferative ability in vitro and growth in nude mice of transfected cells were examined.RESULTS Introduction of the VEGF sense construct into SGC-7901cells resulted in a marked increase in the ex
5、pression of VEGF-specific mRNA and protein by dot blot and im-munofluorescence staining analysis in transfected tumor cells.Cell cycle analysis showed that，compared with the parental cells the number of transfected cells had an increase（0.44）in G2 phase and a decrease（0.17）in S phase，and its colony
6、forming rate（9.0%）was higher than that of the control cells（4.0%）;The volume of tumor（2351638）mm3 in the nude mice inoculated with the cells transfected by VEGF165 expres-sion vector greatly increased in comparison with that（1534363）mm3 in nude mice inoculated with SGC-7901cells.CONCLUSION As starti
7、ng angiogenesis，VEGF might pro-mote the growth of solid tumor;in addition，it might corre-late with the proliferation of tumor cell. 0 引言 目前的研究已经表明，血管生成是恶性肿瘤迅速增殖并转移扩散的主要条件之一1 .随着人们对血管生成诱导剂的深入研究，已发现有许多生长因子，如转化生长因子刺激新生血管形成的作用是通过全部或部分诱导血管内皮生长因子（VEGF）表达而实现的.VEGF 是一类特异性血管内皮刺激因子，它高效特异地作用于血管内皮细胞，对其有强烈的促分裂作用
8、和趋化作用2-4 :增强微血管通透性，促进血浆纤维蛋白外渗，为血管形成过程中多种细胞迁移提供一个纤维网络;通过与内皮细胞上两个特殊受体 flt 和 flk（KDR）作用，直接刺激内皮细胞增殖，并产生纤维蛋白溶酶原激活剂和胶原酶，这不仅可促进内皮细胞移动，有利于血管生成，而且还有利于癌细胞脱落进入血管或向邻近纤维蛋白和结缔组织基质扩散，此方式为肿瘤的浸润、转移创造条件5，6 .另有实验表明，胃癌组织高水平表达 VEGF，其表达量与肿瘤的恶性程度呈正相关7 .我们通过基因转染技术使胃癌细胞过表达 VEGF，更直接地研究 VEGF 对肿瘤生长的影响. 1 材料和方法 1.1 材料 限制性核酸内切酶、
9、T4 DNA 连接酶、Taq DNA 聚合酶、无 DNA 酶的Rnase 购自 Promega 公司，Lipofect Amine 由 Gibco 公司提供，G418 由Sigma 公司提供，RNA 地高辛标记试剂盒（SP6/T7）购自 Boehringer Mannheim 公司，FITC 标记的羊抗兔 IgG 由 Vector 公司提供.人胃癌细胞系 SGC-7901、宿主菌 E.coli DH5 和 JM109 均为本校西京医院全军消化性疾病研究所保存.含有 605bp 的人 VEGF165 cDNA 基因被克隆在 pGEM-3Zf（+）的 BamHI 位点质粒 pGEM-hVEGF 由
10、美国加利福尼亚大学医学院癌症研究所 Abraham 教授惠赠;pcDNA3 真核表达载体由本校生物化学教研室柴玉波博士惠赠.BALB/c 裸小鼠由本校实验动物中心提供并饲养. 1.2 方法 1.2.1 VEGF165 真核表达载体的构建、鉴定、扩增及纯化 采用小量酶切反应法，应用 BamHI，EcoRI+HindIII，EcoRI，PstI分别对 pGEM-hVEGF 进行初步酶切鉴定，并对其进行 T7 测序.根据 pGEM-3Zf（+）及 pcDNA3 图谱确定克隆策略.用 EcoRI+XbaI 消化 pGEM-hVEGF后得到 VEGF 的 cDNA 可正向克隆于由此两种酶消化后的 pcD
11、NA3 中.连接产物转化大肠杆菌进行扩增.挑单一菌落，以碱裂解法小量提取质粒，对其进行酶切鉴定，然后对阳性重组子进行大量质粒提取，并纯化再进行酶切鉴定. 1.2.2 VEG 165 基因转染及转染细胞的鉴定 将 SGC-7901 细胞以 1107 L-1 的密度接种于 24 孔培养板，待细胞贴壁后，加入不同浓度的 G418，G418 抗性克隆的筛选浓度为 14d 内杀死 SGC-7901 的最低浓度.按 5105 细胞/孔的量在 6 孔板中接种指数期生长的细胞，在 37，50mL L-1 CO2 孵箱中培养过夜，直到细胞 50%汇片.用无血清 RPMI1640 培养液洗涤细胞 1 次，然后将
12、DNA/Liposome 复合物及无血清 RPMI1640 液加入转染细胞孔中.孵育 5h 后，加入含 200mL L-1 小牛血清的完全 RPMI1640 培养液，培养 48h 后，将其传代于 G418 选择培养液，选择 G418 抗性克隆细胞并扩增培养，待进一步鉴定. VEGF RNA 检测探针的制备，带有 hVEGF165 的质粒，经合适的核酸内切酶酶切后，对待转录的线性 DNA 质粒进行体外转录，加入 Dig 标记用的 NTP 混合底物，即可以 T7RNA 聚合酶转录出反义 VEGF RNA，用以检测正义 RNA表达;RNA 斑点杂交，用异硫氰酸胍一步法提取细胞总 RNA，变性后，将其
13、点样于 NC 膜上，干燥后，80烘烤 2h，6SSC 浸湿，65水浴 3h进行预杂交.加入地高辛标记的 VEGF RNA 探针，60水浴 18h 进行杂交.然后用 SSC 洗膜、加封闭液，加碱性磷酸酶标记的抗 Dig 抗体检测，NBT/BCIP 呈色. 1.2.3 细胞生长试验 集落形成试验:将对数生长期的细胞作梯度倍数稀释，接种于含10mL 预温 37培养液的培养皿中，轻轻晃动使细胞分散均匀.培养 2wk左右，当出现肉眼可见的克隆时，终止培养，甲醇固定，姬姆萨染色，克隆计数，计算克隆形成率.细胞周期测定:分别取对数生长期的转染细胞 5105 ，PBS 洗后加入 700mL L-1 乙醇固定，
14、加 PI 染料，4放置30min，进行 FCM 分析.流式细胞仪免疫荧光测定:将室温固定的细胞离心后，重新悬浮于染色液（PBS+1g L-1 Triton-X-100+100mL L-1 羊血清）中，封闭 1h 后，分别加入第一抗体及正常兔 IgG，室温孵育60min，加入 FITC 标记的羊抗兔 IgG.30min 后，用 PBS 洗涤细胞，进行流式细胞仪检测.裸鼠移植瘤生长:经 G418 筛选的转染细胞，扩大培养后，分别以 1.4106 个细胞接种于 BALB/c 裸小鼠右大腿背侧皮下.测量肿瘤最大直径和横径.肿瘤体积为 V=1/2（db2 ） 8 .对不同数据采用相应的分析方法进行统计学
15、处理. 2 结果 2.1 pGEMhVEGF165 的鉴定 用限制性内切酶 EcoRI 和 HindIII 对 pGEM-hVEGF165 进行酶切，电泳后得到 640bp 片段.测序结果发现 VEGF165 cD-NA 正向克隆于 T7 启动子的下游，序列完全正确.用计算机基因酶谱分析软件对 hVEGF cDNA 进行分析，其上不含 EcoRI，HindIII，XbaI 等限制性内切酶位点. 2.2 hVEGF165 真核表达载体的鉴定 对 VEGF165 cDNA 正向插入 pcDNA3 构建的重组质粒，分别以EcoRI，XbaI，EcoRI+XbaI 酶切后电泳，电泳相应片段大小与图谱序
16、列大小一致.然后再用 EcoRI+HindIII 对其进行双酶切，未发现含有目的基因的相应大小片段. 2.3 目的基因导入人胃癌细胞的证据 G418 抗性筛选:G418 筛选浓度为 350g mL-1 .与未转染的 SGC-7901 细胞相比，10d 后可见转染 pcDNA3 空载体对照组、pcDNA-hVEGF 实验组的细胞继续生长，而 SGC-7901 细胞大部分死亡，14d 后全部死亡，G418 抗性克隆（Fig1）.经 G418 筛选 2mo 后，转染细胞仍继续生长;核酸分子杂交:应用 VEGF 反义 RNA 单链探针进行杂交时，各组细胞中的 RNA均出现杂交信号，但其中转染 pcDN
17、A-hVEGF 的细胞（SGC-hVEGF）中的杂交信号明显增强（Fig2）;流式细胞仪测定细胞内 VEGF 免疫荧光染色:用 FCM 测定经 FITC 染色后的细胞荧光强度和阳性细胞数，间接反映细胞为 VEGF 含量变化.当阴性对照组细胞（一抗为正常兔 IgG）的荧光强度为1.8%时，SGC-7901 细胞为 31.6%，SGC/hVEGF 为 75.4%. 2.4 细胞生长试验 集落形成试验:当平板培养 14d 时，终止培养，并计算克隆数.SGC-hVEGF 的 克隆形成率为 9.0%，SGC-pcDNA 为 4.8%，SGC-7901 为4.0%;转染细胞的细胞周期分布:SGC-hVEG
18、F 细胞与 SGC-7901 未转染细胞相比，G2 /M 期细胞增加了 0.44，而 S 期细胞减少了 0.17，G0 /G1 期细胞无明显变化（Tab1）;VEGF 对胃癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响:实验分 2 组，SGC-hVEGF 细胞接种的转染实验组和 SGC-7901 细胞接种的对照组，每组 5 只裸鼠.裸鼠在细胞接种后 6d 可见肿瘤长出，8d 始测量肿瘤大小.结果可以看出，接种后 8d 时，各组间的肿瘤大小无差别.从 13d开始，VEGF 转染细胞所致的实体肿瘤生长速度增快（Tab2） ，肿瘤倍增时间缩短.33d 时处死动物，取肿瘤组织进行组织学检查，与 SGC-7901 细胞组相
19、比，转染 VEGF 细胞组的肿瘤组织切片可见血管丰富，细胞增生活跃，少见有组织缺血坏死现象.表 1 转染细胞周期分布（略）表 2 裸鼠移植瘤体积（略） 3 讨论 肿瘤在直径 2mm 时，肿瘤细胞通过弥散作用吸取营养，当肿瘤进一步长大时，必须依赖新生的毛细血管提供充足的血液，因此，肿瘤细胞诱发血管生成因子，作用于内皮细胞，促进血管形成9 .胃癌的生长依赖于血管生成，而且肿瘤组织前缘 VEGF 表达较其他部位明显，微血管密度较高，血管生成活跃，说明 VEGF 表达与血管生成部位是一致的，它有助于胃癌细胞的增殖，有利于胃癌的生长10，11 .我们构建了hVEGF165 真核表达载体，通过基因转染技术
20、，使人胃癌细胞过表达VEGF，从而以更直接的实验方法研究了 VEGF 对肿瘤发生、进展的作用.Tischer 等12 首先对人 VEGF 基因的结构进行了分析研究，并完成了人 VEGF165 的 cDNA 克隆，包括信号肽全长约为 600bp.他们并将 VEGF165 基因重组在 pGEM-3Zf（+）载体的 BamHI 位点.我们用限制性内切酶分析其正确性，并对其进行了 DNA 测序分析，进一步确定了其可靠性及质量.根据实验目的，我们成功构建了 VEGF165 真核表达载体.克隆了一个基因之后，许多研究者希望将其导入各种类型细胞中，对其特征加以分析.而这一目标的实现需要将目的 DNA 有效地
21、导入表达细胞.本实验转染宿主细胞为人胃癌细胞 SGC-7901，目的是增强 VEGF 的表达，以观察其对人胃癌生成的生物学作用.哺乳动物细胞表达的蛋白质在翻译后被加工的机会较多（如糖基化） ，可提高产物正确构型的机率;另外，哺乳动物细胞易被重组 DNA 质粒转染，具有遗传稳定性和可重复性;再者，经转化的哺乳动物可将表达的产物分泌到细胞外，这些都为本实验目的的实现提供了便利.我们通过 lipofect amine 介导 pcDNA-hVEGF 进入人胃癌细胞 SGC-7901，G418 筛选及 RNA 斑点杂交试验等均证明质粒 DNA 稳定地整合进细胞基因组中. 集落形成及细胞周期测定实验均提示
22、，VEGF 的表达与肿瘤细胞的增殖能力可能有关.SGC-hVEGF 的集落形成率比 SGC-7901 高;与亲本细胞相比，转染细胞的 G2 /M 期细胞增加了 0.44，而 S 期则减少了 0.17.关于这点，Mischak 等13 对过表达 VEGF 的 NIH3T3 细胞的增殖能力研究及 Guerrin 等14 对过表达 VEGF 的鼠 RPE 细胞体外生长特性的研究也有提示，但关于其机制还有待于进一步研究.通过对高表达和低表达VEGF 人胃癌细胞裸鼠移植瘤生长的研究，发现高表达 VEGF 者，肿瘤生长速度快;而低表达者，肿瘤生长速度慢;但在致瘤率、出瘤时间及初始成瘤阶段肿瘤大小等方面并无
23、明显差别，说明在实体肿瘤的血管期，VEGF对胃癌的生长有明显的促进作用.由于不论是在组织水平，还是细胞水平，均发现胃癌有明显的异质性10 ，这使得人们在寻找肿瘤治疗新靶点方面产生了迫切性.结合本实验的结果，提示，针对 VEGF/VEGFR 的阻断措施在治疗胃癌领域可能会有广阔的前景. 参考文献: 1Strieter RM，Polverini PJ，kunkel SL，Arenberg DA，Burdick MD，Kasper J，Dzuiba J，Van Damme J，Walz A，Marriatt D.The functional role of the ELR motif in CXC
24、chemokine-mediat-ed angiogenesis J.J Biol Chem，1995;270（45）:27348-27357. 2Deng ZH，Huang WG，Jin Y，Qiu JH，Wang JL.Distribution and function of fibroblast growth factor family and vascular en- dothelial growth factor in laryngeal mucosa J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，1998;19（1）:70-7
25、2. 3Liu CL，Du KF，Li B.Expression and significance of vascular endothelial growth factor and its receptors in hepatocellular car-cinoma cell lines J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，2000;21（6）:770-772. 4Deng ZH，Huang WG，Jin Y，Qiu JH，Wang JL，Wang JB，Jipoe GL.Relationship of apoptosis and angiogenesis and the carcinogenesis of laryngeal mucoma J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，1999;20（1）:17-20.
